Phân lập và tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt tính protease cao trong sản xuất xì dầu an toàn về 3 mcpd và aflatoxin

NUON VORNG Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO TRƯờNG ĐạI HọC BáCH KHOA Hà NộI LUậN VĂN THạC Sỹ KHOA HọC * CHUYÊN NGàNH: CÔNG NGHệ SINH HọC NGNH : CễNG NGH SINH HC PHÂN LậP Và TUYểN CHọN CHủNG NấM SợI Có HOạT TíNH PROTEASE CAO TRONG SảN XUấT Xì DầU AN TOàN Về 3-MCPD Và AFLATOXIN * KHỐ: 2006-2008 Hµ Néi 2008 NUON VORNG Hµ NéI, 2008 Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO TRƯờNG ĐạI HọC BáCH KHOA Hà NộI LUậN VĂN THạC Sỹ KHOA HọC PHÂN LậP Và TUYểN CHọN CHủNG NấM SợI Có HOạT TíNH PROTEASE CAO TRONG SảN XUấT Xì DầU AN TOàN Về 3-MCPD Và AFLATOXIN CHUYÊN NGàNH: CÔNG NGHệ SINH HọC M· Sè:………… NUON VORNG Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS.TS NGUYễN VĂN CáCH Hà NộI, 2008 LI CM N Trong thời gian nghiên cứu đề tài phịng thí nghiệm “ Phòng vi sinh kỹ thuật di truyền” phịng thí nghiệm khác thuộc Viện Cơng Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, tơi ln hướng dẫn tận tình, giúp đỡ mệt mỏi, sẵn sàng tạo điều kiện thuận lợi trình nghiên cứu thầy giáo hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Cách Tôi xin trần trọng cảm ơn thầy giáo Phịng vi sinh kỹ thuật di truyền góp ý kiến q báu đóng góp suốt q trình thực đề tài, cô giáo: TS Trần Liên Hà Tơi xin cảm ơn đến bạn phịng thí nghiệm “Phịng vi sinh kỹ thuật di truyền” với hỗ trợ trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô giáo Viện Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm dạy bảo kiến thức khoa học đại mà dạy bảo kiến thức đời sống hàng ngày từ chương trình đại học tới cao học Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đề tài khách quan, chân thực thực từ đầu đến cuối Vì vốn kiến thức cịn hạn chế, thời gian nghiên cứu ngắn nên luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi thực mong nhận đóng góp thầy giáo độc giả Một lần xin cảm ơn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thầy: PGS TS Nguyễn Văn Cách Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2008 Nuon Vorng LỜI MỞ ĐẦU Từ lâu đời, người biết sản xuất tương theo truyền thống sử dụng rộng rãi nước giới, châu Á sử dụng loại tương nhiều Việt Nam, Campuchia, Nhật Bản, Indonesia, Malaysia, Trung Quốc Họ làm tương theo truyền thống nước họ theo gia truyền làng sản xuất Tương Bần (Hưng Yên), Tương Nam Đàn (Nghệ An) Tương Cự Đà (Hà Tây), họ sử dụng hệ vi sinh vật vốn có nơi sản xuất tự nhiên chưa khiết, lên men theo điều kiện địa phương sản xuất khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm sản xuât theo phương pháp thủ cơng chưa đạt hiệu cao mặt kinh tế mặt kỹ thuật Hiện có hai hướng để sản xuất tương sản xuất theo phương pháp axit sản xuất theo phương pháp lên men cách sử dụng vi sinh vật sản xuất theo phương pháp axít gây phản ứng phụ tạo chất 3-MCPD (3 monochloropropane 1,2 diol) tiền chất gây bệnh ung thư Sử dụng phương pháp axít có lợi thời gian sản xuất nhanh nhiều với phương pháp lên men số sở sản xuất tương lợi dụng cách sản xuất theo phương pháp axít để đạt hiệu cao mặt kinh tế không nghĩ đến sức khoẻ cộng đầu độc người tiêu dùng dần gây hiệu nghiêm trọng sau Nước tương (xì dầu) loại loại ăn phổ biến này, có gia trị dinh dưỡng nhiều protein