Mục tiêu chính của luận án là xác định đa hình/đột biến các gen AhR và AIP ở người sống trong vùng phơi nhiễm dioxin và người có nồng độ dioxin trong máu cao; Tìm hiểu mối liên hệ giữa những đa hình/đột biến các gen AhR và AIP với dioxin, trong đó có các bệnh liên quan đến dioxin; Bước đầu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (whole exome sequencing, WES) ở người có nồng độ dioxin trong máu cao, để phân tích các biến đổi gen có thể liên quan đến chuyển hóa dioxin.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI CỦA GEN AHR VÀ AIP Ở CÁC NẠN NHÂN NHIỄM DIOXIN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2017 Cơng trình hoàn thành Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nơng Văn Hải PGS TS Nguyễn Huy Hồng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Đại học Quốc gia họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi… ngày……tháng… năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; Trung tâm Thông tin Thư viện - ĐHQGHN MỞ ĐẦU Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) thụ thể tiếp nhận dioxin nhiều chất ô nhiễm mơi trường khác Khi AhR hoạt hóa phối tử, dẫn đến điều hòa biểu gen tham gia nhiều trình sinh lý quan trọng thể Các cá thể khác nhau, phơi nhiễm với chất độc môi trường nhau, lại chịu ảnh hưởng có nguy với ung thư khác Điều có liên quan đến đa hình gen AhR AIP (Aryl hydrocarbon receptor Interacting Protein) Trên giới, nghiên cứu gen AhR AIP chủ yếu người không phơi nhiễm dioxin Ở Việt Nam, có nghiên cứu gen đối tượng phơi nhiễm dioxin.Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu gen AIP đa hình/đột biến tồn exon gen AhR người phơi nhiễm có nồng độ dioxin máu cao Ảnh hưởng tác động dioxin chất ô nhiễm mơi trường qua đường tín hiệu AhR coi phức tạp, chưa biết đầy đủ, có nhiều kết trái chiều Hiện chưa có liệu đầy đủ gen chịu ảnh hưởng tác động dioxin Xuất phát từ thực tễ trên, thực đề tài “Nghiên cứu thay đổi gen AhR AIP nạn nhân nhiễm dioxin”nhằm mục tiêu sau: (1) Xác định đa hình/đột biến gen AhR AIP người sống vùng phơi nhiễm dioxin người có nồng độ dioxin máu cao; (2) Tìm hiểu mối liên hệ đa hình/đột biến gen AhR AIP với dioxin, có bệnh liên quan đến dioxin; (3) Bước đầu giải trình tự tồn hệ gen biểu (whole exome sequencing, WES) người có nồng độ dioxin máu cao, để phân tích biến đổi gen liên quan đến chuyển hóa dioxin Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ DIOXIN 1.1.1 Khái niệm dioxin hợp chất tƣơng tự dioxin Thuật ngữ “Dioxin” thường sử dụng để nói đến nhóm chất policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) policlodibenzofuran (PCDF) Trong chất dioxin có 2,3,7, 8-tetrachlorodibenzo-pdioxin (TCDD) chất độc 1.1.2 Đặc tính dioxin Dioxin có độ bền vững cao Thời gian bán hủy thể người từ 5-12 năm Khoảng 90% dioxin hấp thụ vào thể qua đường ăn uống 1.1.3 Ảnh hƣởng dioxin sức khỏe ngƣời Dioxin gây tổn thương đa dạng phức tạp, làm phát sinh nhiều bệnh lý quan khác Dioxin không gây tổn hại tới sức khỏe người bị phơi nhiễm mà gây ảnh hưởng tới họ hệ tương lai 1.1.4 Một số phƣơng pháp định lƣợng dioxin 1.1.3.1 Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ độ phân giải cao, 1.1.3.2 Phương pháp DR CALUX 1.2 CƠ CHẾ PHÂN TỬ TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN 1.2.1 Thụ thể Aryl hydrocarbon receptor (AhR) 1.2.1.1 Cấu trúc thụ thể AhR Thụ thể AhR - thụ thể dioxin hoạt hóa phối tử (ligand) Phối tử điển hình AhR TCDD AhR thành viên họ protein thuộc nhân tố điều hịa phiên mã (transcription factor), có cấu trúc basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim (bHLH/PAS) AhR có vùng cấu trúc đảm nhiệm chức năng: liên kết với phối tử, liên kết với DNA gen đích, liên kết protein thành phần chức hoạt hóa phiên mã 1.2.1.2 Vai trò protein AhR thể AhR yếu tố điều hòa biểu gen tham gia đảm nhiệm chức sinh lý quan trọng thể AhR tham gia biệt hóa nhiều loại tế bào giai đoạn sớm trình phát triển cá thể (Li Y, 2011; Gargaro, 2016) AhR đóng vai trị thiết yếu việc trì cân nội mơi tế bào Khi thể tích tụ dioxin chứa protein AhR hoạt hóa lâu dài, thường xuyên, dẫn đến trạng thái ức chế miễn dịch thường xuyên liên tục (Ridolfi, 2010) 1.2.1.3 Vai trị protein AhR bệnh ung thư Thơng qua thụ thể AhR, dioxin ảnh hưởng lên giai đoạn ung thư Mức độ biểu cao AhR có liên quan lớn với tiến triển ung thư với tỷ lệ mắc ung thư (Dietrich, 2010; Safe, 2013) Ngồi ra, AhR đóng vai trị quan trọng giảm kết dính tế bào dẫn đến gia tăng xâm lần mô di tế bào ung thư Mặt khác, AhR hoạt động gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) gen trở nên khơng hoạt động q trình hình thành khối u số điều kiện định (Fan Y, 2010) 1.2.2 Cơ chế tác động dioxin thơng qua thụ thể AhR 1.2.2.1 Con đường tín hiệu cổ điển (canocial signaling pathway) Trong điều kiện khơng có phối tử, AhR tế bào chất, liên kết với protein thành phần như: AIP (aryl hydrocarbon receptor interacting protein), p23 phân tử HSP90 (90-kDa heat shock protein) Khi dioxin khuếch tán qua màng tế bào vào liên kết với AhR, phức hệ AhR hoạt hóa, thay đổi cấu hình vận chuyển vào nhân tế bào Trong nhân, AhR giải phóng khỏi hệ thống phức hợp protein thành phần tương tác với nhân tố dẫn truyền nhân ARNT (AHR nuclear translocator-ARNT) Phức hệ AHR/ARNT sau liên kết với vị trí DNA đặc biệt gen đích, gọi yếu tố đáp ứng với chất lạ (xenobiotic respone element, XRE) hay yếu tố đáp ứng dioxin (dioxin response element, DRE), qua điều hịa biểu gen đích (Quintuna, 2013; Wright, 2017) 1.2.2.2 Con đường tín hiệu phi cổ điển (non-canocial signaling pathway) AhR điều hòa phiên mã gen đích thơng qua đường khác khơng liên quan đến trình tự đáp dioxin (DRE) gen đích, mà qua vị trí DRE (non-consensus DRE, NC - DRE) vùng promoter gen đích Để liên kết với trình tự này, AHR cần kết hợp protein Kruppel-like Factor (KLF6) có đồng tham gia protein carbamoyl phosphate synthase (CPS1) (Wright, 2017) 1.2.3 Dioxin gây biến đổi vật chất di truyền Dioxin tác nhân môi trường gây tổn thương vật chất di truyền phát sinh đột biến gen thơng qua hình thành gốc tự chứa oxy hoạt động (reactive oxygen species, ROS) (Mates, 2010; Franken, 2017) 1.3 TỔNG QUAN VỀ GEN AHR 1.3.1 Đặc điểm gen AhR ngƣời Gen AHR người có kích thước khoảng 50 kb, nằm vai ngắn nhiễm sắc thể số (7p21.1), gồm 