Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ruột gà nuôi tự nhiên ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn nuôi gà công nghiệp

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGƠ CHÍ CƠNG TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CĨ ĐẶC TÍNH PROBIOTICS TỪ RUỘT GÀ NI TỰ NHIÊN ỨNG DỤNG TẠO CHẾ PHẨM BỔ SUNG THỨC ĂN GÀ NUÔI CÔNG NGHIỆP Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã Chuyên Ngành: 60540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 1-i Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Ngọc Nam Người phản biện 1: Người phản biện 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: - Chủ tịch Hội đồng - Phản biện - Phản biện - Ủy viên - Thư ký CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA………… 1-ii BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGƠ CHÍ CƠNG………………… MSHV: 16002161 Ngày, tháng, năm sinh: 20/08/1992 Nơisinh: Bình Định Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm .Mã chuyên ngành: 60540101 I TÊN ĐỀ TÀI: Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ṛt gà nuôi tự nhiên ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn gà nuôi công nghiệp NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ṛt gà ni tự nhiên ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi gà công nghiệp II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo định số 592/QĐ-ĐHCN việc giao đề tài cử người hướng dẫn luận văn thạc sĩ Hiệu trưởng trường Đại học Công Nghiệp TP HCM ngày 01 tháng 02 năm 2018 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/08/2018 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trịnh Ngọc Nam Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019 NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM 1-iii LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu, với giúp đỡ tận tình Thầy Cơ, gia đình nỗ lực bản thân, tơi hồn thành luận văn nghiên cứu Để đạt kết quả này, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến: Thầy Trịnh Ngọc Nam tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm vô quý báu tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Mặc dù, Thầy rất bận rộn với công việc giảng dạy theo dõi, hướng dẫn bảo giúp tơi hồn thành tốt thí nghiệm luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Viện công nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh cho tơi kiến thức q báu thời gian học tập trường Những kiến thức tích lũy từ giảng dạy tận tình quý Thầy Cô giúp rất nhiều trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Cổ phần Kỹ Thuật Sao Mai tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành tốt thí nghiệm Phịng nghiên cứu phát triển sản phẩm cơng ty Cuối lời tơi xin kính chúc q Thầy Cơ Ban lãnh đạo công ty dồi sức khỏe thành cơng c̣c sống! i TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Probiotic ứng dụng ngày rộng rãi ngành thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi Sử dụng probiotic một cách hợp lý giúp vật nuôi khỏe mạnh, tăng sức đề kháng, cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh, giúp chuyển đổi hệ số tiêu hóa thức ăn tốt giảm dần lượng thuốc, kháng sinh sử dụng, đặc biệt ngành chăn ni cơng nghiệp Nguồn vi sinh vật có đặc tính probiotic từ tự nhiên rất đa dạng phong phú đặc biệt đường ruột vật nuôi Mục tiêu nghiên cứu đề tài phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic từ ruột gà nuôi tự nhiên để ứng dụng tạo chế phẩm probiotic bổ sung thức ăn chăn nuôi gà công nghiệp Từ 50 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột gà, tiến hành khảo sát khả chịu pH acid, khả chịu muối mật, khả kháng lại vi sinh vật kiểm nghiệm, khả thích nghi với một số loại kháng sinh thông dụng chăn ni, khảo sát khả hình thành bào tử 60oC, khả bám dính vào niêm mạc đường ruột Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn C19, C31 C43 có đặc tính probiotic tốt: khả chịu pH 1.5 giờ, chịu nồng độ muối mật 1.5% 10 giờ, khả kháng lại vi sinh vật kiểm nghiệm Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus với đường kính vơ khuẩn từ – 14 mm, khả hình thành bào tử 60oC ≥ 80% hay khả chịu với enzyme pepsin, pancreatin 180 phút Tiến hành định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa vào vùng gen 16S rRNA xác định chủng Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus sp Chế phẩm probiotic chủng vi khuẩn tuyển chọn chất mang mantose dextrin bợt whey protein có mật độ 108 CFU/g cho thấy hiệu quả sinh trưởng gà nuôi công nghiệp Những kết quả nghiên cứu cho thấy khả ứng dụng vi khuẩn probiotic phân lập từ đường ruột vật nuôi chăn ni Từ khóa: probiotic, chế phẩm sinh học, Bacillus, gà nuôi công nghiệp, bào tử probiotic ii ABSTRACT Nowadays, probiotics are widely used in food products, pharmaceutical and considered as one of the main components of livestock industry These microorganisms have strong influence on animal health by improving food digestion, increasing immune system and acting against many pathogentic microorganisms Microbial sources with probiotic properties are abundant in nature, especially in livests gastrointestinal tract The aims of this study are evaluating the probiotic potential of 50 bacterium strains isolated from chichken intestine to produce probiotic preparation for use in the poultry industry Parameters consisted of the ability to acidic, heat and bile salt tolerance, produce spores, pathogen antagonistic activity, and ability to adhere to intestine Three strains, C19, C31 and C43, were selected with good probiotic characteristics such as tolerance to low pH 1.5 after hrs culture, tolerance to 1.5% bile salt after 10 hrs, resistance to gastrointestinal pathogens Salmonella sp., Escherichia coli, and Staphylococcus aureus with zone of inhibition diameter 9-14mm, resistance to gentamicin, amoxicillin, ampicillin, vancomicin, doxycicline antibiotics, and good adhesion ability on chicken intestinal epithelium Moreover, heat tolerance at 60oC for these strains were identified Using gene sequencing of 16S rRNA, C19, C31 and C43 were identified as strains Bacillus cereus, Bacillus megaterium, and Bacillus sp The probiotic products of the selected strains contain 108 CFU/g showed effective in the growth of industrial chicken Taken together, the results of this study showed the applicability of probiotic bacteria isolated from chicken gastrointestine for the poultry industry Keywords: probiotic, probiotics, Bacillus, the poultry industry, probiotic spores iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu bản thân tơi Các kết quả nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ bất kỳ một nguồn bất kỳ hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Học viên Ngơ Chí Cơng iv MỤC LỤC MỤC LỤC……………………………………………… …………………………v DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ix MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………… 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa đề tài TỔNG QUAN TÀI LIỆU Probiotic Định nghĩa ‘’Probiotic’’ Đặc điểm chung chủng vi sinh vật probiotic chủ Vai trò chế tác dụng chủng vi sinh vật probiotic vật ……………………………………………………………………………8 Vai trò chủng probiotic vật chủ Cơ chế tác dụng vi sinh vật probiotic vật chủ Nam Tình hình nguyên cứu ứng dụng probiotic giới Việt ………………………………………………………………………… 11 Thế giới 11 Việt Nam 12 Một số chủng vi sinh vật probiotic phổ biến 13 Lactobacillus sp 13 Bifidobacterium sp 15 Bacillus sp 16 Đặc điểm gà 19 Đặc điểm sinh trưởng gà 19 Đặc điểm hệ tiêu hóa gà 20 Đặc điểm hệ vi sinh vật đường ruột gà 22 Tổng quan chế phẩm probiotic 23 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 Vật liệu 25 v Đối tượng 25 Thiết bị, dụng cụ 25 Hóa chất, mơi trường 26 Phương pháp nguyên cứu 27 Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 28 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật Probiotic 28 Quan sát hình thái khuẩn lạc đặc trưng hình thái hiển vi chủng vi sinh vật………………… .