đạm, đường, chất béo, vitamin, khoáng Song với giá trị dinh dưỡng phải quan tâm đến việc dư chất 3-MCPD nước tương thành phẩm Vì chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: "Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt lực Protease cao sản xuất xì dầu an tồn chất 3-MCPD Aflatoxin" Mục đích nghiên cứu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt lực Protease cao để áp dụng trình lên men làm xì dầu đạt chuẩn yêu cầu 3-MCPD Cải tiến qui trình sản xuất xì dầu truyền thống để hiệu cao kinh tế kỹ thuật để cạnh tranh thị trường cung cấp dinh dưỡng cho cộng đồng, loại thực phẩm an tồn sản xuất theo qui trình cải tiến Nội dung nghiên cứu Phân lập tuyển chọn lấy chủng có hoạt lực Protease cao để thuỷ phân Protein đậu tương trình lên men sản xuất xì dầu Tối ưu điều kiện ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến q trình sinh sản nấm sợi Nghiên cứu qui trình cơng nghệ sản xuất xì dầu để đạt hiệu cao mặt kinh tế kỹ thuật Hạn chế tạo thành 3-MCPD để đạt chuẩn an toàn thực phẩm an toàn độc tố Aflatoxin TĨM TẮT Xì dầu (nước tương) ăn truyền thống giầu chất dinh dưỡng nhiều nước Châu Á, phổ biến khắp giới Quá trình sản xuất theo cách truyền thống chưa áp dụng nhiều tiến khoa học biến thức ăn nhiều dinh dưỡng thành liều chất độc mà khơng để ý đến Vì tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt lực Protease cao sản xuất xì dầu an tồn chất 3-MCD Aflatoxin ” Chúng phân lập chủng nấm sợi từ mẫu mốc xôi tương Bần (Hưng Yên) tương Nam Đàn (Nghệ An) hai sở sản xuất tương tiếng Việt Nam Từ 40 chủng nấm mốc phân lập từ mẫu mốc xôi tương Bần 40 chủng từ mốc xôi tương Nam Đàn, chúng tơi chọn chủng AB1có hoạt lực Protease cao cách đo vòng thuỷ phân Protease hộp thạch sữa với hiệu số vòng thuỷ phân vòng khuẩn lạc 10 mm ni vịng ngày máy lắc nhiệt độ 30oC Sau chọn chủng có hoạt lực Protease cao, bắt đầu tiến hành tối ưu điều kiện thích hợp mơi trường Czapek Nguồn carbon thích hợp Saccharose với hàm lượng 50g/l mơi trường Czapek, nguồn Nitơ (NH4)2SO4 = 3g/l, nhiệt độ 50oC pH = Với môi trường tối ưu trên, rang đậu tương với nhiệt độ khoảng từ 180 đến 200oC tiến hành lên men tương với thời gian ngậm đậu tương ngày, sau ngả tương ủ thời gian 15 ngày Kết thu hàm lượng Protein 91 g/l, hàm lượng Nitơ Formol 4,4 g/l, Hàm lượng Nitơ axit amin 0,15 g/l hàm lượng Axit axetic 4,61 g/l SUMMARY Soy sauce is a traditional rich nutrient food of many Asian countries, and known across the world The traditional production process is lack of appliances of modern science, that process sometimes makes the rich nutrient food become toxins So we research the thesis: “The isolation and selection of molds with high activity of Protease to produce the soy sauce which is safety about 3-MCPD and AFLATOXIN” We isolate the strains from the boiled-sticky rice samples of the Bần Fermented Soy Production Base (in Hung Yen Province) and the Nam Dan Fermented Soy Production Base (in Nghe An Province), two of the most famous production bases in Vietnam 40 isolated strains from Bần sample and 40 isolated strains from Nam Dan sample, we select one strain, AB1, that has the highest activity of Protease by comparing the hydrolysis circle and the circle of the mold community on surface the agar agar-milked Petry box, the difference