Luận án xác định sự thay đổi của HIP, EGFR ở mức độ mRNA và Protein tại mô ung thư vú so với u xơ tuyến vú lành; khảo sát sự thay đổi của HIP, EGFR ở mức độ mRNA và Protein trong các thể ung thư vú phân loại theo mô bệnh học.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG I HC Y H NI Đặng thị tuyết minh nghiên cứu thay đổi heparansulfate interacting protein (HIP) Vμ epidermal growth factor receptor (EGFR) ë m« ung th− vó Chuyên ngành : Hóa sinh Y học Mã số : 62.72.04.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2010 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI : TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Nguyễn Thị Hà PHẢN BIỆN 1: GS TSKH Đái Duy Ban - Viện cộng nghệ sinh học PHẢN BIỆN 2: PGS TS Bạch Vọng Hải - Học viện quân Y PHẢN BIỆN 3: PGS TS Ngô Thị Thu Thoa - Bệnh viện K Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp Trường Trường Đại học Y Hà Nội Vào 15 ngày 19 tháng 11 năm 2010 CĨ THỂ TÌM HIỂU LUẬN ÁN TẠI - Thư viện Quốc gia - Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội - Viện Thông tin – Thư viện Y học Trung ương MỘT SỐ CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tạ Thành Văn, Đặng Thị Tuyết Minh (2006), “Heparansunfate interacting protein (HIP) điều hòa phát triển tế bào thông qua mitogen – activated protein kinase (MAPK)”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 3(20), tr 49-54 Đặng Thị Tuyết Minh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (2008), “Tăng cường chép Heparansunfate interacting protein (HIP) mơ ung thư vú”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, số 53(1), tr 8-15 Đặng Thị Tuyết Minh, Trần Văn Khánh, Trần Thị Chính, Tạ Thành Văn (2008), “Đánh giá mức độ chép mRNA EGFR mơ ung thư vú”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, số 59(6), tr 29-33 Đặng Thị Tuyết Minh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (2009), “Đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư vú theo giai đoạn thể tế bào học khác nhau”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 354 (1), tr 27-32 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Ung th− vó (UTV), mét bƯnh ung th− hay gỈp phụ nữ v l nguyên nhân hng u gây tử vong ung th phụ nữ ton giới Năm 2006, UTV l loại ung th thờng gặp phụ nữ Hoa K v Châu ¢u Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh UTV có xu hướng tăng dần năm gần UTV loại thường gặp phụ nữ Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh UTV có xu hướng tăng lên tỷ lệ tử vong lại giảm dần nhờ thành tựu đạt việc phát sớm, chẩn đốn xác điều trị có hiệu HiÖn bên cạnh phương pháp áp dụng chẩn đoán điều trị UTV, nh khoa học ó v sâu vo nghiên cứu gen, marker ung th đặc hiệu có nhãm protein mμng tÕ bμo nhằm góp phần chẩn đoán sớm mc sinh hc phân tử Tiến khoa học kỹ thuật, đặc biệt lĩnh vực sinh học phân tử thập kỷ gần cho phép sâu nghiên cứu đặc điểm sinh học, cấu trúc chức nhóm protein Những chứng khoa học chứng minh có tăng cường biĨu hiƯn Heparansulfate Interacting Protein (HIP) vμ Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) mức độ mRNA protein số loại hình ung thư Kết mở triển vọng nghiên cứu ứng dụng HIP vμ EGFR marker ung thư để góp phần chẩn đo¸n sớm, tiªn lượng theo dõi điều trị bệnh lý ung th Mc tiờu ti Xác định