………………………………………….28 Nḥm Gram chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic 29 Bảo quản lưu trữ chủng vi sinh vật probiotic 29 Khảo sát khả chịu pH dày 30 Khảo sát khả dung nạp muối mật 30 Phương pháp xác định khả kháng khuẩn sinh bacteriocin 31 Khảo sát khả chịu một số loại kháng sinh thông dụng chăn nuôi 32 Khả chịu enzyme dày đường ruột 33 probiotic Khảo sát khả hình thành bào tử chủng vi khuẩn …………………………………………………………………… 33 Xác định khả bám dính vào niêm mạc đường ruột 34 Định danh chủng vi khuẩn probiotic phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rRNA ………………………………………………………….35 Phương pháp phối trộn tạo chế phẩm probiotic 36 gà Phương pháp kiểm nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm probiotic ………………………………………………………………………… 36 Khả tăng trọng 38 Ngoại hình 38 Đánh giá mức độ nhiễm loại bệnh thông thường gà 38 Tỉ lệ chủng vi sinh vật gây hại phân gà 38 Phương pháp xử lý số liệu 38 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 Phân lập chủng vi sinh vật 39 Kết quả khảo sát khả chịu acid dày 47 Kết quả khảo sát khả chịu muối mật 55 Kết quả khảo sát khả đối kháng với vi sinh vật kiểm nghiệm khả sinh bacteriocin 60 vi Kết quả khảo sát khả chịu một số loại kháng sinh thông dụng chăn nuôi 63 Kết quả khảo sát khả hình thành bào tử chủng probiotic 67 Kết quả định danh chủng vi khuẩn probiotic 69 Kết quả khảo sát khả bám dính vào niêm mạc ṛt chủng vi khuẩn probiotic 77 Kết quả khảo sát khả chịu enzyme dày ruột 78 Kết quả phối trộn tạo chế phẩm probiotic từ chủng vi khuẩn probiotic phân lập 81 Kết quả kiểm nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm probiotic gà 82 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 Kết luận 88 Kiến nghị 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….90 PHỤ LỤC …………………………………………………………………… 95 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 107 vii 33 Koen Venema Probiotics and Prebiotics Current Research and Future Trends 2015 34 Masco L et al ''In vitro assessment of the gastrointestinal transit tolerance of taxonomic reference strains from human origin and probiotic product isolates of Bifidobacterium,'' University of Calgary, Canada, 2007, pp 3572–3578 35 Đào Thị Thanh Xuân ''Nghiên cứu sử dụng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí mơi trường nước nuôi thủy sản,'' Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 2008, tr 15-27, 32-35, 47-53 36 G DARLAND ''Bacillus acidocaldarius sp., an Acidophilic Thermophilic Spore-forming Bacterium,'' Department of Microbiology, Indiana University, Bloomington, Indiana , U.S.A, 1971, pp 47-401 37 Xuan Yi ''Studies of the Commitment Step in the Germination of Spores of Bacillus Species,'' Journal Of Bacteriology No 12, pp 3424–3433, 2010 38 Peter Setlow Spore germination Department of Biochemistry University of Connecticut Health Center, 2003 39 Nguyễn Quốc An ''Chăn nuôi gia cầm.'' Available from: https://sites.google.com/site/channuoigiacam/giai-phau-va-sinhly/he-tieu-hoa, June, 2005 40 Jans D Probiotics in animal nutrition Engineering Education, 2005, pp 4- 18 41 M.S Shin et al ''Isolation and characterization of bacteriocin-producing bacteria from the gastrointestinal tract of broiler chickens for probiotic use,'' Journal of Applied Microbiology No 20, pp 30, 2008 42 Vlkova E et al ''Distribution of bifidobacteria in the gastrointestinal tract of calves,'' Folia microbiologica No 51, pp 325-328, 2006 93 43 Charteris et al ''Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Lactobacillus species,'' Journal of Food Protection 1998, pp 1636–1643 44 Stavros Plessas ''Isolation, characterization and evaluation of the probiotic potential of a novel Lactobacillus strain isolated from Feta-type cheese,'' Food Chemistry 2017, pp 96 45 Peter Setlow ''Biochemical Studies of Bacterial Sporulation and Germination,'' The Journal Of Biological Chemistry Pp 3637-3644, 1970 46 Nguyễn Văn Thanh Trần Thu Hoa ''Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật KS một số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống,'' Tạp