11 exon 10 intron, mã hóa protein AhR có 848 acid amin 1.3.2 Vai trị đa hình gen AhR chuyển hóa dioxin chất nhiễm mơi trƣờng Đa hình gen AHR thúc đẩy kìm hãm hoạt động thụ thể AhR Đa hình gen AHR điều chỉnh đáp ứng thể nhân tố gây tổn hại gen có mơi trường sống (Ridolf, 2014) Mặc dù ô nhiễm môi trường dioxin làm gia tăng nghiêm trọng tỷ lệ ung thư, có nhiều cư dân sống vùng ô nhiễm lại không mắc ung thư hay bệnh liên quan đến dioxin Điều giải thích dựa sở lực liên kết dioxin với receptor AHR Các cá thể khác nhạy cảm với dioxin đa hình gen AHR mã hóa receptor có lực khác với TCDD (Ridolf, 2014; Kovalova 2016) 1.4 TỔNG QUAN VỀ GEN AIP 1.4.1 Đặc điểm gen AIP Gen AIP nằm nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2) có exon mã hóa protein AIP có 330 amino acid, trọng lượng phân tử 37 kDa 1.4.2 Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ngƣời Các thể đột biến protein AIP khả ức chế phân bào khơng có khả liên kết với protein thành phần, bao gồm protein đường thụ thể AhR (Igreja, 2010) AIP hoạt động nhân tố áp chế khối u hầu hết mô Đột biến gen AIP liên quan tới bệnh u tuyến yên (Hernandez, 2017) 1.5 VAI TRÒ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƢỜNG TÍN HIỆU THƠNG QUA THỤ THỂ AHR AIP có vai trị ổn định phức hợp AhR gắn kết với phối tử, trì AhR bào tương, ngăn chặn phân giải AhR proteasome AIP ảnh hưởng đến tính ngun vẹn AhR truyền tín hiệu thụ thể AhR (Jaffrain, 2009) AIP điều hòa hoạt động phiên mã gen AhR Sự nhạy cảm tế bào với dioxin có liên quan tới protein AIP Đột biến chức AIP dẫn đến bất thường điều hịa biểu gen đích đường tín hiệu AhR (Nukaya, 2010; Rowland, 2011) 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM DIOXIN Ở VIỆT NAM Tại Việt Nam, có nghiên cứu đánh giá thay đổi nội tiết, miễn dịch, sinh hoá, huyết học tồn lưu dioxin máu, sữa mẹ người dân sống vùng ô nhiễm chất da cam/dioxin Các nghiên cứu điều tra thực trạng, cấu bệnh tật đối tượng nạn nhân dioxin Các nghiên cứu phân tử thay đổi biểu hiện/đột biến số gen đối tượng phơi nhiễm dioxin như: p53, CypP1A1, AhR, CypP1B1, hOGG1 Đối với gen AhR, chưa có nhiều nghiên cứu tập trung xác định đa hình/đột biến tồn vùng biểu gen AhR Với gen AIP, chưa có nghiên cứu biến đổi gen AIP người nhiễm dioxin nói riêng quần thể người Việt Nam nói chung 1.7 NGHIÊN CỨU HỆ GEN (GENOME) VÀ HỆ GEN BIỂU HIỆN (EXOME) TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM DIOXIN Giải trình tự tồn hệ gen (WGS) đối tượng nạn nhân dioxin tiến hành tài cấp Nhà nước 33 (KHCN-33/1115), theo mô hình trio (bố - – mẹ) giải mã hệ gen số gia đình nạn nhân chất độc da cam Giải trình tự hệ gen biểu (WES) thực đối tượng con/cháu nạn nhân chất độc da cam bị thiểu trí tuệ đề tài NAFOSTED (106-YS.01-2014.34) Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu phơi nhiễm dioxin 93 người xét nghiệm dioxin huyết máu (thuộc đề tài Nhà nước KHCN-33.04/11-15) Đối tượng không phơi nhiễm dioxin 20 người dân sống khu vực quận Hà đơng, Hà Nội Đối tượng nghiên cứu giải trình tự hệ gen biểu (WES) cựu chiến binh bị nhiễm dioxin (thuộc đề tài NAFOSTED 106-YS.01-2014.34) 2.2 