sù thay ®ỉi cđa HIP, EGFR ë møc ®é mRNA vμ protein m« ung th− vó (so víi u x¬ tuyÕn vú lμnh tÝnh) Khảo sát thay đổi HIP, EGFR ë møc ®é mRNA vμ protein thể ung thư vú phân loại theo mô bệnh học Ý nghĩa thực tiễn đóng góp đề tài Ung thư coi bệnh nan y bệnh tiến triển tuần tiến khó kiểm sốt; chế bệnh học chưa rõ ràng nhiều trường hợp, khả can thiệp người thầy thuốc hạn chế Một giải pháp can thiệp hiệu bệnh chẩn đoán sớm điều trị can thiệp sớm Đây nghiên cứu Việt Nam HIP vμ EGFR bệnh nhân ung thư vú Những kết nghiên cứu cho thấy mức độ chép mRNA biểu lộ protein HIP, EGFR tăng rõ rệt ung thư biểu mô tuyến vú, ung thư biểu mô tuyến vủ thể ống Trên sở phát này, HIP EGFR không marker chẩn đốn ung thư vú mà xem đích đầy hứa hẹn (khâu then chốt) liệu pháp điều trị nhằm ngăn chặn dòng thác tín hiệu truyền vào tế bào Cấu trúc luận án Luận án trình bày 111 trang (khơng kể tài liệu tham khảo phụ lục), bao gồm phần: đặt vấn đề (3 trang); tổng quan tài liệu (31 trang); đối tượng phương pháp nghiên cứu (18 trang); kết nghiên cứu (28 trang); bàn luận (29 trang); kết luận (1 trang); kiến nghị (1 trang) Luận án gồm 11 bảng, biểu đồ, 39 hình Trong 128 tài liệu tham khảo có 23 tài liệu tiếng Việt, 105 tài liệu tiếng Anh Phụ lục gồm bảng kết tách chiết RNA, đậm độ vạch HIP, EGFR GAPDH, danh sách bệnh nhân CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.3 Ung thư vó Ung thư vú (UTV) lμ u ¸c tÝnh ph¸t sinh tõ c¸c tế bo biểu mô ống tuyến vú (sinh sữa v dẫn sữa) Các đơn vị mô có chức sản xuất sữa đợc gọi l đơn vị ống tận - tiÓu thuú (èng tËn cïng - tiÓu thuú tuyÕn) Trong vùng ny tế bo trở nên bất thờng vμ cã thĨ tiÕn triĨn thμnh UTV UTV liªn quan chặt chẽ với hoạt động tuyến nội tiết nªn gäi lμ bƯnh phơ thc néi tiÕt 1.1.4 Các phương pháp chẩn đoán ung thư vú Các phương pháp chẩn đốn UTV chơp phim X quang với sù tËp trung vμo c¸c vïng nghi ngê, siêu âm sử dụng sóng âm tần số cao để xác định rõ vùng nghi ngờ vú Siêu âm không gây đau v phân biệt tổn thơng lnh tính v ác tính Cho đến nay, sinh thiÕt lμ c¸ch nhÊt để chẩn đoán xác định UTV Tuy nhiên, điều quan trọng phải chẩn đoán phân biệt u xơ tuyến vú UTV U x¬ tun lμ mét thĨ lμnh tÝnh bệnh vú, thờng l u đặc đơn độc (chỉ có u) mô xơ v tuyến Loại u nμy rÊt phỉ biÕn ë phơ n÷ mäi løa ti, nh−ng u phỉ biÕn h¬n ë løa ti 15 - 35 tuổi Nếu u đợc phát phụ nữ trẻ, lý tâm lý, họ thờng muốn đợc theo dõi Nu u c phỏt hin phơ n÷ lớn tuổi dù u lành tính nên phẫu thuật cắt bỏ u Chính vậy, việc xác định trường hợp u xơ tuyến hay UTV thách thức nhà tế bào học Hơn nữa, thông thường tế bào ung thư phát khối u thành hình rõ, vào thời điểm hiệu can thiệp bị hạn chế Bởi vậy, năm gần nhiều nhà nghiên cứu nghĩ đến xu hướng sử dụng kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử nhằm phát biến đổi gen sớm trước có biến đổi hình thái tế bào Việc tìm hiểu biến đổi gen trình phát sinh ung thư cần thiết giúp tìm dấu ấn ung thư mới, góp phần chẩn đốn sớm bệnh ung thư 1.2.3 Cấu trúc HIP * Cấu trúc chức sinh học HIP HIP thuộc nhóm protein gắn với ribosom L29, liên quan đến dịch mã tế bào có nhân Khoảng 80% trình tự nucleotid protein HIP giống L29, mRNA HIP có chiều dài 1,3 kb DNA HIP mã hóa 159 acid amin có trọng lượng phân tử khoảng 24 kDa, pI 11,75 Một số chức sinh học HIP công bố: (1) Gắn