Chẩn đoán chính xác tác nhân HCV là mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó tiến hành điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh, phòng ngừa sự lây lan của HCV. Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp xác định genotype HCV, ở Việt Nam phổ biến hai phương pháp: INOLIPA và SEQUENCING.
SO SÁNH KỸ THUẬT INOLIPA VÀ KỸ THUẬT SEQUENCING TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH GENOTYPE HCV Tóm tắt: Chẩn đốn xác tác nhân HCV mục tiêu quan tâm hàng đầu bác sĩ, từ tiến hành điều trị, theo dõi diễn tiến biến chứng bệnh, phòng ngừa lây lan HCV Hiện giới có nhiều phương pháp xác định genotype HCV, Việt Nam phổ biến hai phương pháp: INOLIPA SEQUENCING Chúng tiến hành nghiên cứu so sánh việc xác định genotype HCV hai phương pháp INOLIPA SEQUENCING Việc nghiên cứu thực theo phương pháp xác định kiểu gen HCV kỹ thuật lai kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn DNA vùng 5’NC HCV, sau so sánh với bảng dị ( phương pháp INOLIPA) trình tự thư viện kiểu gen ( phương pháp SEQUECING) để xác định kiểu gen HCV Kết thu nhận cho thấy khác biệt việc xác định kiểu gen HCV hai phương pháp INOLIPA SEQUENCING Nghiên cứu mẫu huyết bệnh nhân viêm gan, xơ gan nghi ngờ nhiễm điều trị bệnh viện khoãng thời gian tháng 02/2006 đến tháng 10/2006 Cho thấy bệnh nhân nhiễm kiểu gen HCV: 1, 1a, 1b, 2, 2a/2c, 6a Tuy nhiên, việc nghiên cứu thực thời gian ngắn phạm vi hẹp nên kết chưa phản ánh thật xác kiểu gen việc ứng dụng thực tiễn Abstract: Exact diagnosis of HCV agent is the first goal of physicians so that they can treat, follow up its complications and preventing from the spreading of HCV Nowadays, there are many methods for confirmation of HCV genotype In Vietnam, Inolipa and Sequencing are common use for genotyping of HCV The determination of HCV genotype by both methods was performed by the direct hybridization and the direct sequencing of product targetted the 5’NC of the viral genome by PCR, after that the result was matched with the genotypes in the list ( Inolipa method) or compare with the sequencing in the library ( Sequencing method) The results of two methods are similar for the main group, but different for the subtype The result of HCV genotyping from 100 sample among patients with hepatitis or cirrhosis were treated in some hospital of HCM city from 02/2006 to 10/2006 were: HCV genotype 1, 1a, 1b, 2, 2a/2c, 2a, 2c, 6a Since the study was done in a short time, the result does not inferent from factual knowledges Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C mạn tính bệnh nguy hiểm không nhận biết sớm mà phát có biểu hiện: ưng thư gan, xơ gan … HCV xâm nhập thẳng vào thể qua đường máu, công vào tế bào gan sinh sôi nảy nở Đa số người bị nhiễm virus khơng có triệu chứng sau tháng đầu bị nhiễm Một điều quan trọng nguy hiểm đến chưa có vaccin phịng hay thuốc chữa lành hẳn HCV, nhiên bên cạnh có nhiều phương pháp trị liệu áp dụng làm ức chế phát triển HCV Người nhiễm HCV chuyển sang mạn tính chiếm tỷ lệ cao (50% đến 80%), tỷ lệ bệnh nhân