HĨA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ Hóa chất hãng: Sigma, Quiagen, Fermentas…Trang thiết bị Viện nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 2.3.2 Đo quang phổ DNA 2.3.3 Điện di DNA gel Agarose 2.3.4 Nhân gen kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.3.5 Giải trình tự gen tự động 2.3.6 Phương pháp giải trình tự tồn exon (WES) Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Chúng tơi phân tích số sinh học 114 mẫu (94 mẫu phơi nhiễm 20 mẫu không phơi nhiễm dioxin) Các mẫu phơi nhiễm dioxin phân thành nhóm: Bảng 3.1 Phân nhóm đối tƣợng nghiên cứu Nhóm đối tƣợng n Tổng Không phơi nhiễm dioxin 20 20 Phơi nhiễm dioxin Nhóm 1: dioxin máu ≥10 ppt bị bệnh liên quan dioxin 27 Nhóm 2: dioxin máu ≥10 ppt khơng bị bệnh liên quan dioxin 34 Nhóm 3: dioxin máu A, p.R554K) chiếm tỷ lệ cao (64%), xuất kiểu gen GG, GA AA Tỷ lệ % 60 40 36 Phơi nhiễm 55 51 Không phơi nhiễm 35 13 20 10 GG GA AA Kiểu gen Hình 3.10 Phân bố kiểu gen đa hình rs2066853 gen AhR nhóm phơi nhiễm không phơi nhiễm dioxin Trục tung: Tỷ lệ % đối tượng nghiên cứu Trục hoành: Các kiểu gen (GG, GA AA) đa hình rs206853 gen AhR Cột màu đỏ biểu thị nhóm đối tượng phơi nhiễm dioxin Cột màu xanh biểu thị nhóm đối tượng khơng phơi nhiễm dioxin Kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao kiểu gen GG vùng phơi nhiễm không phơi nhiễm dioxin (Hình 3.10) Bảng 3.10 Tần suất kiểu gen (GG, GA, AA) đa hình rs2066853 gen AhR nhóm vùng phơi nhiễm dioxin Kiểu gen: %, (n) Nhóm nghiên cứu GG GA AA Nhóm 1: dioxin máu ≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin 55,6 % (15 29,6% (8) 14,8% (4) Nhóm 2: dioxin máu ≥10 ppt, không bị bệnh liên quan dioxin 23,5% (8) 64,7% (22) 11,8% (4) Nhóm 3: dioxin máu 0.05, (bảng 3.10) Tuy nhiên, nhóm tần số kiểu gen GG cao 1,88 lần kiểu gen GA Ngược lại, nhóm 2, tần số kiểu gen GA lại cao 2.75 lần so với kiểu gen GG Để đánh giá khác biệt có ý nghĩa thống kê hay khơng, chúng tơi phân tích riêng tần số kiểu gen GG GA nhóm nhóm (bảng 3.11) Bảng 3.11 Tần suất kiểu gen GG GA đa hình rs2066853 gen AhR nhóm nhóm vùng phơi nhiễm dioxin Nhóm nghiên cứu Kiểu gen: %, (n) GG GA Nhóm 1: dioxin máu ≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin 65,2 % (15) 34,8% (8) Nhóm 2: dioxin máu ≥10 ppt, khơng bị bệnh liên quan dioxin 26,7% (8) 73,3% (22) p, OR, 95%CI p = 0.005 OR = 5.156 95%CI: (1.585 - 16.1771) Chú thích: p thu từ kiểm định χ2 , OR (Odd ratio): tỷ số chênh 95%CI (95% confidnece interval): khoảng tin cậy 95% Sự khác biệt kiểu gen GG GA nhóm nhóm có ý nghĩa thống kê (OR = 5.156; 95%CI: 1.585 - 16.1771; pA Đột biến Exon2 c.124C>A Thay đổi protein Số mẫu (n) Nhóm đối tƣợng PN Khơng PN % (n) % (n) 114 8,5% (8) 10% (2) H42N 114 3,2% (3) - rs138902236 Exon c.517G>A E173K 114 10,6 (10) 15% (3) rs2276020 Exon c.516C>T p.D172D 114 23,4% (22) 20% (4) rs641081 Exon c.682C>A p.Q228K 114 94 (100%) 20 (100%) Trong đa hình gen AIP, đa hình rs641081 xuất 100% đối tượng nghiên cứu Tần số kiểu gen đa hình cịn lại 15 (rs747233720, rs138902236, rs2276020) đạt trạng thái cân Hardy-Weinberg, với giá trị Hwpval =1 (>0.001) (bảng 3.14) Bảng 3.14 Tần suất