đặc hiệu chọn lọc với heparin/heparansulfate (HP/HS); (2 Tham gia trình liên kết tế bào - tế bào để qua tham gia q trình làm tổ trứng, q trình phát triển, biệt hố di tế bào; (3) Tham gia điều hoà trình đơng máu Khi HIP giảm tổng hợp bị loại bỏ hoàn toàn, ảnh hưởng trầm trọng đến trình phiên mã hậu làm cho mức độ sinh tổng hợp protein tất tế bào quan bị giảm nghiêm trọng * Vai trò HIP ung thư Sự tổng hợp “dư thừa” HIP mơ ung thư giải phóng mạnh mẽ yếu tố phát triển tế bào lưu giữ khoảng gian bào Thơng qua đường tín hiệu MAPK, yếu tố phát triển tác động vào thụ thể bề mặt tế bào để thông qua đường tín hiệu thơng tin truyền từ khoảng gian bào vào nhân để thúc đẩy trình phân bào Điều cho thấy HIP thuộc nhóm tác nhân hoạt hóa trình khởi phát phát triển ung thư Con đường tín hiệu mà HIP tham gia mắt xích quan trọng góp phần lý giải thêm chế trình hình thành phân chia, biệt hóa phát triển vơ hạn độ tế bào ung thư Đa số thể loại ung thư ung thư biểu mơ, dòng tế bào biểu mơ dòng tế bào có tổng hợp HIP cao hẳn so với dòng tế bào khác dòng tế bào sợi Cấu trúc khoảng gian bào khối u khác biệt hồn tồn so với mơ bình thường thành phần HS/HP phong phú chủng loại lượng yếu tố phát triển Thêm vào đó, tăng sinh mạch (angiogenesis) khối u khiến cho số lượng tế bào nội mạc (dòng tế bào có mức độ chép HIP mạnh) mô sinh thiết cao nhiều so với mô u xơ Tất điều dẫn đến kết tăng cường tổng hợp HIP tăng cường mạnh khối u ung thư so với tổ chức lành tính khác, khối u xơ 1.2.4 Cấu trúc chức EGFR * Cấu trúc thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) EGFR lμ glycoprotein bỊ mỈt mμng, gia đình EGFR có bốn thành viên: HER1 (EGFr, ErbB1), HER2 (neu, ErbB2), HER3 (ErbB3) HER4 (ErbB4) Träng lượng ph©n tư EGFR là170 kDaltons (kDa), gồm vùng gắn kết phối tử nằm ngoi mng tế bo, vùng xuyên mng đặc hiệu vμ mét vïng tế bào víi vai trß kÝch thích tăng sinh, biệt hoá tế bo bình thường vμ c¸c tÕ bμo ¸c tÝnh Khi phối tử yếu tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor: EGF) gn với EGFR gây nên phân cực thụ thể v tự phosphoryl hoá vùng có hoạt tính enzym ca th th Điều ny khởi đầu cho loạt phản ứng tế bo dẫn đến tăng sinh v tiến triển ác tính khối u: tăng sinh mạch máu, di v ức chế tr×nh chÕt theo chương tr×nh (apotosis) * Chức thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) Các EGFR có phần để liên kết ngồi màng, phần xun màng phần bào tương có hoạt tính tyrosin kinase Phần ngồi màng, vùng III (domain III) vùng để gắn kết yếu tố hoạt hóa hay ức chế thụ thể, để dẫn truyền tín hiệu vào tế bào làm tế bào phát triển bình thường trở nên ác tính Phần bào tương, đầu tận carboxy phần đáp ứng trả lời hoạt tính tyrosin kinase điều hòa chức tyrosin kinase Phản ứng tự phosphoryl hóa tyrosin kinase xảy vùng đóng vai trò điều hòa phát triển tăng sinh tế bào Khi vắng mặt phối tử (ví dụ GF,TGF…), vùng tyrosin kinase khơng phosphoryl hóa, chúng dạng đơn phân vùng kinase không hoạt động Vùng tyrosin kinase trở nên hoạt hóa phối tử gắn với vùng ngoại bào kết làm phân cực để lộ gốc phosphat tự phosphoryl hóa tyrosin điều hòa vòng hoạt hóa kinase Sau hoạt hóa, việc tự phosphoryl hóa để lộ vị trí gắn kết protein tín hiệu hoạt hóa đường tín hiệu * Thụ thể yếu tố phát triển biểu mơ (EGFR) đích điều trị ung thư Tăng hoạt