Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu vi nấm kháng bệnh trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng

Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn được một số chủng vi nấm có hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao gây bệnh trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. và tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng làm tăng năng suất cây Hồ tiêu tối thiểu là 15%. Tạo được chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 3 lần so với chủng tự nhiên.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ CHU THANH BÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Bùi Thị Việt Hà TS Hồ Tuyên Phản biện: Phản biện: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp vào hồi ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Tuyến trùng ký sinh thực vật (Plant-parasitic nematodes PPN) gây bệnh hàng loạt loại rau, nông nghiệp, công nghiệp Mỗi năm ƣớc tính gây thiệt hại trị giá 157 tỷ USD toàn giới Trong nhiều thập kỷ, việc kiểm soát tuyến trùng phụ thuộc nhiều vào chất hóa học nhƣ Furadan, Marshal, Oncol, Nokap, Vimoca… với hiệu làm giảm mật số tuyến trùng nhƣng vƣờn bị bệnh phải áp dụng thuốc thời gian dài Hơn nữa, sử dụng thuốc hóa học chƣa mang lại hiệu cao thƣờng dẫn tới khả kháng thuốc, cân hệ vi sinh vật có lợi vi sinh vật đất Hiện nay, số chất hóa học bị rút khỏi danh mục thuốc bảo vệ thực vật đƣợc sử dụng độc tính chúng động vật sức khỏe ngƣời Hiệu luân canh trồng bị hạn chế số hệ thống trồng phạm vi vật chủ rộng tỷ lệ sống lâu dài hầu hết PPN Hơn nữa, đa dạng di truyền cao trong/giữa quần thể tuyến trùng làm hạn chế hiệu loại trồng kháng bệnh tuyến trùng gây nên Do đó, sản xuất trồng tồn cầu bị đe dọa nặng nề từ PPNs Cùng với việc phát triển biện pháp kiểm soát sinh học, vi sinh vật tiêu diệt tuyến trùng nói chung nấm sợi nói riêng đƣợc coi nhƣ cách tiếp cận đầy hứa hẹn để kiểm sốt lồi gây hại tuyến trùng Tại Việt Nam, theo quy hoạch lý thuyết, diện tích trồng Hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk đến năm 2020 đạt 15.000 ha, nhiên tháng năm 2017 diện tích trồng Hồ tiêu tăng lên tới 38.616 Việc tăng nhanh diện tích trồng Hồ tiêu kèm theo số diện tích bị sâu, dịch hại tăng nhanh Theo Chi cục Trồng trọt Bảo vệ thực vật, từ đầu năm 2016 đến đầu năm 2017, tỉnh Đắk Lắk có 2.776 trồng Hồ tiêu bị sâu bệnh gây hại, chiếm 10% tổng diện tích Hồ tiêu tồn tỉnh: Trong đó, 579 bị bệnh vàng chết nhanh, 1.113 bệnh vàng chết chậm, 1.083 bị loại sâu bệnh khác gây hại Diện tích trồng Hồ tiêu bị bệnh tập trung huyện Buôn Đôn (515 ha), Ea H’leo (183 ha), Ea Kar (hơn 156 ha), Krông Năng (45,5 ha), thị xã Buôn Hồ (216 ha)… Để ngăn chặn dịch bệnh lây lan bùng phát, Chi cục hƣớng dẫn ngƣời dân thực nhiều biện pháp phòng trừ dịch bệnh nhƣ thƣờng xuyên thăm vƣờn để nắm bắt tình hình sinh trƣởng trồng, thực bón phân hợp lý, quản lý sâu bệnh hại tổng hợp IPM… Ngoài ra, số chi nấm sợi có khả sinh tổng hợp enzym độc tố nhằm ngăn cản sinh sản, nở trứng khả sống sót tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp Những chi nấm đƣợc sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Ví dụ nhƣ chế phẩm sinh học Biocon có thành phần nấm Paecilomyces lilacinus, lồi có khả ký sinh, tiêu diệt tuyến trùng trứng chúng Nhằm giải nhu cầu cấp thiết để tìm kiếm chủng nấm sợi đối kháng cao với nấm diệt tuyến trùng hại Hồ tiêu vừa thân thiện với môi trƣờng vừa tăng hiệu để kiểm soát bệnh gây tuyến trùng, đề tài đƣợc tiến hành với tiêu đề nhƣ sau: “Nghiên cứu vi nấm kháng bệnh Hồ tiêu Piper nigrum L nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng” Mục tiêu đề tài  Tuyển chọn đƣợc số chủng vi nấm có hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp cao gây bệnh Hồ tiêu Piper nigrum L tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng làm tăng suất Hồ tiêu tối thiểu 15%  Tạo đƣợc chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp lần so với chủng tự nhiên Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Trong ba chủng nấm sợi có khả diệt tuyến trùng phân lập đƣợc đất trồng Hồ tiêu, Paecilomyces lilacinus P1 (hay gọi Purpureocillium lilacinum) chủng đƣợc quan tâm nghiên cứu hoạt lực diệt tuyến trùng cao tính an toàn chủng Chế phẩm sinh học đƣợc thử nghiệm quy mơ ha/mơ hình tỉnh Đăk Lăk có tác dụng điều hịa tăng suất lên 20% vƣờn Hồ tiêu hoàn toàn khỏe mạnh; 48% vƣờn Hồ tiêu nhiễm bệnh cấp độ nặng Chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng góp phần bảo vệ mơi trƣờng phát triển bền vững ngành sản xuất Hồ tiêu nƣớc ta Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp lần so với chủng tự nhiên vòng 48 Sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mở triển vọng nghiên cứu vai trò, chức gen liên quan đến chế diệt tuyến trùng chi Paecilomyces Những đóng góp luận án +) Tuyển chọn đƣợc chủng vi nấm địa từ đất trồng Hồ tiêu tỉnh Đăk Lăk có hoạt lực diệt tuyến trùng cao, an toàn với ngƣời +) Chế phẩm sinh học đƣợc thử nghiệm quy mơ ha/mơ hình, đánh giá suất mơ hình trình diễn sau sử dụng chế phẩm tăng lên 20% vƣờn Hồ tiêu hoàn toàn khỏe mạnh, 48% so với vƣờn Hồ tiêu nhiễm bệnh cấp độ nặng +) Lần xây dựng quy trình chuyển gen phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dựa chế trợ dƣỡng uridine/uracil đạt hiệu cao gấp 10 lần so với nghiên cứu trƣớc Bố cục luận án Bố cục luận án gồm 132 trang, 18 bảng 32 hình Cụ thể: Mở đầu trang; Chƣơng Tổng quan tài liệu 39 trang; Chƣơng Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 25 trang; Chƣơng Kết thảo luận 48 trang; Kết luận kiến nghị trang; Danh mục cơng trình trang; Tài liệu tham khảo 19 trang Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ BỆNH GÂY RA BỞI TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp 1.1.1 Bệnh gây tuyến trùng Theo thống kê Cục Bảo vệ Thực vật, tính đến tháng 10 năm 2016, bệnh gây tuyến trùng chủ yếu bệnh chết chậm bệnh vàng Diện tích bị bệnh tập trung số địa phƣơng nhƣ Quảng Trị, Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, lên đến hàng ngàn Theo báo cáo tỉnh trọng điểm trồng Hồ tiêu Tây Nguyên Đăk Lăk, Gia Lai Đắk Nơng, hàng năm, tỉnh có vài ngàn tiêu bị nhiễm bệnh vàng lá, tuyến trùng sần rễ …Tỉnh Gia Lai năm 2016 có 6.155 Hồ tiêu bị nhiễm bệnh làm thiệt hại cho gia đình trồng Hồ tiêu ngàn tỷ đồng 1.1.2 Giới thiệu tuyến trùng Meloidogyne sp Tuyến trùng gây hại thực vật thuộc nhóm động vật khơng xƣơng sống, có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh thực vật Tuyến trùng thuộc giống Meloidogyne nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật gây hại nhiều nông nghiệp toàn giới Trên Hồ tiêu, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh sần rễ, vàng lá, chết chậm Tuyến trùng ký sinh tất phận cây, nhƣng vùng rễ nơi tuyến trùng tập trung nhiều Rễ bị nhiễm tuyến trùng sần rễ bị tổn thƣơng, bề mặt có dạng sần sùi tạo thành u cục, bị còi cọc, vàng gây chết Chu kỳ sống tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm giai đoạn phát triển: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1); ấu trùng tuổi (ấu trùng cảm nhiễm-J2); ấu trùng tuổi 3, (J3, J4) giai đoạn trƣởng thành với đực Một số biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp Hiện nay, nông dân thƣờng xử lý chớm biểu bệnh tuyến trùng xâm nhập mức độ bệnh nặng nên khó chữa trị nhiều thời gian phục hồi cho suất thấp Có số biện pháp phịng trừ tuyến trùng nhƣ: Tuyển chọn từ khâu chọn giống: chọn khỏe, có khả kháng bệnh (i) Vật lý: Đa số tuyến trùng không sống đƣợc nhiệt độ 60oC; biện pháp xử lý nhiệt triệt để nhƣng chi phí cao thời gian dài (ii) Hóa học: Biện pháp cho hiệu cao nhƣng gây ô nhiễm môi trƣờng, độc hại ngƣời động vật; (iii) Sinh học: mang lại hiệu lâu dài hƣớng tới môi trƣờng phát triển bền vững 1.2 GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG Nấm diệt tuyến trùng loại vi sinh vật bắt, tiêu diệt tiêu hóa tuyến trùng Có 200 loài nấm sợi đƣợc biết đến khác khả hoại sinh/ký sinh tuyến trùng Các chi nấm có khả diệt tuyến trùng từ dạng trƣởng thành, dạng ấu trùng trứng, đồng thời sử dụng tuyến trùng làm chất dinh dƣỡng Nhiều loại nấm diệt tuyến trùng hình thành bẫy ký sinh trứng tuyến trùng tồn đất dạng hoại sinh nhƣng loại nội ký sinh sử dụng tuyến trùng chất dinh dƣỡng (ký sinh bắt buộc) Hình 1.1 biểu diễn sơ đồ khái qt hóa tƣơng tác nấm sợi (vi khuẩn) tiêu diệt tuyến trùng với tuyến trùng, phƣơng thức dẫn dụ diệt tuyến trùng Hình 1.1 Sự tƣơng tác tuyến trùng, nấm vi khuẩn 1.2.1 Vai trị kiểm sốt sinh học nấm diệt tuyến trùng Kiểm soát sinh học theo Cook cs., (1993) việc ngƣời sử dụng vi sinh vật đối kháng không gây bệnh để ức chế mầm gây bệnh theo cách thân thiện với môi trƣờng Dựa chế tác dụng, sản phẩm từ chủng đƣợc sử dụng làm phân bón sinh học, làm chất tăng cƣờng thực vật làm thuốc trừ sâu sinh học Theo nghiên cứu Wu cs., (2015), thị trƣờng toàn cầu thuốc trừ sâu sinh học tăng lên tới 83,7 tỷ USD vào năm 2019 1.2.2 Phân loại nấm diệt tuyến trùng Các nhà khoa học phân loại nhóm nấm diệt tuyến trùng dựa kiểu cơng mồi chia thành năm nhóm: (1) bẫy/bẫy động vật, (2) nấm diệt tuyến trùng “ăn thịt”, (3) nội ký sinh, (4) nấm sản xuất độc tố, (5) nấm sử dụng thiết bị công đặc biệt 1.2.2.1 Nấm bẫy tuyến trùng Hầu hết loại nấm bẫy tuyến trùng đƣợc công bố thuộc Ascomycota Những loại nấm sống hoại sinh đất Tuy nhiên, với có mặt tuyến trùng, loài nấm trở thành kẻ săn mồi thông qua việc sản xuất bẫy cụ thể, bao gồm vịng, núm dính, mạng dính, cột dính 1.2.2.2 Nấm ký sinh tuyến trùng Chính khả hoại sinh hạn chế chúng đất làm cho nấm nội ký sinh sử dụng tƣơng đối hẹp ứng dụng kiểm soát sinh học Trong số loại nấm nội ký sinh, Drechmeria coniospora đƣợc nghiên cứu nhiều 1.2.2.3 Nấm ký sinh trứng tuyến trùng Giới thiệu Paecilomyces sp.:Các loài thuộc chi Paecilomyces nấm sợi xuất môi trƣờng đất phổ biến Với chế ký sinh trực tiếp lên trứng, ấu trùng đồng thời sản sinh enzym nhƣ chitinase, protease có khả phân hủy lớp kitin bên ấu trùng ức chế nở trứng Các cơng bố cho thấy chitinase đóng vai trị quan trọng trình diệt tuyến trùng, protease enzym khác có vai trị hỗ trợ chitinase nhằm thúc đẩy nhanh q trình diệt Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy sợi nấm xâm nhập trực tiếp vào lớp biểu bì trứng, ấu trùng M javanica Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng Vào năm 1980, lần nghiên cứu nhằm sàng lọc chủng nấm diệt tuyến trùng đất chứng minh đƣợc mối tƣơng quan hoạt tính chitinase nấm diệt tuyến trùng nhƣ Pochonia sp., Arthrobotrys sp., Paecilomyces sp Theo Yang cs., (2007), nhiều loài nấm diệt tuyến trùng nhƣ Pochonia sp., Arthrobotrys sp., Paecilomyces sp đƣợc coi nhƣ tác nhân sinh học diệt tuyến trùng Dackman cs., (1989) cơng bố hai lồi thuộc chi Verticillium có khả diệt Heterodera schachtii nhờ hoạt tính chitinase protease chi nấm Protease từ nấm diệt tuyến trùng Cho đến nay, 20 protease serine đƣợc tinh xác định trọng lƣợng phân tử từ loại nấm diệt tuyến trùng khác Các nghiên cứu chế tiêu diệt tuyến trùng protease làm suy giảm hiệu lớp biểu bì tuyến trùng Do đó, chúng cịn đƣợc gọi protease phân hủy tuyến trùng Các cấu trúc tinh thể hai protease phân hủy lớp biểu bì, Ver112 (tìm thấy từ Lecanicillium psalliotae) PL646 (tìm thấy từ Paecilomyces lilacinus), cho cấu trúc khác dẫn tới chức chúng khác 1.3 CẢI BIẾN DI TRUYỀN Ở NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG 1.3.1 Các phƣơng pháp chuyển gen Hiện nay, giới nhà khoa học sử dụng phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi nhƣ chuyển gen tế bào trần, chuyển gen xung điện, chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens… Mỗi phƣơng pháp chuyển gen có 10 ƣu nhƣợc điểm riêng nhiên tùy thuộc vào loài mà hiệu suất chuyển gen khác phƣơng pháp 1.3.2 Một số gen thị dùng cho chuyển gen nấm Gen thị đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu chuyển gen vào chủng đƣợc chuyển để sàng lọc thể chuyển gen Chuyển gen thị vào chủng cần nghiên cứu nhằm tạo chủng có kiểu hình khác với chủng tự nhiên (WT) Các gen thị giúp nghiên cứu dễ dàng việc nhận biết thể chuyển gen dƣới kính hiển vi điện tử mà khơng làm thay đổi hoạt tính sinh lý, sinh hóa chủng Một số gen thị thƣờng dùng DsRed, GFP, GUS, lacZ… 1.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trình chuyển gen Quá trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua A tumefaciens phƣơng pháp đƣợc áp dụng phổ biến tính ổn định chi phí thấp Tuy nhiên, hiệu suất q trình chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: (1) Agrobacter tumefaciens; (2) Thời gian, cấu trúc màng đồng nuôi cấy định thành công hay thất bại trình chuyển gen (3) Vật liệu chuyển gen (4) Nồng độ chất cảm ứng 1.3.4 Một số nghiên cứu cải biến di truyền nấm diệt tuyến trùng Một cách để cải thiện khả kiểm soát sinh học nấm diệt tuyến trùng sử dụng kỹ thuật di truyền để tăng khả gây bệnh khả sống sót loại nấm diệt tuyến trùng Nhờ đột biến gen xảy với nấm diệt tuyến trùng A oligospora, gen PII - mã hóa protease serine (phân hủy lớp biểu bì tuyến trùng) đƣợc biểu mức A oligospora Ahman cs., (2002) nghiên cứu 11 gen PII Arthrobotrys oligospora nhận thấy xóa gen PII tái tổ hợp tƣơng đồng có ảnh hƣởng đến khả diệt tuyến trùng nấm Đồng thời, biểu mức PII nhận thấy tốc độ diệt tuyến trùng tăng so với chủng dại 1.4 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM Hiện nay, có số khó khăn liên quan đến ứng dụng kiểm soát sinh học, bao gồm hiệu tƣơng đối thấp không thống môi trƣờng nông lâm nghiệp Một số biện pháp sử dụng nhằm kiểm soát bệnh tuyến trùng Hồ tiêu Việt Nam Một vấn đề lớn thƣờng gặp đa số hộ trồng Hồ tiêu sử dụng nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật tự ý tăng liều lƣợng Mục đích ngƣời trồng Hồ tiêu mong muốn tăng cao suất nhƣng họ lại không quan tâm đến chất lƣợng sản phẩm Đây nguyên nhân khiến cho tình trạng hồ tiêu thành phẩm nƣớc ta xuất thị trƣờng quốc tế có tồn dƣ chất bảo vệ thực vật vƣợt giới hạn cho phép Mặc dù tiềm kiểm soát sinh học bệnh tuyến trùng chi Paecilomyces lớn nhƣng việc nghiên cứu sử dụng chi Việt Nam nhiều hạn chế Các nghiên cứu gần nhƣ đề cập cho thấy hiệu diệt tuyến trùng Hồ tiêu chế phẩm chƣa cao, việc tăng cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học nhằm tiêu diệt tuyến trùng cần thiết Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1.VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu: 15 mẫu đất thu thập vùng trồng Hồ tiêu khu vực tỉnh Đăk Lăk, E.coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens AGL1; Tuyến trùng Meloidogyne sp; Cây Hồ tiêu: 3,5 tháng tuổi; Vƣờn Hồ tiêu thời kỳ kinh doanh (từ – năm tuổi) thuộc xã Eabar, huyện Buôn Đôn, tỉnh Đăk Lăk 2.1.2 Hóa chất Hygromycin B; Phleomycin; Nourseothricin; Geneticin (G418); Kanamycin; Ampilixilin; Cefotaxime; Acetosyringone AS (Merck); kít tinh DNA (Thermo, Pro MEGA, Intron); enzym Phusion®; pJET 1.2/blunt – Cat Nos K1231 (Thermo); Casein (Merck); chitin (Biobasic); CMA (Merck); PDA, – fluoroorotic