allele, kiểu gen đa hình gen AIP nghiên cứu Đa hình Kiểu gen kiểu gen Allele n (%) allele % HWpval GG 104 (91,2) G 95,6 GA 10 (8,8) A 4,4 rs138902236 GG GA CC 101 (88,6) 13 (11,4) 88 (77,2) G A 94,6 5,4 rs2276020 CT 24 (21,1) C T 87,7 12,3 TT (1,7) rs747233720 3.2.4.1 Đa hình exon gen AIP Đa hình rs747233720 có 10/114 mẫu (8,8%) Chưa có liệu cơng bố tần số đa tần số allele kiểu gen đa hình quần thể người giới Một biến đổi khác phát exon c.124C>A, p.H42N, biến đổi coi đột biến (chưa có dbSNP) Đột biến xuất ba mẫu (DN30, DN34, DN52), nhóm có nồng độ dioxin cao bị bệnh liên quan dioxin Đột biến H42N dẫn đến liên kết hydro phân tử protein, đồng thời thay một amino acid vịng, tích điện dương (Histidine) thành amino acid trung tính, khơng tích điện (Asparagine) Đa hình H42N nằm đầu cuối N protein Đầu N AIP đóng vai trị quan trọng tương tác AIP với protein khác trì cấu trúc ổn định AIP tế bào (Linnert, 2013) 16 3.2.4.2 Đa hình exon gen AIP Đa hình rs138902236 (c.517G>A, p.E173K) xuất kiểu gen GG GA Hầu hết quần thể người giới khơng có đa hình Trong nghiên cứu này, đa hình rs138902236 (GA) xuất với tỷ lệ cao (13/114 mẫu, 11,4%) Đa hình dẫn đến thay amino acid có tính acid, tích điện âm (Glutamic acid) thành amino acid có tính kiềm, tích điện dương (Lysine) 3.2.4.3 Đa hình exon gen AIP Đối với exon phát thấy đa hình rs641081 (c.682C>A, p.Q228K) 100% mẫu nghiên cứu Kết phù hợp với tần số đa hình rs641081 quần thể người Việt Nam sở liệu HGVD Ở nhóm đối tượng dioxin ≥ 10 ppt mắc bệnh liên quan đến dioxin, có trường hợp mang đồng thời đa hình H42N gen AIP đa hình R554K gen AhR (mẫu DN34, DN52) Cả trường hợp mắc bệnh tiểu đường type II, trường hợp mắc đồng thời ung thư khí quản (DN52) Ngồi ra, trường hợp khác có đa hình E173K gen AIP, người có đa hình R554K gen AhR kiểu gen GA (mẫu DN53) mắc bệnh thần kinh ngoại biên người có đa hình R554K gen AhR kiểu gen AA (DN56) mắc ung thư khí quản GIẢI TRÌNH TỰ TỒN BỘ HỆ GEN BIỂU HIỆN (WES) NGƢỜI CÓ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU CAO Từ kết WES mẫu có nồng độ dioxin máu cao (mẫu ThN) Chúng sàng lọc 40 biến thể di truyền gen (AhR, AIP, AhRR, CYP1A1, ARNT, CYP1B1, HEMGN, CENPE) liên quan đến đường chuyển hóa dioxin thông qua thụ thể AhR (Bảng 3.18) 17 Bảng 3.18: Các biến thể di truyền sàng lọc từ kết giải trình tự tồn exon (WES) Gene Name #Chrom Zygosity Effect Rank/ Total AhR AhR AhR AhR AhR chr7 chr7 chr7 chr7 chr7 HOM HOM HOM HOM HOM upstream_gene_variant upstream_gene_variant 5_prime_UTR_variant intron_variant missense_variant 1/11 7/10 10/11 c.-614C>T c.-614_-614insGGGCGGGGCG c.-459A>G c.908+33G>T c.1661G>A AhR chr7 HOM 3_prime_UTR_variant 11/11 c.*1887delG AIP chr11 HOM intron_variant 3/5 c.469-236G>T AIP chr11 HOM missense_variant 4/6 c.517G>A p.Glu173Lys AIP AhRR chr11 chr5 HOM HET missense_variant intron_variant 5/6 3/11 c.682C>A c.257-8756G>A p.Gln228Lys AhRR chr5 HOM intron_variant 3/11 c.257-107_257106insTGAGAACCGTGGGGTGAA CGCGGGGAAACACAGGAAAGA TGTGAATGAA AhRR chr5 HET 3_prime_UTR_variant 12/12 c.