is 10 mm for days in the shaking incubator with temperature of 30oC After we selected the strain, we optimize conditions of the Czapek culture for AB1 to get high activity of extra cellular Protease The optimal Carbon source is the Saccharose with the amount of 50g/l, the optimal Nitrogen source is the (NH4)2SO4 with the amount of 3g/l, the optimal temperature is 50oC, and the optimal pH is With the optimal conditions, we roast soy bean at temperature among 180 to 200 C, and we soak the roasted soy bean for days, after that we mix the soaked soy bean with the boiled sticky rice which we grew the molds on, and ferment in 15 days The result of analysis of some figures such as the amount of Protein is 91 g/l, Formol nitrogen is 4,4 g/l, Amino Acid Nitrogen is 0,15 g/l and the amount of Acetic acid is 4,61 g/l o PHẦN I TỔNG QUAN VỀ XÌ DẦU Từ lâu phương Tây người ta sử dụng men thu từ thực vật động vật để dùng sản xuất rượu bia, chế biến sữa, mát Còn phương Đông người ta thường dùng men thu từ vi sinh vật Đây phương hướng chủ yếu tiến Sản xuất tương nước chấm phương pháp lên men ví dụ minh chứng cho việc sử dụng men từ vi sinh vật sản xuất thực phẩm Những men có tác dụng chủ yếu trình men amylase protease nấm mốc hình thành, quan trọng nấm mốc Aspergillus oryzae Bản chất sinh hóa vi sinh vật chủ yếu trình sản xuất tương thuỷ phân Protein đậu tương thuỷ phân tinh bột Ngoài hoạt động số vi sinh vật sinh hương phản ứng hóa học thứ cấp, số chất có hương vị đặc biệt hình thành làm cho tương có hương vị riêng Trong sản xuất sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên có nhiều lồi vi khuẩn, nấm mốc nấm men khác mà trình trao đổi chất chúng hình thành sản phẩm có hướng vị khơng tốt, số chất kháng sinh, độc tố có hại cho thể Điều giải thích số người khơng thích tương Ngồi sử dụng vi sinh vật tự nhiên, cộng với trình sản xuất thủ công, làm cho sản xuất tương vốn khơng phải phức tạp mà lại có tính chất may rủi Q trình sản xuất tương chia làm giai đoạn: làm mốc tương, làm nước đậu ngả tương Trong trình ủ mốc tương thủ công, hoạt động amylase mốc thường đạt tới cực đại sau ngày, tiếp giảm dần Hoạt động Protease nấm mốc đạt tới cực đại sau ngày, giảm tương đối nhanh Hàm lượng đường khử đạt tới cực đại ngày thứ năm (26,2%) Như phương pháp ủ thủ công tự nhiên, nấm mốc phát triển chậm, mốc thích hợp để đem muối ngả tương vào khoảng 5-6 ngày sau ủ MỘT SỐ LOẠI TƯƠNG TRÊN THẾ GIỚI 1.1 1.1.1 Miso (Nhật Bản) [28] Hình 1.1 : Sản phẩm Miso Miso ăn cổ truyền phổ biến người Nhật Bản Người ta sử dụng Miso ăn điểm tâm cho trẻ em, dùng để nấu loại thịt, cá, sò, hến, rau, đồ làm loại súp Có loại Miso Miso gạo, Miso đại mạch Miso đậu tương Trong sản xuất Miso đậu tương, tác dụng enzymee nấm mốc vi sinh vật khác thành phần đậu tương trở nên dễ tiêu hóa 60% protein dạng hịa tan nước bao gồm polypeptide axit amin, 75% hợp chất carbon đường khử tạo cho Miso có vị Các chất ức chế trypsin hemaglutinin bị hoạt tính nấu nhiệt độ 100oC Miso có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Q trình sản xuất Miso bao gồm: - Việc làm nấu đậu tương - Chuẩn bị Koji - Trộn đậu tương, muối, koji giống - Lên men điều kiện yếm khí - Trộn bao gói sản phẩm Đậu tương làm sạch, rửa, ngâm qua đêm, đem nấu hoàn toàn mềm, làm nguội để đem trộn