tính EGFR thúc đẩy khă di tế bào ung thư Sự gia tăng biểu lộ 22 độ chép gen EGFR khác Các đỉnh sản phẩm PCR EGFR tăng cao rõ rệt GĐ III, giảm dần GĐ II thấp GĐ I Kết tương đồng với kết PCR bán định lượng sản phẩm PCR gen EGFR Đỉnh sản phẩm PCR GAPDH đồng mẫu mơ UTBM u xơ vú, khơng có khác biệt 3.4.3 Kết chÐp mRNA EGFR m« ung th− vó giai đoạn II theo phân lo¹i mơ bệnh học * Hình ảnh điện di gel agarose U xơ Thể tủy Thể tiểu thùy Thể ống 10 11 12 13 Thể nhày 14 15 16 17 18 M EGFR 420 bp GAPDH 350 bp Hình 3.17 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR EGFR vμ GAPDH mô ung th vú G II theo phân loại mô bệnh học ống trờn gel agarose 1,5% U xơ vó (1-3); thĨ tủ (4-6), thĨ tiĨu th (7-10), thĨ ống (11-15), thÓ nhày (16-18) M (Marker): thang DNA chuÈn 100 bp Nhận xét: Đậm độ vạch sản phẩm PCR EGFR mẫu mô ung thư GĐ II rõ hai thể nhày thể ống, thấp hai thể tiểu thùy thể tủy Trong đậm độ vạch PCR GAPDH đồng đều, khơng có khác biệt mẫu mơ UTBM thể mơ bệnh học B¶ng 3.9 Giá trị trung bình đậm độ vạch PCR EGFR ca mu ung th vú giai đoạn II theo phõn loi mụ bnh hc 23 Loại mô học SL mẫu ĐĐ v¹ch EGFR TB (đơn vi pixel) ± SD Ung thư Thể Thể tiểu ống thùy 16 U x¬ Thể tủy 15 100 154 168 191 207 ± 11 ±4 ± 47 ± 33 ± 10 Thể nhày Nhận xét: Đậm độ vạch mRNA trung bình EGFR mẫu mô ung thư GĐ II cao hai thể nhày thể ống: 191 207, hai thể tiểu thùy thể tủy: 168 154 * Hình ảnh điện di mao quản M M M M Thể tủy GAPDH Thể tiểu thùy GAPDH M M M MS 28725-06 EGFR GAPDH M M GAPDH M M M M MS 48118-07 M EGFR M M MS 29259-06 MS 33297-06 M M EGFR EGFR EGFR M M M M M EGFR M EGFR EGFR Thể ống Thể nhày GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH M M M M M M MS 27757-06 M M MS 51901-06 MS 28831-06 MS 24453-06 Hình 3.18 Hình ảnh điện di mao quản sản phẩm PCR EGFR GAPDH theo thể mô bệnh học Nhận xét: 24 - Trên hình ảnh điện di mao quản, mẫu mô UTBM tuyến vú giai đoạn II thể mơ bệnh học khác có mức độ chép gen EGFR khác Các đỉnh sản phẩm PCR EGFR tăng cao rõ rệt UTV thể nhày thể ống, thấp UTV thể tiểu thùy thấp UTV thể tủy Đỉnh sản phẩm PCR GAPDH đồng mẫu mơ UTBM tuyến vú, khơng có khác biệt thể mô bệnh học Kết tương đồng với kết PCR bán định lượng gen EGFR 3.4.4 Đánh giá tỷ lệ EGFR/GAPDH mẫu nghiên cứu định lượng điện di mao quản B¶ng 3.10 Giá trị t l EGFR/GAPDH trờn in di mao quản Loại mô học U xơ Ung thư Số lượng mẫu 14 Tỷ lệ 0,73 1,09 EGFR/GAPDH SD ± 0,09 ± 0,25 Nhận xét:Tỷ lệ EGFR/GAPDH mẫu mô UTV cao rõ so với mẫu mô u xơ tuyến vú Tỷ lệ EGFR/GAPDH mẫu mô nghiên cứu khẳng định EGFR tăng cường chép mô ung thư 3.4.5 Mức độ biểu lộ EGFR mô u xơ vú mô ung thư biểu mơ tuyến vú Ngồi kỹ thuật Western blot xác định mức độ biểu lộ protein tách chiết từ mô tươi mơ sinh thiết, kỹ thuật hóa mơ miễn dịch sử dụng để xác định mức độ biểu lộ protein mô lưu trữ block paraffin 25 Bảng 3.11 Sự biểu EGFR mẫu mô nghiên cứu Mức độ Số trường Tỷ lệ % hợp 21 33,9 1+ 17 27,4 2+ 10 16,2 3+ 14 22,5 Tổng 62 100 Nhận xét: EGFR dương tính chiếm 38,7%, dương tính mạnh chiếm 22,5% A B A Hình 3.21 UTBM ống nhuộm HMMD với EGFR dương tí (+) Mã số GFB: 30681-06 B Hình 3.22 UTBM ống nhuộm HMMD với EGFR dương tính 2(+) Mã số GFB 35498 - 06 HMMD x 200 A B A.Hình 3.23 UTBM thể tiểu thùy nhuộm HMMD với EGFR dương tính 2(+) Mã số GFB Mã số GFB: 30128 06 B