mạn tính chuyển sang xơ gan ung thư gan từ 20% đến 25% Chính thế, việc tiến hành xác định genotype cần thiết quan trọng q trình điều trị bệnh định thời gian điều trị bệnh, ngồi cịn giúp theo dõi diễn tiến biến chứng bệnh, phòng ngừa lây lan HCV Ngày nay, với phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử cho đời phương pháp xác định kiểu gen HCV Trên giới có nhiều cơng ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche … cho đời kit xác định genotype HCV, nhiên giá thành đắt nên chưa áp dụng rộng rãi Chúng tiến hành nghiên cứu so sánh độ phù hợp hai phương pháp Inolipa Sequencing nhằm đáp ứng cho trình theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HCV Vật liệu phương pháp Đối tượng: Chúng tiến hành xác định kiểu gen HCV 100 bệnh phẩm nhiễm virus viêm gan C từ bệnh viện (Hoàn Mỹ, Nhiệt Đới, Triều An) từ 02/2006 đến 10/2006 Thực Phòng Nghiên cứu Phát triển (Reseach & Development), Công ty TNHH Sản xuất - Thương mại - Dịch vụ Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn, Quận 7, Tp Hồ Chí Minh Phương pháp xét nghiệm: Đầu tiên, tiến hành ly trích RNA HCV từ mẫu huyết bệnh nhân có HCV dương tính; sau phiên mã ngược thành cDNA cDNA khuếch đại thành sản phẩm PCR mạch với cặp mồi đặc hiệu mạch Định type HCV: Kỹ thuật INOLIPA: Sản phẩm PCR tiếp tục khuếch đại lần với cặp mồi mà có mồi gắn biotin Nhờ vậy, sản phẩm cuối trước lai có kích thước 244bp có đầu gắn biotin Lai sản phẩm PCR vòng gắn biotin vạch đoạn dò genotype đặc hiệu , nhờ phát sản phẩm lai cộng hợp streptavidin – phosphatase alkalin Sau tiến hành lai sản phẩm PCR có với que (strip) thuốc thử Lipa Trên strip có gắn sẵn vạch dị (probe) chun biệt cho genotype HCV Kỹ thuật SEQUENCING: Tiến hành tinh sản phẩm, loại bỏ primer tạp chất, giữ lại sản phẩm PCR product Sản phẩm lại tiếp tục khuyếch đại lần với đoạn mồi khác Tiếp theo sản phẩm lại tiếp tục tinh lần nhằm tạm ngưng phản ứng; loại trừ tất primer tạp chất lại giữ DNA Tiến hành giải mã trình tự đoạn DNA vừa thu có kích thước 244bp Từ DNA, thực PCR với cặp mồi đặc hiệu vùng khơng mã hóa 5’ để đặt sản phẩm khuyếch đại đoạn đặc hiệu 244 bp Sau tiến hành giải trình tự máy Sequence CEQ 8000 Beckman Coulter Dựa vào trình tự giãi mã, tiến hành so sánh độ tương đồng với trình tự kiểu gen chuẩn có Genebbrarain Bank để xác định genotype thông tin [10] Kết quả: 100 mẫu HCV tiến hành định type đồng thời hai phương pháp Inolipa Sequncing Bảng 1: Kết type Genotype Inolipa (n=100) 58 19 0 23 Sequencing (n=100) 58 19 0 23 Bảng 2: Kết subtype Subtype 1a 1b Inolipa (n=100) 10 40 Sequencing (n=100) 10 40 2a 2c 2a/2c 6a ? ? 