acid (5-FOA), Uridine,Uracil (Merck) 2.1.3 Thiết bị Các thiết bị sinh học phân tử thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, Phịng Cơng nghệ lên men, Phịng Cơng nghệ sinh học enzyme/Viện Công nghệ sinh học 2.2 PHƢƠNG PHÁP 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập quan sát hình thái 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu enzyme/protein Phƣơng pháp xác định hoạt tính chitinase phản ứng màu với DNSA theo Miller 1959; Xác định hoạt tính protease đƣợc xác định theo phƣơng pháp Anson cải tiến 2.2.3 Phƣơng pháp điện di Gel polyacrylamid (SDS-PAGE) theo Laemmli U.K., (1970); Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số theo Bradford 2.2.4 Tách chiết DNA hệ gen PCR đoạn DNA 13 2.2.5 Phản ứng nối ghép gen (Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR (50-100 ng/µl) 2.2.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli DH5α 2.2.7 Tách DNA plasmid 2.2.8 Đánh giá khả mẫn cảm với kháng sinh – FOA chủng Paecilomyces lilacinus P1 2.2.9 Phƣơng pháp thu bào tử hệ sợi nấm P lilacinus P1 2.2.10 Phƣơng pháp tạo chủng đột biến gen pyrG UV sử dụng môi trƣờng chọn lọc 5-fluoroorotic acid (5-FOA) từ chủng P1 2.2.11 Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi Agrobacterium tumefaciens AGL1 2.2.3 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh tổng hợp chitinase P lilacinus P1 2.2.4 Các phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG 3.1.1 Phân lập, sàng lọc chủng nấm sợi Từ 15 mẫu đất rễ quanh Hồ tiêu thu thập Đăk Lăk Mẫu đƣợc pha lỗng đƣợc cấy gạt mơi trƣờng CDA Qua tổng quan tài liệu, dựa hình thái, màu sắc khuẩn lạc, cấu trúc sinh bào tử…, chủng nấm sợi phân lập đƣợc sàng lọc định hƣớng tới chủng nấm sợi có khả diệt tuyến trùng Bảng 3.1 Hình thái, cấu trúc sinh bào tử chủng nấm sợi Bảng 3.2 Khảo sát khả diệt tuyến trùng Meloidogyne sp 14 ST Tên chủng T Đối chứng Tỉ lệ tuyến trùng chết (%) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h - - - - - - - - ± ± - 10,81± 30,7 ± 58,5 ± 58,5 ± 0,75 2,71 2,39 2,41 2,31 ± 15,6 ± 50,4 ± 50.4 ± 0,24 1,82 2,84 2,97 20,80 ± 40,17 ± 55,23 ± 55,23 2,51 3,28 4,12 ± 3,96 (nƣớc cất) ĐC (CD dịch thể) P1 NV01 NV20 - - Ghi chú: ( ± ): chết ít, không đáng kể, (-): chết Bảng 3.2 cho thấy, thời gian thử nghiệm đến 96 giờ, tuyến trùng cho tỷ lệ chết cao đến 58% P1; 55,23% NV20; 50,4% NV01 Trong khoảng thời gian 72 - 96 lƣợng trứng nở ấu trùng sống sót bắt đầu giảm nhiều, thời điểm enzym phân hủy với độc tố bắt đầu đƣợc sản sinh nhiều nên có tác động đến khả tồn phát triển quần thể tuyến trùng so với mẫu đối chứng Sau 96 trở đi, lƣợng trứng ấu trùng sống sót thay đổi khơng đáng kể, lƣợng enzym ủ lâu phần hoạt tính Nhƣ vậy, ba chủng nấm đƣa vào khảo sát có khả diệt tuyến trùng Ở Việt Nam công bố sử dụng chế phẩm bào tử nấm để diệt tuyến trùng hạn chế Tuy nhiên, 15 bƣớc đầu thử nghiệm khẳng định tính hiệu nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng 3.1.2 Định danh chủng nấm sợi P1, NV01, NV20 trình tự ITS1/ITS4 Các chủng P1, NV01, NV20 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng CD dịch thể thời gian từ -5 ngày; nhiệt độ nuôi cấy 28oC ± 2oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút Hệ sợi nấm đƣợc thu để phục vụ tách chiết DNA hệ gen Chủng NV20 có mức độ tƣơng đồng trình tự ITS với chủng Pleurotus giganteus (KT956125) 99%, đƣợc gọi Plerotus giganteus NV20 P1 có mức độ tƣơng đồng trình tự ITS với chủng Paecilomyces lilacinus KY549673.1 99% NV01 thuộc loài P variotii đƣợc đặt tên P variotii NV01 3.1.3 Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase, protease ngoại bào chủng P variotii NV01 P lilacinus P1 Kết cho thấy, hoạt độ chitinase protease P1 cao so với NV01 điều kiện nuôi