Hình 3.24 UTBM thể tủy nhuộm HMMD với EGFR dương tính 2(+) Mã số: 30329 - 06 HMMD x 200 26 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.3 XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THAY ĐỔI GEN HIP TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ * Mức độ chép mRNA HIP mô u xơ vú mô ung thư biểu mô tuyến vú Kết quan sát đậm độ vạch PCR sau điện di gel agarose cho thấy mẫu mô ung thư vạch xuất rõ nhiều so với mẫu mơ u xơ vú (hình 3.3) Điều chứng tỏ mô ung thư HIP tăng cường chép, sản phẩm chép gen mô u xơ vú yếu rõ rệt Kết phù hợp với nghiên cứu trước tác giả chứng minh mRNA HIP tăng cường chép mạnh dòng ung thư biểu mơ dòng tế bào sợi, đặc biệt dòng tế bào biểu mơ ác tính, chưa biệt hóa Sự tăng cường chép HIP mô ung thư biểu mô tuyến vú so với u xơ vú chứng tỏ HIP có ý nghĩa loại hình ung thư Một câu hỏi đặt ra: mức độ chép HIP thể loại mơ bệnh học có khác có phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển khối u hay không? Chúng tiến hành khuếch đại đoạn gen HIP 36 mẫu mô ung thư vú thể ống ba giai đoạn tiến hành so sánh với mẫu u xơ vú đối chứng Kết bước đầu cho thấy HIP tăng cường chép mô ung thư biểu mô thể ống xuất mẫu mơ u xơ lành tính Các mẫu mơ ung thư giai đoạn khác chép HIP 27 mức độ khác Đậm độ vạch mẫu ung thư giai đoạn III có giá trị cao giảm mẫu ung thư giai đoạn trước (giai đoạn II giai đoạn I) (hình 3.5) Đậm độ vạch PCR HIP GAPDH xác định sử dụng phần mềm iChemidocQ, 76SOO530 Kết bảng 3.3, đậm độ vạch trung bình mẫu mơ u xơ vú 131 (đơn vị pixel) mô ung thư vú thể ống theo giai đoạn từ I- II III 173, 199 221 Điều khẳng định lần khác biệt rõ rệt mức độ chép HIP ung thư biểu mô tuyến vú so với u xơ vú Thêm vào đó, loại mô bệnh học, khác biệt rõ rệt theo giai đoạn tiến triển bệnh Kết tương tự phân tích định lượng máy Agilent 2100 Bionalyzer (hình 3.4), đỉnh HIP mẫu mô ung thư cao rõ rệt so với mẫu mơ u xơ, có khác biệt giai đoạn UTBM tuyến vú thể ống, đỉnh GAPDH đồng mẫu u xơ UTBM tuyến vú thể ống giai đoạn (hình 3.6) Kết RT-PCR bán định lượng định lượng gen HIP điện di mao quản ln có tương đồng Nếu nghiên cứu với số lượng mẫu đủ lớn, đưa giá trị cut-off HIP ung thư vú nói riêng ung thư nói chung ứng dụng giá trị chẩn đốn, theo dõi điều trị bệnh nhân ung thư * Mức độ chép mRNA protein HIP thể mô bệnh học khác ung thư vú giai đoạn lâm sàng Kết nghiên cứu 27 mẫu mô ung thư vú giai đoạn gồm thể ống, thể nhày, thể tiểu thùy thể tủy cho thấy đậm độ vạch PCR điện di gel agarose 1,5% 28 tăng thể ống thể nhày giảm thể tiểu thùy thể tủy Giá trị trung bình đậm độ vạch PCR cao thể nhày (254) giảm dần từ thể ống (199), thể tiểu thùy (174) thấp thể tủy (141), (biểu đồ 3.2) Cũng nghiên cứu này, kết biểu gen HIP thể nhày cao nhất, phải thực tế chẩn đoán ung thư vú, bệnh nhân ung thư vú thể nhày đơn gặp thể nhày phối hợp với thể khác đặc biệt thể ống hay gặp hơn, nên biểu gen HIP ba mẫu thể nhày tăng so với thể khác Với kết nghiên cứu, cho thấy biểu HIP thay đổi theo giai đoạn ung thư mà có khác biệt thể mô bệnh học HIP tăng cường tổng hợp thể mơ bệnh học có độ ác tính cao giảm thể độ ác tính thấp Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu tác giả nước Theo Carson D cộng sự, biểu HIP phụ thuộc vào độ ác tính tế bào ung thư vú Ở dòng tế bào ung thư