với thành phần khác Koji sản xuất từ gạo xay, ngâm nước lạnh (15oC) qua đêm, loại bỏ nước thừa, nấu áp lực 4060 phút, làm nguội đến 35oC, cấy giống Aspergillus oryzae (hoặc kết hợp Aspergillus sojae) với tỷ lệ 0,1%, đưa vào phịng ni koji Độ ẩm phịng ni 90%, có đủ oxy Sauk hi ni khoảng 40-48 giờ, koji lấy ra, làm lạnh đem trộn với muối, đậu tương nấm men (Sac Rouxii) Hỗn hợp sau trộn chuyển sang thùng gỗ bê tong để lên men Nhiệt độ lên men 30-38oC, thời gian lên men tuỳ loại Miso tháng (Miso vàng nhạt) tháng (Miso đỏ) Miso lên men để nấu tuần nhiệt độ thường, gói để tiêu thụ 1.1.2 Natto (Nhật Bản) [28] Hình 1.2: Sản phẩm Natto Natto theo tiếng Nhật có nghĩa đậu lên men Có hai loại Natto Natto sợi Natto muối Natto coi loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao nguồn bổ sung protein tốt cho người Vì có chất lượng dinh dưỡng cao nên Natto UNICEF đề nghị sử dụng làm bột UNICEF [28] Trong sản xuất Natto sợi: Người ta dùng chủng vi khuẩn khiết Bacillus natto.sawamura, để cấy vào đậu tương nguyên hạt (đậu tương làm sạch, rửa, ngâm hấp áp lực 1-1,5 kg/cm2 20-30 phút), để lên men từ 18-20 nhiệt độ 40-43oC, sau làm lạnh xuống 10oC tiêu thụ bảo quản nhiệt độ 2-7 oC bảo quản dạng Natto khơ Sản xuất Natto muối: Ngun liệu đậu tương, tiểu mạch muối ăn Đậu tương làm sạch, rửa, ngâm nước 20oC 3-4 giờ, để vài tiếng, 71 40 Michiel Korthals, Paul B Thomson, Food Biotechnology in Ethical Perspective, Second Edition, Springer Publisher 2007 41 More Authors, Encyclopedia of Physical Science and TechnologyBiotechnology Third Edition, David Pimentel, Cornell University 1997 42 Patricia L Traynor, Robert Frederick, Muffy Koch, Biosafety and Risk Assessment in Agricultural Biotechnology, Michigan State University, USA, The Board of Trustees, East Lansing 2002 43 Peter C Morris and James H Bryce, Cereal Biotechnology, Woodhead Publishing Limited, Cambridge England 2000 44 Reiner Westermeier, Tom Naven, Proteomics in Practice, Wiley-VCH Verlag GmbH 2002 45 Susan R.Mikkelsen, Eduardo Cortón, Bioanalytical chemistry, wileyinterscience, A JOHN & SONS, INC., PUBLICATION, 2004 46 Victoriano Valpuesta, Fruit and Vegetable Biotechnology, Woodhead Publishing Limited, Cambridge England 2002 Trang web tham khảo 47 www.condalab.com 48 www.en.wikipedia.org/wiki/Natt%C5%8D 49 http://en.wikipedia.org/wiki/Tempeh 50 www.hoahocvietnam.com/Home/Moi-tuan-mot-hoa-chat/Doc-to-3MCPD.html 51 www.ienica.net/crops/soya.htm 52 http://www.mard.gov.vn/fsiu/data/trongtrot.htm 53 www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/data/news/2007/6/4735/Sx3MCPD.htm 54 www.sojanet.com/en/ 55 www.soya.be/soya.php? 56 www.vietsciences.free.fr/timhieu/khoahoc/thucpham/nuoctuong.htm 57 http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C6%B0%C6%A1ng_Nam_%C4%90%C3%A0n PHỤ LỤC Diện tích trồng đậu tương Việt Nam [52] DIỆN TÍCH ĐẬU TƯƠNG PHÂN THEO ĐỊA PHƯƠNG PLANTED AREA OF SOYBEAN BY PROVINCE Số TT I 10 11 II 10 Tỉnh/Thành phố Provinces/Cities CẢ NƯỚC - WHOLE COUNTRY Miền Bắc - North Đồng Sông Hồng Red River Delta Hà Nội Hải Phòng Vĩnh Phúc Hà Tây Bắc Ninh Hải Dương Hưng Yên Hà Nam Nam Định Thái Bình Ninh Bình Đơng Bắc - North East Hà Giang Cao Bằng Lào Cai Bắc Cạn Lạng Sơn Tuyên Quang Yên Bái Thái nguyên Phú Thọ Bắc Giang 2003 Năm - Year 2004 2005 