15 23 23 Bàn Luận Việc xác định genotype HCV phương pháp InoLIPA chẩn đoán kiểu gen virus HCV gây viêm gan tiến hành tất phịng thí nghiệm PCR dễ thực khơng địi hỏi máy móc trang thiết bị kỹ thuật cao Tuy nhiên, không xác định kiểu gen cụ thể phụ thuộc hồn tồn vào nguồn hố chất nước ngồi nên không chủ động việc nghiên cứu Việc xác định genotype HCV phương pháp Sequencing chẩn đoán kiểu gen virus HCV gây viêm gan cần có máy móc trang thiết bị đại điều kiện kỹ thuật cao nên chủ yếu thực trung tâm nghiên cứu Nhưng lại xác định kiểu gen cụ thể, có ý nghĩa nghiên cứu biến đổi vùng gen mà phương pháp INOLIPA không thực Bên cạnh chủ động việc nghiên cứu Kỹ thuật HCV InoLIPA kỹ thuật HCV Sequencing chẩn đoán kiểu gen virus HCV gây viêm gan hoàn toàn phù hợp kết thu nhận Tuy nhiên, kỹ thuật Sequencing có nhiều tính ưu việc việc xác định kiểu gen: xác, tránh nhầm lẫn quasispecies gây type subtype, chủ động công tác nghiên cứu nhằm ứng dụng điều trị lâm sàng … so với kỹ thuật InoLIPA Kỹ thuật Sequencing kỹ thuật InoLIPA chẩn đoán xác định kiểu gen virus HCV gây viêm gan có ý nghĩa cơng tác điều trị theo dõi bệnh Kết Inolipa Sequencing hoàn tồn xác với độ tin cậy 100% Kết Luận Chúng tiến hành so sánh 100 mẫu xác định kiểu gen HCV gây viêm gan kỹ thuật khác nhau: kỹ thuật InoLIPA kỹ thuật Sequencing Tiến hành so sánh độ phù hợp kỹ thuật thấy khơng có khác biệt hai phương pháp InoLIPA Sequencing kết Nhưng phương pháp Sequencing có tính ưu việc xác định kiểu gen cụ thể Vì phương pháp ứng dụng rộng rãi trình xác định genotype HCV công tác nghiên cứu điều trị bệnh Đề Nghị Đây phương pháp trình tiến hành chẩn đốn điều trị bệnh, chưa ứng dụng rộng rãi Việt Nam, phổ biến thành phố lớn, nên công tác tiến hành nghiên cứu cịn khó khăn nên khơng tránh khỏi sai sót Chúng tơi đề nghị tiếp tục tiến hành nghiên cứu thêm phạm vi rộng kết xác Đáp ứng yêu cầu nghiên cứu điều trị bệnh có hiệu Tài liệu tham khảo Pham Hung Van, Direct sequencing the PCR product for genotype of HCV, 2006, Nam Khoa R&D Group, Ho Chi Minh City Said H.S.A., Laboratory diagnosis of viral hepatitis C, 2003, Sultan Qaboos University, Oman Bruno s Silini e - Crosignani a; Hepatitis C virus genotypes and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A prospective study, Hepatology; 1997;25:734 – 758 Bộ Y Tế – Viện Thông Tin Thư Viện Y Học Trung Ương, Tạp chí thơng tin Y Dược số Chuyên đề gan mật, 2004, Hà Nội http://www.bayer.com/inolipa Pham Hung Van, RNA extraction using Chomzynski method with RNAPREP kit, 2002, Nam Khoa R&D Group, Ho Chi Minh City Hồ Quỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, 2003, NXB Giáo Dục, TP.HCM Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, Di truyền phân tử, NXB Nông Nghiệp Lê Đình Lương – Quyền Đình Thi, Kỹ thuật di truyền ứng dụng, 2004, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội 10 http://www.beckmancoulter.com/sequence ... nghiên cứu Kỹ thuật HCV InoLIPA kỹ thuật HCV Sequencing chẩn đoán kiểu gen virus HCV gây viêm gan hoàn toàn phù hợp kết thu nhận Tuy nhiên, kỹ thuật Sequencing có nhiều tính ưu việc việc xác định kiểu... viêm gan kỹ thuật khác nhau: kỹ thuật InoLIPA kỹ thuật Sequencing Tiến hành so sánh độ phù hợp kỹ thuật thấy khơng có khác biệt hai phương pháp InoLIPA Sequencing kết Nhưng phương pháp Sequencing. .. gen: xác, tránh nhầm lẫn quasispecies gây type subtype, chủ động công tác nghiên cứu nhằm ứng dụng điều trị lâm sàng … so với kỹ thuật InoLIPA Kỹ thuật Sequencing kỹ thuật InoLIPA chẩn đoán xác định