*992A>G CYP1A1 CYP1A1 ARNT ARNT ARNT ARNT ARNT ARNT ARNT chr15 chr15 chr1 chr1 chr1 chr1 chr1 chr1 chr1 HET HET HET HET HET HOM HET HET HET missense_variant missense_variant 3_prime_UTR_variant 3_prime_UTR_variant 3_prime_UTR_variant intron_variant intron_variant intron_variant synonymous_variant 7/7 2/7 22/22 22/22 22/22 15/21 12/21 9/21 7/22 c.1384A>G c.134G>A c.*559_*562dupTGTG c.*562_*563insTGCG c.*512A>G c.1506-52T>A c.1167+103A>G c.870-50T>G c.567G>C HGVS.c 18 HGVS.p p.Arg554Lys Ile462Val Gly45Asp p.Val189Val dbSNP142 _ID rs10249788 rs71010234 rs7796976 rs2074113 rs2066853 rs20219851 rs611697 rs13890223 rs641081 rs76301536 rs18714198 rs1048943 rs4646422 rs71580328 rs71580328 rs11552229 rs3894771 rs3738483 rs10305704 rs2228099 ARNT chr1 ARNT chr1 CYP1B1 chr2 CYP1B1 chr2 CYP1B1 chr2 CYP1B1 chr2 HEMGN chr9 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 CENPF chr1 Chú thích: - HET HET HOM HOM HET HET HET HOM HOM HOM HOM HOM HOM HOM HOM HOM HOM HOM HOM intron_variant intron_variant synonymous_variant missense_variant missense_variant missense_variant missense_variant missense_variant intron_variant intron_variant intron_variant missense_variant missense_variant missense_variant intron_variant intron_variant intron_variant missense_variant missense_variant 6/21 2/21 3/3 3/3 2/3 2/3 4/5 16/20 16/19 16/19 17/19 18/20 20/20 16/20 16/19 16/19 17/19 18/20 20/20 c.486+123A>G c.138-229G>A c.1347T>C c.1294G>C c.355G>T c.142C>G c.966A>C c.8186G>A c.8322+32G>A c.8322+479delT c.8485+66A>G c.8827A>G c.9318C>G c.8186G>A c.8322+32G>A c.8322+479delT c.8485+66A>G c.8827A>G c.9318C>G Asp449Asp Val432Leu Ala119Ser Arg48Gly p.Lys322Asn p.Arg2729Gln p.Arg2943Gly p.Asn3106Lys p.Arg2729Gln p.Arg2943Gly p.Asn3106Lys rs2256355 rs10305673 rs1056837 rs1056836 rs1056827 rs10012 rs335524 rs335523 rs11303309 rs435043 rs438034 rs7289 rs335524 rs335523 rs11303309 rs435043 rs438034 rs7289 Cột (Gene name): tên gen Cột (#Chrom): tên nhiễm sắc thể chứa gen Cột (Zygosity): HOM (thể đồng hợp), HET (thể dị hợp) Cột (Effect): upstream_gene_variant (biến thể ngược hướng – trình tự hướng phía đầu 5’ DNA; 5_prime_UTR_variant (biến thể vùng 5’ không dịch mã); intron_variant (biến thể vùng intron); missense_variant (biến thể làm thay đổi amino aicd); synonymous_variant (biến thể không làm thay đổi amino acid) Cột (Rank/total): exon/tổng số exon gen Cột (HGVS.c): ký hiệu thay đổi nucleotide trình tự mã hóa DNA (c.DNA) Cột (HGVS.p): ký hiệu thay đổi amino acid phân tử protein Ký hiệu chấm (.) cột biểu thị khơng có thay đổi amino acid protein Cột (dbSNP142_ID): mã hiệu đa hình sở liệu dbSNP phiên 142 19 3.3.1 Phân tích biến đổi gen AhR, gen AIP từ kết giải trình tự hệ gen biểu (WES), so sánh với kết giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger Gen AhR (Aryl hydrocarbon receptor) Phát thấy đa hình gen AhR: đa hình (rs10249788, rs71010234) vùng ngược hướng (upstream) Rs7796976 vùng 5’UTR Rs202198518 vùng 3’UTR Rs2074113 intron Rs2066853 exon 10 (Bảng 3.18) Ở phương pháp (WES) giải trình tự phương pháp Sanger mẫu ThN phát thấy đa hình rs2066853 Ngồi ra, từ kết WES mẫu ThN khơng phát thấy đa hình (rs17779352; rs75519181; rs779531731) có đối tượng phơi nhiễm khác