Đơn vị: - Unit: 2006 2007 165.640 182.568 183833 185,600 190,269 118.411 129.037 129144 143,500 147,663 43.939 1.872 182 5.659 15.978 2.123 1.941 4.896 3.012 2.714 3.770 1.792 45.052 12.302 7.240 5.014 1.920 2.117 1.869 1.924 3.656 2.468 5.378 50.679 1.875 171 6.205 19.012 1.871 1.891 5.533 3.501 2.812 5.996 1.812 47.939 14.849 7.323 5.165 2.478 2.292 2.116 2.167 3.572 2.148 4.801 50712 1875 171 6238 19012 1871 1891 5533 3501 2812 5996 1812 47975 14889 7322 5165 2478 2291 2115 2167 3572 2148 4801 69,400 1,700 300 6,900 31,800 1,800 1,600 4,700 7,700 3,600 6,700 2,600 46,000 15,900 6,400 5,600 2,300 2,100 2,200 2,800 2,900 1,700 3,100 70,838 1,582 218 4,344 33,630 1,966 1,265 4,388 8,194 3,166 7,227 4,859 47,357 18,210 6,329 5,715 2,126 1,963 2,609 3,240 2,316 1,594 2,329 11 III IV V VI VII Quảng Ninh Tây Bắc - North West Lai Châu Điện Biên Sơn La Hồ Bình Bắc Trung Bộ North Central Coast Thanh Hoá Nghệ An Hà Tĩnh Quảng Bình Quảng Trị Thừa Thiên - Huế Miền Nam - South Duyên Hải Nam Trung Bộ South Central Coast Đà Nẵng Quảng Nam Quảng Ngãi Bình Định Phú Yên Khánh Hoà Tây Nguyên - Central Highlands Kon Tum Gia Lai Đắk Lắk Đắc Nông Lâm Đồng Đông Nam Bộ South Central Coast TP Hồ Chí Minh Ninh Thuận Bình Phước Tây Ninh Bình Dương 1.164 21.694 7.268 12.245 2.181 1.028 23.043 1.505 6.088 13.253 2.197 1027 23081 1483 6148 13253 2197 1,000 22,400 2,000 8,900 9,200 2,300 926 23,170 2,139 9,138 9,176 2,717 7.726 6.722 985 19 7.376 6.151 1.188 30 7376 6151 1188 30 5,700 4,900 800 6,298 5,293 985 18 7 47.229 53.531 54689 42,100 42,606 2.922 2.995 3009 2,400 2,148 170 2.267 369 116 89 126 2.323 350 107 89 126 2323 347 124 200 1,700 400 100 65 177 1,407 420 79 23.048 25.018 26139 23,600 35 22.603 410 31 10.682 13.857 448 31 11705 13960 443 9,600 13,700 300 24,920 39 9,859 14,763 255 8.438 6.320 6344 4,100 3,482 318 630 630 500 386 Đồng Nai Bình Thuận Bà Rịa - Vũng Tàu Đồng sông Cửu long VIII Mekong River Delta Long An Đồng Tháp An Giang Tiền Giang Vĩnh Long Bến Tre Kiên Giang Cần Thơ Hậu Giang 10 Trà Vinh 11 Sóc Trăng 12 Bạc Liêu 13 Cà Mau 7.584 445 84 5.164 439 84 5164 439 110 3,200 300 100 2,745 240 111 12.821 19.198 28 10.367 3.416 316 1.175 19197 28 10367 3416 315 1175 12,000 12,056 6,700 1,000 1,100 7,337 1,068 215 1,199 2,300 100 100 700 1,503 22 703 7.631 2.511 199 377 1.551 20 532 3.296 16 576 3296 16 576 Năng suất đậu tương Việt Nam [52] NĂNG SUẤT ĐẬU TƯƠNG PHÂN THEO ĐỊA PHƯƠNG YIELD OF SOYBEAN BY PROVINCE Số TT Tỉnh/Thành phố Provinces/Cities CẢ NƯỚC - WHOLE COUNTRY I 10 11 II 10 11 III Miền Bắc - North Đồng Sơng Hồng Red River Delta Hà Nội Hải Phịng Vĩnh Phúc Hà Tây Bắc Ninh Hải Dương Hưng Yên Hà Nam Nam Định Thái Bình Ninh Bình Đơng Bắc - North East Hà Giang Cao Bằng Lào Cai Bắc Cạn Lạng Sơn Tuyên Quang Yên Bái Thái nguyên Phú Thọ Bắc Giang Quảng Ninh Tây Bắc - North West 2003 Đơn vị: tạ/ha - Unit: 100Kg/ha Năm - Year 2004 2005 2006 2007 13,3 12,0 13,3 12,9 14,4 13,3 13,9 13,1 14,5 13,6 15,1 11,7 21,4 13,4 13,2 16,2 18,4 17,8 16,3 14,8 20,6 13,9 10,0 8,0 7,4 8,2 11,7 11,0 13,4 10,7 11,3 13,5 14,4 10,2 10,1 16,5 11,8 19,8 15,5 15,2 16,3 17,8 18,5 17,6 16,6 19,8 19,0 10,0 8,5 7,0 8,1 10,4 10,6 13,7 11,1 11,9 14,7 15,2 10,9 10,7 16,1 11,8 20,7 15,6 15,4 16,0 17,0 18,1 16,4 16,6 19,2 12,3 10,4 89 7,0 8,8 12,3 13,5 13,7 