chí dược học Số 378, 2007 47 Gabriella Casula and Simon Cutting Bacillus Probiotics: Spore Germination in the Gastrointestinal Tract Appl Environ Microbiol, 2002 48 Nguyễn Ngọc Xuân Dung ''Ảnh Hưởng Các Yếu Tố Môi Trường Chuồng Nuôi Lên Sinh Trưởng Của Gà Thịt,'' Tạp chí khoa học Số 9, Trường Đại học Cần Thơ, 2016 94 PHỤ LỤC Phụ lục 1: công thức môi trường Công thức môi trường DSM - Bacto 8g - KCl 10%(w/v) 10ml - MgSO4.7H2O 1.2%(w/v) - Ca(NO3)2 1M 1ml - MnCl2 0.01M 1ml - FeSO4 1mM 1ml - PpH 7.6 - H2 O 1000ml Công thức môi trường dung dịch đệm PBS (10X) - NaCl 800g - KCl 20g - Na2HPO4.2H2O - KH2PO4 24g - Nước cất 8000ml Công thức môi trường MRS - Peptone 10g - Cao thịt 8g - Yeast extract - Glucose 20g - K2HPO4 2g 10ml 144g 4g 95 - CaCO3 5g - CH3COONa 5g - MgSO4.7H2O 0.58g - MnSO4.4H2O 0.28g - Tween 80 1ml - pH - Nước cất 1000ml Công thức môi trường Peptone-Cao thịt - Peptone 10g - Cao thịt 5g - NaCl 4g - Nước cất 1000ml Công thức môi trường LB - Peptone - Yeast extract - NaCl 10g - Nước cất 1000ml 10g 5g 96 Phụ lục 2: Hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn phân lập C43 C38 C19 C47 C2 C13 97 C50 C14 C11 C42 98 Phụ lục 3: Hình thái tế bào số chủng vi khuẩn phân lập C1 C2 C4 C5 C6 C7 99 C8 C9 C11 C13 C14 C17 100 C19 C21 C24 C25 C26 C28 101 C29 C33 C36 C40 C42 C45 102 C49 C50 C12 C23 103 Phụ lục 4: biểu đồ thể mối tương quan yếu tố thí nghiệm giá trị OD nm 612 0.2 0.2 0.2 0.1 pH 1.5 0.1 pH 0.1 0.1 pH 2.5 0.1 pH 0.0 pH 0.0 0.0 C9 C13 C17 C19 C28 C31 C36 C38 C42 C43 C45 C47 4.1 Biểu đồ thể giá trị OD612nm chủng vi khuẩn thời gian nồng độ pH khác giá trị OD 612nm 0.4 0.4 0.3 pH 1.5 0.3 pH 0.2 pH 2.5 0.2 pH 0.1 pH 0.1 0.0 C9 C13 C17 C19 C28 C31 C36 C38 C42 C43 C45 C47 4.2 Biểu đồ thể giá trị OD612nm chủng vi khuẩn thời gian nồng độ pH khác 104 giá trị OD 612nm 7000 6000 5000 1.50 % 4000 1.00 % 3000 0.50 % 2000 0.30 % 1000 0.00 % 0000 C9 C13 C17 C19 C28 C31 C38 C42 C43 C45 C47 Nồng độ muối mật 4.3 Biểu đồ thể giá trị OD612 nm chủng vi khuẩn thời gian nồng độ muối mật khác giá trị OD 612 nm 7000 6000 5000 1.50% 4000 1.00% 3000 0.50% 0.30% 2000 0.00% 1000 0000 C9 C13 C17 C19 C28 C31 C38 C42 C43 C45 C47 nồng độ muối mật 4.4 Biểu đồ thể giá trị OD612 nm chủng vi khuẩn thời gian nồng độ muối mật khác 105 Mật độ CFU/ml Log10 Enzyme Pepsin 9.0000 8.0000 7.0000 6.0000 5.0000 C19 4.0000 C31 3.0000 C43 2.0000 C47 1.0000 0.0000 30 60 90 120 150 180 Thời gian (phút) 4.5 Biểu đồ thể mức độ ảnh hưởng enzyme pepsin chủng vi khuẩn thời gian 180 phút Enzyme Pacreatin Mật độ CFU/ml Log10 9.5 9.0 8.5 C19 C31 8.0 C43 C47 7.5 7.0 30 60 90 120 150 180 Thời gian (phút) 4.6 Biểu đồ thể mức độ ảnh hưởng enzyme pancreatin chủng vi khuẩn thời gian 180 phút 106 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC: Họ tên: Ngơ Chí Cơng Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 20/08/1992 Nơi sinh: Bình Định Email: congngo.208@gmail.com Điện thoại : 0901379018 II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO: Từ 2010 – 2014: học Đại học Công Nghệ Sinh Học – trường Đại học Công nghiệp TP HCM – 12 Nguyễn Văn Bảo, Phường 4, quận Gò Vấp, TP HCM Từ 2016 – nay: học Cao học Ngành Công Nghệ Thực Phẩm – trường Đại học Công nghiệp TP HCM – 12 Nguyễn Văn Bảo, Phường 4, quận Gò Vấp, TP HCM Tp HCM, ngày tháng Năm 20 Người khai (Ký tên) 107 ... TÀI: Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ṛt gà ni tự nhiên ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn gà nuôi công nghiệp NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc. .. tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic từ ṛt gà ni tự nhiên để ứng dụng tạo chế phẩm probiotic bổ sung thức ăn chăn nuôi gà công nghiệp Từ 50 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột gà, tiến... probiotics từ ruột gà ni tự nhiên nhằm ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn gà nuôi công nghiệp. ” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Tuyển chọn chủng vi khuẩn probiotic có đặc tính từ hệ vi sinh