Từ kết giải trình tự Sanger 11 exon gen AhR mẫu ThN, không phát thấy đa hình rs10249788, rs71010234 rs7796976, rs202198518, rs2074113 kết WES mẫu ThN Gen AIP (Aryl hydrocarbon receptor interacting) Phát thấy có đa hình: Rs611697 intron 3; Rs138902236 exon 4; Rs64108 exon Hai đa hình rs138902236 rs64108 từ kết WES mẫu ThN xác nhận giải trình tự phương pháp Sanger mẫu ThN Trong đó, đa hình intron (rs611697) chúng tơi khơng phát từ giải trình tự phương pháp Sanger 3.3.2 Phân tích biến đổi di truyền số gen liên quan đƣờng chuyển hóa dioxin thơng qua thụ thể AhR từ kết giải trình tự hệ gen biểu (WES) 20 Gen AhRR (Aryl hydrocarbon Receptor Repressor) AhRR hoạt động chất ức chế đường tín hiệu AHR Có điểm thay đổi vùng khơng mã hóa gen AhRR, đặc biệt có thay đổi thêm nucleotide coi mới, chưa công bố sở liệu dbSNP NCBI Gen CYP1A1 CYP1A1 enzym thuộc hệ thống Cytochrome P450 (CYP) Gen CYP1A1 điều hịa biểu AhR Có đa hình rs4646422 rs1048943 phát từ kết WES Gen ARNT (Aryl hydrocarbon receptor Nuclear Translocator) ARNT protein tham gia vào đường chuyển hóa dioxin thơng qua thụ thể AhR Phát thấy đa hình gen ARNT, đa hình nằm exon rs2228099 Gen CYP1B1 CYP1B1 enzyme chuyển hóa hydrocarbon thơm đa vòng tiền chất sinh ung thư Phát đa hình gen CYP1B1 bao gồm: rs1056836, rs1056837, rs1056827 rs10012 Gen HEMGN (Hemogen) GEMGN biểu đặc trưng mô tế bào tạo máu, có vai trị quan trọng phát triển tạo máu ung thư máu Phát thấy đột biến đổi (c.966A>C, p.Lys322Asn) gen HEMGN Gen CENPF (Centrome protein F) Protein CENPF đóng vai trị quan trọng trình phân bào, liên quan đến nhiều loại ung thư khác Phát thấy có 12 đa hình gen CENPF, đa hình làm thay đổi amino acid 21 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Luận án nghiên cứu Việt Nam tiến hành giải trình tự, phân tích đa hình/đột biến tồn exon gen AhR gen AIP đối tượng phơi nhiễm dioxin người có nồng độ dioxin máu cao Kết nghiên cứu phát thấy đột biến gen AIP (c.124C>A, p.H42N) Xác định đa hình rs138902236 gen AIP rs75519181 AhR, đa hình chưa cơng bố có quần thể người Việt Nam (theo HGVD – Human Genetic Variation Database) Luận án bước đầu nghiên cứu giải trình tồn vùng gen mã hóa đối tượng có nồng độ dioxin tromg máu cao, xác định 40 biến thể di truyền liên quan đến chuyển hóa dioxin Góp phần làm sở cho nghiên cứu mức phân tử ảnh hưởng dioxin chất hữu ô nhiễm môi trường KẾT LUẬN Phân tích đa hình gen AhR Xác định 05 đa hình gen AhR, exon (rs17779352), exon 10 (rs2066853, rs75519181, rs779531731) intron5 (rs3802082) Đa hình rs2066853 có tần suất kiểu gen GG GA khác biệt có ý nghĩa thống kê, nhóm có dioxin máu cao, bị bệnh liên quan dioxin nhóm có dioxin máu cao, khơng bị bệnh liên quan dioxin Đa hình rs2066853 (kiểu gen GA) liên quan đến giảm nguy ung thư người có nồng độ dioxin máu cao Phát thấy đa hình rs75519181 exon 10 Đa hình khơng có quần thể người Việt Nam (theo HGVD - Human Genetic Varition Database), đa hình gen AhR người Việt Nam 22 Phân tích đa hình gen AIP Xác định đa hình gen AIP exon (rs747233720), exon (rs138902236, rs2276020) exon (rs641081) Phát đột biến c.124C>A, p.H42N exon 2, có mẫu nhóm đối