11,2 12,8 14,7 14,0 11,4 11,5 15,5 12,4 16,7 14,8 15,0 16,1 18,1 17,9 14,4 14,7 18,5 14,6 10,0 8,9 6,9 8,4 12,6 9,5 14,5 11,1 12,4 14,1 14,5 11,0 12,0 15,9 13,5 19,7 14,3 15,4 15,6 20,0 17,7 14,6 17,3 19,0 15,2 10,7 9,5 7,7 9,4 13,1 15,8 15,4 11,6 13,1 14,4 14,1 11,5 12,2 IV V VI VII Lai Châu Điện Biên Sơn La Hồ Bình Bắc Trung Bộ North Central Coast Thanh Hoá Nghệ An Hà Tĩnh Quảng Bình Quảng Trị Thừa Thiên - Huế Miền Nam - South Duyên Hải Nam Trung Bộ South Central Coast Đà Nẵng Quảng Nam Quảng Ngãi Bình Định Phú Yên Khánh Hoà Tây Nguyên - Central Highlands Kon Tum Gia Lai Đắk Lắk Đắc Nông Lâm Đồng Đông Nam Bộ South Central Coast TP Hồ Chí Minh Ninh Thuận Bình Phước Tây Ninh Bình Dương Đồng Nai Bình Thuận 10,0 9,9 11,8 6,8 10,1 11,1 12,3 8,1 11,8 11,1 15,3 8,5 12,0 12,1 14,8 8,3 12,0 12,5 15,4 12,2 12,8 8,2 32,6 13,1 14,0 8,6 3,0 12,1 13,0 6,3 9,4 12,8 13,5 8,8 13,5 14,3 9,3 6,1 12,9 12,5 16,3 14,2 17,2 16,8 17,7 15,6 14,1 16,1 17,5 15,8 18,4 17,0 6,8 10,4 13,6 19,3 15,0 7,2 11,6 9,6 19,0 17,8 7,5 12,8 20,0 18,8 10,0 20,0 12,9 19,7 17,8 8,8 10,9 16,3 9,8 15,7 15,8 6,3 16,5 8,1 6,5 10,0 9,7 7,1 7,0 11,1 19,4 11,9 10,8 19,5 10,0 16,0 30,0 6,4 10,3 19,9 11,7 8,8 9,7 10,5 10,2 10,7 18,0 7,0 25,0 8,0 7,0 10,4 16,7 10,0 16,7 10,8 16,0 7,3 10,0 10,0 8,4 14,8 7,3 10,0 10,0 9,6 15,3 15,0 Bà Rịa - Vũng Tàu Đồng sông Cửu long VIII Mekong River Delta Long An Đồng Tháp An Giang Tiền Giang Vĩnh Long Bến Tre Kiên Giang Cần Thơ Hậu Giang 10 Trà Vinh 11 Sóc Trăng 12 Bạc Liêu 13 Cà Mau 11,0 11,0 8,2 10,0 10,8 21,6 21,4 20,0 20,8 27,0 22,5 28,2 21,1 20,7 23,4 21,1 26,9 23,0 27,5 20,9 28,0 25,5 22,6 29,2 24,9 32,8 16,5 10,0 10,0 17,1 33,3 18,6 13,3 20,9 17,2 21,2 26,1 22,0 29,0 16,0 16,1 15,0 14,4 16,4 10,0 15,8 12,5 15,9 15,0 16,8 16,6 Thành phần hóa học số nguồn lương thực 3.1 Thành phần hóa học gạo nếp: Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14 Glucid 74,9 Protein 8,2 Lipid 1,5 3.2 Thành phần hóa học gạo tẻ: Thành phần Hàm lượng (%) Nước 13,84 Glucid 77,55 Protein 7,35 Lipid 0,52 Cellulose 0,18 Muối khoáng 0,54 3.3 Thành phần hóa học bột mỳ Thành phần Hàm lượng (%) Nước 11,6 Glucid 73,80 Protein 12,48 Lipid 1,78 Vitamin B1 0,48 Vitamin PP 76 Ca 36 3.4 Thành phần hóa học bắp ngô Hàm lượng (%) Thành phần Bắp hạt Bắp mảnh Nước 12 11,4 Glucid 72 78,9 Protein 8,5 Lipid 4,8 0,8 Cellulose 1,5 0,4 Muối khoáng 1,2 0,4 Tiêu chuẩn Việt Nam nước tương (xì dầu) Tiêu chuản thay cho TCVN 1763 – 65 Tiêu chuẩn áp dụng cho nước chấm lên men từ nguyên liệu giầu protein có nguồn gốc thực vật, theo phương pháp vi sinh vật hay phương pháp hóa học Yêu cầu kỹ thuật: - Nước tương phải chế biến theo qui trình cơng nghệ quan duyệt y - Nước tương sản xuất theo phương pháp vi sinh vật phải dùng chủng Aspergillus oryzae khơng có độc tố quan có thẩm quyền cung cấp - Các loại hóa chất, dụng cụ dùng cho sản xuất không gây độc loại qui định Bộ Y Tế cho chế biến thực phẩm - Tuỳ theo phương pháp sản xuất chất lượng, nước tương chia thành hạng I hạng II Các tiêu chuẩn cảm quan: Yêu cầu Tên chi tiêu Thơm đặc trưng nước chấm lên men Mầu sắc Mùi Khơng có mùi mốc, mùi lạ Vị Ngọt dịu, khơng có mùi lạ Độ Trong, khơng có vẩn Các chi tiêu hóa học nước chấm: Hạng I (g/l) Hạng II (g/l) - Hàm lượng nitơ hồn tồn khơng nhỏ 16 12 - Hàm lượng nitơ axit amin không