cấy Cụ thể hoạt độ chitinase lần lƣợt 61,7 U/ml 37,7 U/ml Hoạt độ chitinase chủng P1 gấp lần so với nghiên cứu Homthong cs., (2016) nuôi cấy Paecilomyces sp môi trƣờng 3.2.1 Tinh chitinase từ chủng P1 Bảng 3.3 Kết tinh chitinase từ chủng P lilacinus P1 Bƣớc tinh HL pr.TS (ml) HT tổng số (U) Hoạt độ riêng (U/ml) Độ (lần) Hiệu suất (%) Enzym thô 0,76 47,6 62,63 1,0 100 (NH4)2SO4 0,065 5,53 85,08 1,35 11,6 DEAE- 0,006 0,8 133,3 2,1 1,68 16 Sephadex A-50 3.2.2 Tính an tồn chủng P lilacinus P1 Theo số cơng trình nghiên cứu, P lilacinus chủng an toàn ngƣời P lilacinus cho thấy khơng có độc tính khả gây bệnh thử nghiệm động vật gặm nhấm động vật không xƣơng sống khác P lilacinus không tồn nhiệt độ thể ngƣời 3.4.1 Ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng lên men Ở nồng độ chất 0,75% hoạt tính chitinase cao cụ thể gấp 2,7 lần so với không bổ sung chất (70,3 U/ml so với 25,8 U/ml); gấp 1,8 lần so với nồng độ chitin 0,1% Điều chứng tỏ rằng, khơng có nồng độ chitin q thấp lƣợng chất không đủ để chủng P1 vừa sinh trƣởng vừa tổng hợp chitinase Khi tăng nồng độ chất hoạt tính chitinase tăng lên rõ rệt, nhiên tăng đến 1,5% hoạt tính chitinase lại giảm, điều cho thấy tăng nồng độ chất vào mơi trƣờng q cao, pha tăng trƣởng nấm sợi kéo dài hơn, sản phẩm cuối thứ cấp tích tụ nhiều gây ức chế tổng hợp chitinase, nồng độ chitinase 0,75% thích hợp cho chủng P1 sinh chitinase cao sử dụng nồng độ cho nghiên cứu 3.1.7.2 Ảnh hưởng nguồn bon Glucose cho hoạt tính chitinase cao nguồn khảo sát 58,2 đến 62,7 U/ml Do đó, glucose đƣợc chọn nguồn carbon trình sinh tổng hợp chitinase 3.1.7.3 Ảnh hƣởng nguồn ni tơ Giống nhƣ carbon, việc lựa chọn nguồn nitơ nồng độ mơi trƣờng đóng vai trị quan trọng sản xuất 17 chất chuyển hóa Bởi vì, chủng P1 sử dụng nguồn nitơ vô / hữu Trong nghiên cứu này, ảnh hƣởng số nguồn nitơ nhƣ pepton, cao thịt, (NH4)2SO4, KNO3, NaNO3 nồng độ 0,5% đƣợc nghiên cứu Kết nhận thấy pepton cho hoạt tính chitinase cao nhất, nguồn nitơ vơ cho hoạt tính thấp hơn; kết trùng với công bố Farag A., (2014), Dhar P., (2010), Jha S., (2016) 3.1.7.4 Phân tích ý nghĩa mơ hình với thí nghiệm Sử dụng phƣơng án đáp ứng bề mặt – phƣơng pháp cấu trúc có tâm nhằm tìm kiếm kết hợp tối ƣu thành phần môi trƣờng nuôi cấy Giới hạn nồng độ phù hợp yếu tố đƣợc xác định sơ Nhƣ năm yếu tố với tổng số 63 thí nghiệm đƣợc tiến hành Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại lần Hình 3.19 Bề mặt đáp ứng cặp yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chitinase chủng P lilacinus P1 3.1.7.5 Đánh giá tính thực tế mơ hình Mơi trƣờng CHY3 (chitin chất: 0,75%, glucose 1,93%, pepton 0,33%, K2HPO4 0,1%, Ca2+/Mg2+: 3:4) đƣợc chọn làm mơi 18 trƣờng thích hợp cho q trình lên men sinh tổng hợp chitinase chủng P1: cụ thể hoạt tính chitinase tăng lên 17% so với chƣa tối ƣu; đồng thời gấp 3,5 lần so với nghiên cứu Homthong cs., (2016) 3.2 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG 3.2.1 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogyne sp gây bệnh Hồ tiêu Chế phẩm dạng dịch thể chủng P1 đƣợc bảo quản nhiệt độ 20 C – 30oC đƣợc kiểm tra mật độ sau khoảng thời gian o bảo quản: 10 ngày, tháng, tháng tháng 3.2.2 Nghiên cứu khả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp hại Hồ tiêu điều kiện nhà lƣới chế phẩm sinh học Tại thời điểm kiểm tra sau xử lý, mật độ tuyến trùng chậu đối chứng có tăng thêm từ 4,7% đến 9,9% Trong chậu thí nghiệm mật độ tuyến trùng cịn sống giảm xuống 5682% tác động chế phẩm Hiệu lực diệt tuyến trùng dao động khoảng 20-53% Xét hiệu lực diệt tuyến trùng mức pha loãng 50 100 lần gần giống nhau, mức 150 200 lần hiệu lực giảm hẳn, nên chọn mức pha loãng chế phẩm 100 lần 3.2.3 Đánh giá suất mơ hình trình diễn