tượng nồng độ dioxin máu cao bị bệnh liên quan dioxin Đa hình rs138902236 có nghiên cứu khơng có quần thể người Việt Nam (theo HGVD), đa hình gen AIP người Việt Nam Giải trình tự hệ gen biểu (WES) ngƣời có nồng độ dioxin máu cao Xác định 40 biến thể di truyền gen (AhR, AIP, AhRR, CYP1A1, ARNT, CYP1B1, HEMGN, CENPE) liên quan đường chuyển hóa dioxin thơng qua thụ thể AhR Trong phát thấy đột biến gen AhRR HEMGN Xác định đa hình di truyền gen AhR, có đa hình (rs2066853) trùng với kết giải trình tự phương pháp Sanger (trên mẫu) Xác định đa hình di truyền gen AIP, có đa hình (rs138902236 rs641081) trùng với kết giải trình tự phương pháp Sanger (trên mẫu) KIẾN NGHỊ Mở rộng nghiên cứu cỡ mẫu lớn đa hình rs2066853 gen AhR để đánh giá mối liên quan đa hình nguy bị ảnh hưởng dioxin Tiếp tục nghiên cứu làm rõ thêm đột biến (c.124C>A, p H42N) đa hình rs138902236 gen AIP Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự hệ gen biểu (WES) đối tượng nạn nhân nhiễm dioxin cỡ mẫu lớn để kiểm tra đánh giá biến thể di truyền liên quan đến chế tác động dioixin 23 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lê Thị Kim Dung, Nguyễn Đăng Tôn, Đặng Tiến Trường, Nông Văn Hải, Nguyễn Huy Hoàng (2015), “Nghiên cứu biến đổi gen AIP người có hàm lượng dioxin máu cao”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 13(2), tr 207-212 Nguyen Dang Ton, Nguyen Hai Ha, Vu Phuong Nhung, Pham Nhat Khoi, Huynh Thị Thu Hue, Nguyen Thuy Duong, Le Thị Thu Hien, Le Thi Kim Dung, Nguyen Huy Hoang, Nong Van Hai (2015), Genes alterration in four families of Vietnamese dioxin victim, 35th International Synposium on Halogennated Persistent Organic Pollutants, pp 26-29 Lê Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Huy Hồng, Nơng Văn Hải (2017), “Vai trò thụ thể AhR (Aryl hydrocarbon receptor) ung thư người có nồng độ dioxin cao”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 15(1), tr 1-13 Lê Thị Kim Dung, Nơng Văn Hải, Nguyễn Huy Hồng, Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Ngọc Lan (2017), “Xác định đa hình gen AhR đối tượng phơi nhiễm dioxin”, Tạp chí Y Dược học quân 42, tr 310-315 Bài báo gửi đăng tạp chí “BMC Neurology” Whole-exome sequencing identified two mutation in C9orf152 and MAN1B1 gene in a Vietnamese patient with intellectual disability: a case report Thi Thanh Ngan Nguyen, Thi Kim Lien Nguyen, Thu Hien Nguyen, Ngoc Lan Nguyen, Van Tung Nguyen, Thi Kim Dung Le, Thi Hien Nguyen, Dang Ton Nguyen, Huy Hoang Nguyen, Van Hai Nong 24 25 ... thực đề tài ? ?Nghiên cứu thay đổi gen AhR AIP nạn nhân nhiễm dioxin? ??nhằm mục tiêu sau: (1) Xác định đa hình/đột biến gen AhR AIP người sống vùng phơi nhiễm dioxin người có nồng độ dioxin máu cao;... cam /dioxin Các nghiên cứu điều tra thực trạng, cấu bệnh tật đối tượng nạn nhân dioxin Các nghiên cứu phân tử thay đổi biểu hiện/đột biến số gen đối tượng phơi nhiễm dioxin như: p53, CypP1A1, AhR, ... hình gen CENPF, đa hình làm thay đổi amino acid 21 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Luận án nghiên cứu Việt Nam tiến hành giải trình tự, phân tích đa hình/đột biến tồn exon gen AhR gen AIP