nhỏ 5,5 - Hàm lượng nitơ ammoniac không nhỏ 2,5 không lớn 1,6 1,3 - Hàm lượng muối NaCl không nhỏ 230 230 Tên chi tiêu - Hàm lượng axit (tính theo số ml NaOH 0,1N) Phân loại theo hạng nước tương: Tên chi tiêu Thượng hạng (g/l) Hạng I (g/l) Hạng II (g/l) - Đạm toàn phần không nhỏ 16 12 - Đạm Formol không nhỏ -Đạm ammoniac không nhỏ 140 – 226 140 – 220 140 – 220 - 14 - 14 – 14 - Muối ăn NaCl - Độ axit, tính CH3COOH khoảng Các tiêu vi sinh vật độc tố nước tương phải theo qui định sau: - Khơng có men mốc nhìn thấy mặt thường - Tổng số vi khuẩn hiếu khí không lớn 20 000 tế bào/ml - Vi khuẩn gây bệnh khơng có - Cl.perfringens: khơng lớn tế bào / ml - Aflatoxin: khơng có nước tương lên men MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN VỀ XÌ DẦU 1.1 MỘT SỐ LOẠI TƯƠNG TRÊN THẾ GIỚI 1.1.1 Miso (Nhật Bản) 1.1.2 Natto (Nhật Bản) 1.1.3 Tempeh (Indonesia) 1.1.4 Siêng (Campuchia) 1.1.5 Tương (Việt Nam) 1.1.5.1 Tương Bần 1.1.5.2 Tương Nam Đàn 14 1.2 MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CHỦ YẾU CÓ TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG TRUYỀN THỐNG 17 1.2.1 Các thành phần hóa học tế bào nấm mốc 17 1.2.2 Sợi nấm hệ sợi nấm 19 1.2.2.1 Các đặc điểm phát triển sợi nấm 20 1.2.2.2 Khuẩn lạc 20 1.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng nấm mốc 23 1.2.3.1 Nguồn thức ăn Carbon 23 1.2.3.2 Nguồn thức ăn Nitơ 24 1.2.3.3 Các nguyên tố khoáng 25 1.2.3.4 Độ ẩm 25 1.3 CÁC THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG ĐẬU TƯƠNG 27 1.4 KHÁI NIỆM VỀ ĐỘC TỐ 3-MCPD 29 1.4.1 Điều kiện hình thành độc tố 30 1.4.2 Thực phẩm có chứa MCPD 31 1.5 ĐỘC TỐ AFLATOXIN 32 1.5.1 Một số tính chất Aflatoxin 32 1.5.2 Độc tính Aflatoxin 33 1.6 CÁC ENZYMEE TRONG SẢN XUẤT XÌ DẦU 33 1.6.1 Enzymee Protease 33 1.6.2 Enzymee Amilase 34 1.7 KỸ THUẬT SẢN XUẤT XÌ DẦU 36 1.7.1 Phương pháp công nghệ axit 36 1.7.2 Phương pháp công nghệ vi sinh 38 1.7.3 Phương pháp công nghệ enzymee 40 1.7.4 Công nghệ enzymee kết hợp axit 40 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1.1 Phương pháp vi sinh vật 44 2.1.1.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 44 2.1.1.2 Tiến hành phân lập 46 2.1.1.2 Tiến hành phân lập 46 2.1.1.3 Chọn chủng có hoạt lực enzymee protease cao 46 2.1.1.4 Xác đinh hoạt độ enzymee Protease 46 2.1.2 Quy trình sản xuất tương nghiên cứu 47 2.2 PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH……… ….…48 2.2.1 Xác định nitơ tổng số phương pháp Kenđan (Kjeldhl) 48 2.2.2 Xác định hàm lượng Nitơ Amin phương pháp chuẩn Formol 49 2.3 KỸ THUẬT KIỂM NGHIỆM AFLATOXIN 50 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT 52 LỰC THỦY PHÂN CAO 52 3.1.1 Chủng khiết có hoạt lực cao 52 3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp Protease 55 3.1.2.1 Nguồn Carbon 56 3.1.2.2 Nguồn Nitơ 58 3.1.2.3 Ảnh hưởng nồng độ nguồn Nitơ 59 3.1.2.4 Ảnh hưởng pH 60 3.1.2.3.