có độ ác tính di cao biểu HIP tăng cường dòng tế bào có độ ác tính thấp.Việc phát biểu gen HIP thể mô bệnh học ung thư vú tiến hành đồng thời song song hai kỹ thuật bán định lượng định lượng điện di mao quản nhằm so sánh đánh giá tương đồng kết hai kỹ thuật Gen GAPDH coi gen nội chuẩn, chép gen không không phụ thuộc vào chu kỳ phân chia q trình biệt hóa tế bào mà khơng có tính đặc hiệu tế bào đặc hiệu tổ chức Tỷ lệ HIP/GAPDH (bảng 3.5) mẫu u xơ tuyến vú 0,40 thấp rõ rệt so với mẫu UTBM tuyến vú 1,26 - minh 29 chứng bổ xung cho biểu lộ gen HIP mẫu mô nghiên cứu Kết cho thấy hai phương pháp có kết tương đồng độ nhạy có khác Điều có ý nghĩa thực tiễn lẽ HIP sử dụng dấu ấn sinh học chẩn đoán tiên lượng ung thư vú tiến hành bán định lượng phòng xét nghiệm có thiết bị đơn giản định lượng mẫu phòng xét nghiệm có trang thiết bị tốt Kỹ thuật Western blot sử dụng để xác định mức độ biểu lộ protein HIP Kháng thể đặc hiệu kháng HIP sử dụng nghiên cứu nhóm nghiên cứu sản xuất [1] Nhóm tác giả tổng hợp kháng thể kháng HIP người từ thỏ theo quy trình chuẩn sử dụng phân đoạn peptid HIP đặc hiệu có chiều dài 16 acid amin liên kết với protein mang (KLH) Lượng protein tổng số cho vào giếng điện di kỹ thuật Western blot xác định mức độ biểu protein HIP 1,5μg Trong q trình làm ln chạy song song hai gel, gel dùng chuyển màng để làm Western blot, nhuộm protein với Coomasie blue G250 để làm đối chứng.Bản gel polyacrylamid 12% sau chạy điện di nhuộm Coomasie blue, xuất vệt protein với trọng lượng phân tử khác (hình 3.9) Khơng có khác biệt phân bố đậm độ vệt protein mẫu mô ung thư u xơ tuyến vú Kết cho thấy đồng lượng protein tổng số tách chiết sử dụng giếng điện di làm sở cho so sánh tính tỷ lệ HIP/tổng lượng protein tồn phần Trong gel polyacrylamid 12%, chuyển màng nitrocellulose, sử dụng kỹ thuật Western blot cho 30 thấy vạch protein HIP vạch rõ nét nhất, chứng tỏ kháng thể thu có độ đặc hiệu cao (hình 3.10, hình 3.11, hình 3.12) Vạch protein HIP có trọng lượng phân tử 24 kD quan sát rõ mẫu mô ung thư vú so với mẫu u xơ Đậm độ vạch thay đổi theo giai đoạn ung thư vú thể ống với khuynh hướng tăng dần từ giai đoạn I đến giai đoạn III Vạch protein HIP biểu rõ ung thư vú thể ống, thể nhày, thấp thể tiểu thùy thể tủy Kết khảo sát mức độ biểu protein HIP thể loại tế bào học khác giai đoạn tiến triển khác mô ung thư vú tương đồng với kết chép mRNA HIP mô Phát phù hợp với nhận định Jacobs cộng chép biểu HIP dòng tế bào: biểu HIP mức độ khác dòng tế bào ung thư đặc biệt tăng cường dòng tế bào có độ ác tính di cao 4.4 XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THAY ĐỔI GEN EGFR TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ * Mức độ chép mRNA EGFR u xơ vú so với mô ung thư biểu mô tuyến vú Trong nghiên cứu này, mức độ chép mRNA EGFR mô ung thư vú khảo sát cách có hệ thống Hình ảnh điện di gel agarose (hình 3.13) cho thấy, sản phẩm PCR đoạn gen EGFR xuất băng tương ứng với vị trí 420 bp Đó sản phẩm PCR đoạn gen EGFR cần khuếch đại Như vậy, điều kiện phản ứng RT-PCR (như mô tả phần phương pháp) để nhân đoạn gen EGFR hồn tồn thích hợp Cũng gen HIP, sau nhiều 31 phản ứng thăm dò, nồng độ cDNA đưa vào phản ứng PCR khuếch đại gen EGFR 800 ng đảm bảo tương đương mu Kết cho thấy, EGFR đợc tăng cờng chép mô ung