sau sử dụng chế phẩm Chế phẩm sinh học có tác dụng điều hịa tăng suất tới 20% Các vƣờn chớm bị bệnh vàng lá, suất bên đối chứng mơ hình giảm nhiều so với vƣờn không bị vàng lá, nhƣng vƣờn mơ hình có sử dụng chế phẩm nên hạn chế đƣợc 19 tuyến trùng nấm gây bệnh suất tăng nhiều so với đối chứng, tới 30% 3.3 NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN DI TRUYỀN CHỦNG P lilacinus P1 Khả diệt tuyến trùng nhƣ khả sinh tổng hợp enzym chất có hoạt tính sinh học chủng P lilacinus tự nhiên có hạn Việc tăng cƣờng khả diệt tuyến trùng hay sinh enzym thực thơng qua việc cải biến di truyền Trong nghiên cứu này, hệ thống chuyển gen vào chủng P1 bƣớc đầu đƣợc xây dựng nhằm tạo công cụ hữu hiệu để thực việc cải biến di truyền Chủng P1 kháng với loại kháng sinh phleomycin; nourseothricin; hygromycin; geneticin (G418) với nồng độ kháng sinh từ 600 – 1000 µg/ml Tuy nhiên, 5-FOA chủng P1 không sinh trƣởng đƣợc tất nồng độ thử nghiệm Điều đƣợc giải thích gen PyrG mã hóa cho enzym decarboxylase orotidine-5’-monophotphate (OMP) xúc tác cho trình tổng hợp pyrimidin tác dụng với 5-FOA (khi có mặt – FOA) khơng độc thành chất gây độc tế bào 5-fluorouracil dẫn tới tế bào chết 3.3.2 Tạo chủng nấm P lilacinus đột biến kháng 5-FOA trợ dƣỡng uracil/uridine 3.3.2.1 Gây đột biến kháng 5-FOA trợ dưỡng uracil/uridine phương pháp chiếu UV Từ kết đánh giá khả kháng kháng sinh 5-FOA chủng P1, môi trƣờng chứa 5-FOA, uracil, uridine đƣợc sử dụng để chọn lọc thu nhận thể đột biến kháng 5-FOA trợ dƣỡng uracil uridine Phƣơng pháp chiếu UV đƣợc áp dụng để tạo 20 số đột biến phịng thí nghiệm Tác nhân gây đột biến UV đƣợc tiến hành máy cố định gen Vilber Lourmat Những khuẩn lạc sống sót đƣợc chọn lọc qua hệ cấy chuyền liên tiếp môi trƣờng CDA + 5- FOA + uracil + uridine 3.3.2.2 Xác nhận thể đột biến 424 giải trình tự vùng ORF gen PyrG Từ vị trí đột biến nucleotid, sai khác aminoaxit vùng ORF gen pyrG đƣợc phát hiện, kết đƣợc trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Vị trí sai khác trình tự nucleotide amino axit Vị trí Amino axit biến đổi Nucleotide 205 (WT) T C L S (Leucine – Serine) 251 (WT) T G S R (Serine – Arginin) 795 (WT) T A Thêm R (Arginin) 3.3.3 Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào thể đột biến 424 pyrG(-) Cải biến di truyền chủng P1 phƣơng pháp chuyển gen ATMT sử dụng marker trợ dƣỡng bƣớc tiến vƣợt trội đồng thời thí nghiệm chuyển gen thành công gen DsRed vào thể đột biến 424pyrG(-) chủng P1 với thông số tối ƣu nồng độ uridine bổ sung cho môi trƣờng IM đồng nuôi cấy 0,005%; nồng độ bào tử cho chuyển gen 106 bào tử/ml; nhiệt độ đồng nuôi cấy 22oC; nồng độ AS cho giai đoạn cảm ứng 200 µM AS; thời gian đồng nuôi cấy 60 3.3.4 Xác nhận biểu gen DsRed thể chuyển gen Kết cho thấy gen huỳnh quang DsRed biểu thành công vào thể đột biến 424pyrG(-) chủng P1 điều mở 21 triển vọng cho nghiên cứu chế diệt tuyến trùng, biểu protein, enzym tái tổ hợp nhƣ sản xuất chất có hoạt tính sinh học chi nấm tiềm 3.3.5 Sàng lọc thể chuyển gen có hoạt tính chitinase, protease khả diệt tuyến trùng cao Hình 3.23 Tỷ lệ chết tuyến trùng A Hình ảnh tuyến trùng sống B Hình ảnh tuyến trùng chết C Đồ thị tỷ lệ chết tuyến trùng (Ghi chú: hình A, B đƣợc chụp KHV Olympus CX 41 độ phóng đại 150x) Kết thử nghiệm cho thấy vịng 48 giờ, dịch ni cấy PE858 cho tỷ lệ tuyến trùng Meloidogyne sp bị chết lên đến 72%, chủng tự nhiên (P1) cho tỷ lệ chết 11% Điều chứng tỏ hoạt tính chitinase cao ảnh hƣởng đáng kể đến tốc độ diệt tuyến trùng Việc cải biến di truyền tạo thể đột biến cho khả diệt tuyến trùng cao chủng P1 mở hƣớng nghiên cứu nhằm điều tra vai trò, chức gen liên quan đến chế diệt tuyến trùng nhƣ gen tham gia vào trình trao đổi chất chủng nấm sợi tiềm 22 KẾT LUẬN