Ảnh hưởng nhiệt độ 61 3.2 Đo hoạt lực enzymee Protease 62 3.3 Ứng dụng nấm mốc tuyển chọn vào sản xuất xì dầu 64 3.3.1 Làm mốc tương 64 3.3.2 Ngả tương 65 3.3.3 Kết phân tích mẫu tương lên men 15 ngày…… 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………… 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO……… … .68 PHỤ LỤC 72 DANH MỤC CÁC BẢNG, ĐỒ THỊ, HÌNH, SƠ ĐỒ Bảng 1.1: Bảng thành phần hóa học tế bào trần Aspergillus oryzae hệ sợi 18 Bảng 1.2: Các chủng nấm mốc thường gặp sản xuất tương 26 Bảng 1.3: thành phần chất dinh dưỡng đậu tương 27 Bảng 1.4: Diện tích trồng cầy đậu tương số nước lớn 28 Bảng 1.5: Tiêu chuẩn 3-MCPD số nước 30 Bảng 1.6: Các nhánh cấu trúc Aflatoxin 32 Bảng 1.7: Tỷ lệ phối trộn để sản xuất tương gạo 35 Bảng 1.8: So sánh phương pháp sản xuất xì dầu 42 Bảng 2.1: Một số điểm phương pháp kiểm nghiệm Aflatoxin 51 Bảng 3.1: Các vòng thuỷ phân việc tuyển chọn chủng mốc 53 Bảng 3.2: Ảnh hưởng loại nguồn carbon 56 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ nguồn Carbon 57 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nguồn Nitơ 58 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ nguồn Nitơ 59 Bảng 3.6: Ảnh hưởng pH 60 Bảng 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình tiết enzymee 61 Bảng 3.8 Kết phân tích mẫu tương lên men 15 ngày… ….71 Đồ thị 3.1: Hoạt lực Protease chủng nghiên cứu ………… …… 59 Đồ thị 3.2: Ảnh hưởng nguồn Carbon ………………… ….61 Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng nồng độ nguồn Carbon ……………… … 63 Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng nguồn Nitơ ……………………… …….64 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng nồng độ nguồn Nitơ ……………… …… 65 Đồ thị 3.6: Ảnh hưởng pH ………………………………… .… 66 Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ ……………………… … 67 Đồ thị 3.8: Đo nồng độ enzyme Protease nghiên cứu ……… …………69 Hình 1.1 : Sản phẩm Miso Hình 1.2: Sản phẩm Natto Hình 1.3: Sản phẩm Tempeh Hình 1.4: Sản phẩm Siêng Campuchia Hình 2.1: Mẫu xơi mốc tương Bần, n Nhân, Tỉnh Hưng Yên 45 Hình 2.2: Mẫu mốc xôi tương Nam Đàn, Tỉnh Nghệ An 45 Hình 3.1: Bào tử nang mẫu nghiên cứu soi qua kính hiển vi điện tử 52 Hình 3.2: Nhánh nấm mốc nghiên cứu soi qua kinh hiển vi điện tử 52 Hình 3.3: Vịng thuỷ phân Protease môi trường thạch sữa 53 Hình 3.4: Pellet chủng AB1 ni bình tam giác mơi trường Czapek 55 Hình 3.5: Lỗ đục vịng thuỷ phân dịch enzymee mơi thạch sữa 55 Hình 3.6: A1 vòng thuỷ phân Protease K chuẩn 10 IU, B1 vòng thuỷ phân mẫu nghiên cứu 63 Hình 3.7: A2 vịng thuỷ phân Protease K chuẩn 20 IU, B2 vòng thuỷ phân mẫu nghiên cứu 63 Hình 3.8: Chủng mốc AB1 nuôi môi trường xôi nhiệt độ 40oC thời gian ngày 64 Hình 3.9: Nhân mốc xơi để tiến hành lên men, mẫu nuôi thời gian 65 Hình 3.10: Tương lên men 15 ngày……………………………………… ……71 Sơ đồ 1.1: Quy trình cơng nghệ làm Siêng Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất xì dầu phương pháp axit 36 Sơ đồ 1.3: Quy trình sản xuất xi dầu phương pháp vi sinh 39 Sơ đồ 1.4: Quy trình sản xuất xì dầu phương pháp kết hợp axit 41 Sơ đồ 2.1: Quy trình sản xuất tương nghiên cứu 47 ... cứu: "Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt lực Protease cao sản xuất xì dầu an tồn chất 3- MCPD Aflatoxin" Mục đích nghiên cứu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt lực Protease cao. .. GIáO DụC Và ĐàO TạO TRƯờNG ĐạI HọC BáCH KHOA Hà NộI LUậN VĂN THạC Sỹ KHOA HọC PHÂN LậP Và TUYểN CHọN CHủNG NấM SợI Có HOạT TíNH PROTEASE CAO TRONG SảN XUấT Xì DầU AN TOàN Về 3- MCPD Và AFLATOXIN. .. chủng nấm sợi có hoạt lực Protease cao sản xuất xì dầu an tồn chất 3- MCD Aflatoxin ” Chúng phân lập chủng nấm sợi từ mẫu mốc xôi tương Bần (Hưng Yên) tương Nam Đàn (Nghệ An) hai sở sản xuất tương