th biểu mô tuyến vú nhng EGFR xuất mô u xơ vú Sự tăng cờng chép gen EGFR cũn thay đổi theo giai đoạn ung th vú thể ống, tăng dần từ giai đoạn I đến giai đoạn III (hình 3.15) Điều khẳng định lần khác biệt rõ rệt mức độ chép EGFR ung thư biểu mơ tuyến vú có khác biệt rõ so với u xơ vú Sự khác biệt loại mô học, theo giai đoạn bệnh lâm sàng có khác biệt rõ rệt chép EGFR tăng theo giai đoạn bệnh lâm sàng Cũng giống gen HIP, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật điện di mao quản bước đầu khảo sát tương đồng với kết RT-PCR bán định lượng Kết điện di mao xác định giá trị gen EGFR gen GAPDH cho kết tương đồng với RT-PCR bán định lượng Đỉnh GAPDH đồng mẫu ung thư u xơ, khác biệt rõ mẫu u xơ ung thư vú đỉnh EGFR tăng cao mẫu mô ung thư, tăng theo giai đoạn ung thư thể ống đỉnh EGFR mẫu mô u xơ thấp rõ rệt điện di mao quản (hình 3.14; 3.16) Kết phù hợp với kết luận Kersting C rằng: khuếch đại gen EGFR có liên quan chặt chẽ với trình phát triển khối u theo giai đoạn lâm sàng * Mức độ chép mRNA EGFR mô ung thư vú giai đoạn lâm sàng th mụ hc khỏc 32 Sự tăng cờng chép gen EGFR có thay đổi khác thể loại tế bo học khác giai đoạn II ung th biểu mô tuyến vú hay không? Trong nghiên cứu này, 27 mẫu mô ung thư vú giai đoạn II lâm sàng, gồm thể ống, thể nhày, thể tiểu thùy thể tủy phân tích Kết nghiên cứu cho thấy đậm độ vạch PCR mRNA EGFR điện di gel agarose (hình 3.17), tương tự mRNA HIP tăng thể ống thể nhày giảm thể tiểu thùy thể tủy Tính trung bình đậm độ vạch PCR (đơn vị pixel) thể giảm từ thể nhày (207), đến thể ống (191), thể tiểu thùy (168) thấp thể tủy (154) Việc phát biểu gen EGFR thể mô bệnh học ung thư vú tiến hành đồng thời song song với phương pháp định lượng máy Agilent 2100 Bioanalyzer, kết điện di mao quản cho kết tương đồng, mẫu mô ung thư thể mô bệnh học khác biểu EGFR khác nhau, đỉnh EGRR cao thể nhày thể ống giảm dần thể tiểu thùy thể tủy Kết nghiên cứu cho thấy biểu EGFR HIP thay đổi theo giai đoạn ung thư mà có khác biệt thể mơ học Cũng gen HIP, kết thăm dò ban đầu xác định nồng độ gen EGFR với 14 mẫu ung thư mẫu u xơ, giá trị tỷ lệ EGFR/GAPDH mẫu mô UTBM tuyến vú 1,09 ± 0,25 cao hẳn so với mẫu u xơ 0,73 ± 0,09 (bảng 3.10), kết laàn chứng minh cho biểu lộ gen EGFR mẫu mơ nghiên cứu ln có tăng cường mô UTBM tuyến vú Sự thành công bước đầu nghiên cứu tạo tiền đề 33 cho việc nghiên cứu xác định ngưỡng cut-off gen HIP gen EGFR để ứng dụng chẩn đoán, theo dõi điều trị ung thư nói chung ung thư vú nói riêng lâm sàng * Mức độ biểu protein EGFR ung thư biểu mơ tuyến vú Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch thực để đánh giá mức độ biểu lộ protein mô lưu trữ block paraffin mô ung thư biểu mô tuyến vú Mức độ biểu EGFR cao mô ung thư, khơng có biểu EGFR mơ u xơ Kết tương đồng với kết Meche A cộng sự: EGFR biểu mơ ung thư khơng có biểu mơ u xơ tuyến vú khối u có tượng sản tế bào tuyến vú Sự biểu thể mô bệnh học giai đoạn khơng có khác nhiều Trong nghiên cứu ba mẫu ung thu vú thể nhày tế bào bắt màu nâu mức độ độ (được coi có kết âm tính) Tại lại có khác mức độ khuyếch đại gen bộc lộ protein EGFR? Thơng thường biểu sản phẩm protein tương ứng với khuyếch đại gen Tuy nhiên, nhiều giả thuyết cho khuyếch đại gen gia đình EGFR liên quan trực tiếp đến tính chất ung thư biểu