Đã tuyển chọn đƣợc ba chủng nấm sợi có khả diệt tuyến trùng - Từ 15 mẫu đất địa khu vực trồng Hồ tiêu tỉnh ĐăkLăk phân lập đƣợc ba chủng nấm sợi đƣợc định danh Paecilomyces lilacinus P1; Paecilomyces variotii NV01; Plerotus giganteus NV20 - Hoạt tính protease chủng P1 NV01 tƣơng ứng đạt 91,2 82,3 U/ml - Hoạt tính chitinase chủng P1 NV01 tƣơng ứng đạt 61,7 37,7 U/ml - Sử dụng phƣơng án đáp ứng bề mặt – phƣơng pháp cấu trúc có tâm, hoạt tính chitinase chủng P1 cao 17% so với hoạt tính chitinase chƣa tối ƣu Tạo chế phẩm sinh học từ chủng P1 thử nghiệm quy mô nhà lƣới, quy mơ đồng ruộng ha/mơ hình tỉnh Đăk Lăk - Đã xây dựng quy trình tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng dạng dịch thể, chế phẩm ổn định với mật độ 107 CFU/ml sau tháng - Chế phẩm sinh học từ chủng nấm sợi đƣợc thử nghiệm Hồ tiêu 3,5 tháng tuổi quy mơ nhà lƣới có hiệu lực diệt 52,48% sau 30 ngày - Năng suất mô hình trình diễn triển khai Đăk Lăk sau sử dụng chế phẩm tăng 20,9% so với đối chứng cấp độ khỏe mạnh; tăng 48,7% sử dụng chế phẩm cấp độ bị bệnh nặng Tạo chủng đột biến PE858 có hoạt lực diệt tuyến trùng cao 23 - Lần thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens dựa chế trợ dƣỡng uracil/uridine nấm Paecilomyces lilacinus với hiệu chuyển gen đạt 2860 ± 26 thể chuyển gen/106 bào tử - Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp lần so với chủng tự nhiên vòng 48 KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu cải biến di truyền chủng Paecilomyces lilacinus P1 nhằm điều tra vai trò chức số gen liên quan đến chế diệt tuyến trùng Triển khai thêm mơ hình ứng dụng số địa bàn tỉnh vùng Tây Nguyên, thu thập số liệu bổ sung cho quy trình sử dụng chế phẩm sinh học dạng dịch thể quản lý tổng hợp bệnh tuyến trùng nấm hại rễ Hồ tiêu nhằm phát triển bền vững Tây Nguyên 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Chu Thanh Bình, Bùi Thị Việt Hà, Hồ Tuyên, Nguyễn Phƣơng Nhuệ (2017), “Đặc điểm sinh học chủng Paecilomyces variotii NV01 phân lập từ đất trồng hồ tiêu khu vực ĐăkLăk”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 33 (1S), 42-48 Chu Thanh Bình, Nguyễn Phƣơng Nhuệ, Hồ Tuyên, Bùi Thị Việt Hà (2019), “Tinh xác định hoạt tính chitinase từ nấm diệt tuyến trùng Paecilomyces sp P1”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 35 (1), 90-96 Chu Thanh Binh, Tran Van Tuan, Bui Thi Viet Ha (2019), “Optimization of medium composition for enhancing chitinase production of Paecilomyces sp P1 strain by using response surface methodology”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 17 (2), 301308 Chu Thanh Binh, Tran Van Tuan, Tran Bao Tram, Bui Thi Viet Ha (2019), “Determination of protease and chitinase activities from Paecilomyces variotii NV01 isolated from Dak Lak pepper soil”, Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, 61 (4), 33-38 Chu Thanh Binh, Bui Thi Viet Ha, Van-Tuan Tran (2019), “A new and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation system based on the uridine/uracil auxotrophic mutant in the nematophagous fungus Paecilomyces lilacinus”, Journal of Microbiological Method, Đã nộp thảo 25 ... để kiểm sốt bệnh gây tuyến trùng, đề tài đƣợc tiến hành với tiêu đề nhƣ sau: ? ?Nghiên cứu vi nấm kháng bệnh Hồ tiêu Piper nigrum L nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng? ?? Mục tiêu đề tài... NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG 3.2.1 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogyne sp gây bệnh Hồ tiêu Chế phẩm dạng dịch thể chủng P1 đƣợc... TUYẾN TRÙNG Nấm diệt tuyến trùng loại vi sinh vật bắt, tiêu diệt tiêu hóa tuyến trùng Có 200 lồi nấm sợi đƣợc biết đến khác khả hoại sinh/ ký sinh tuyến trùng Các chi nấm có khả diệt tuyến trùng