thụ thể EGFR - tức sản phẩm protein gen Thêm nữa, gen mã hóa protein EGFR thường bị khuyếch đại có biểu mức protein này, ngược lại biểu protein lúc tương ứng với khuyếch đại gen Điều tương tự kết nghiên cứu biểu gen EGFR thể nhày cao 34 bốn thể mô bệnh học ung thư vú mẫu mô nghiên cứu biểu sản phẩm gen protein thấp Các kết nghiên cứu cho tranh tổng thể chế phân tử HIP, EGF EGFR bệnh sinh ung thư vú Như tác động tác nhân hoạt hóa q trình chép phiên mã HIP tế bào, sau HIP vận chuyển “tích cực” bề mặt ngồi tế bào để cạnh tranh với vị trí gắn EGF vị trí đặc hiệu HP/HS EGF giải phóng gắn với thụ thể (EGFR) bề mặt tế bào để khởi động đường tín hiệu (MAPK) vào nhân thúc đẩy q trình phân chia biệt hóa tế bào Thêm vào đó, HIP tác động trực tiếp thúc đẩy trình phiên mã protein đích đặc hiệu q trình bệnh học ung thư dấu ấn ung thư đặc hiệu bề mặt màng Điều chứng tỏ HIP chưa phải điểm đầu đường tín hiệu để khởi phát phát triển bất thường tế bào tiền đề trình khởi phát ung thư? Vậy phải HIP có mối liên hệ với gen ung thư? với tác nhân gây đột biến hay yếu tố tham gia trình sửa chữa DNA? Sẽ cần có nhiều nghiên cứu trả lời câu hỏi Song cho dù kết nghiên cứu cho thấy vai trò HIP, EGFR bệnh học phân tử ung thư biểu mô tuyến vú, mở triển vọng ứng dụng HIP EGFR không marker chẩn đốn ung thư vú mà là đích đầy hứa hẹn cho liệu pháp phân tử trị nhằm ngăn chặn dòng thác 35 tín hiệu truyền vào tế bào mà HIP EGFR khâu then chốt KẾT LUẬN Qua nghiên cứu đánh giá mức độ chép mRNA biểu protein tương tác với heparansulfat (HIP) thụ thể yếu tố phát triển biểu mô 47 mẫu mô ung thư biểu mô tuyến vú 15 mẫu mô u xơ tuyến vú chúng tơi có kết luận sau : Mức độ chép mRNA biểu protein HIP EGFR + Mức độ chép mRNA biểu protein HIP EGFR mô UTBM tuyến vú cao so với mô u xơ tuyến vú tăng theo giai đoạn tiến triển ung thư vú thể ống + Tỷ lệ HIP/GAPDH mẫu ung thư là: 1,27 ± 0,44 cao hẳn so với mẫu u xơ tuyến vú 0,40 ± 0,10 Tỷ lệ EGFR/GAPDH mẫu ung thư 1,09 ± 0,25 cao so với mẫu u xơ tuyến vú 0,73 ± 0,09 Ở giai đoạn II UTBM tuyến vú: + Mức độ chép mRNA biểu protein HIP phụ thuộc vào thể mô bệnh học: tăng cao UTV thể ống thể nhày, thấp dần UTV thể tiểu thùy thể tủy + Mức độ chép mRNA EGFR tăng cao UTV thể ống, thể nhày, thấp dần UTV thể tiểu thùy thể tủy Mức độ biểu protein EGFR: kết HMMD tỷ lệ (+) cao UTV thể ống, thấp thể tiểu thùy, thể tủy thể nhày 36 KIẾN NGHỊ Trong điều kiện với xét nghiệm mô bệnh học (tiêu mô bệnh học soi kính hiển vi quang học) nên kết hợp xét nghiệm đánh giá mức độ biểu thị HIP EGFR chẩn đoán sinh học phân tử để có thêm thơng tin mức độ phân tử chẩn đoán tiên lượng bệnh theo dõi hiệu điều trị bệnh ung thư vú ... MỨC ĐỘ THAY ĐỔI GEN HIP TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ * Mức độ chép mRNA HIP mô u xơ vú mô ung thư biểu mô tuyến vú Kết quan sát đậm độ vạch PCR sau điện di gel agarose cho th y mẫu mô ung thư. .. mô ung thư 3.3.5 Mức độ biểu protein HIP mô u xơ vú mô ung thư biểu mô tuyến vú U xơ Ung thư 10 11 M kDa 100 70 55 35 27 17 Hình 3.9 Hình ảnh điện di SDS-PAGE protein tổng số mô u xơ mô ung thư. .. sớm Đ y nghiên cứu Việt Nam HIP vμ EGFR bệnh nhân ung thư vú Những kết nghiên cứu cho th y mức độ chép mRNA biểu lộ protein HIP, EGFR tăng rõ rệt ung thư biểu mô tuyến vú, ung thư biểu mô tuyến