Nghiên cứu quy trình xây dựng thư viện cDNA từ xylem của cây bạch đàn uro (eucalyptus urophylla s t blake) trồng tại việt nam

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM KHOA LÂM HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÂY DỰNG THƢ VIỆN cDNA TỪ XYLEM CỦA CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T BLAKE) TRỒNG TẠI VIỆT NAM NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 307 Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Cường ThS Bùi Văn Thắng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hiền Khoá học: 2005 – 2009 Hà Nội, 2009 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Cường, Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, ThS Bùi Văn Thắng, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam- người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ thời gian thực tập hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hồng Hà tập thể cán Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cám ơn đến CN Hồng Hà tận tình giúp đỡ truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian hồn thành khóa luận Qua đây, tơi xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy cô khoa Lâm học thầy cô môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè, người ln ln động viên giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, tháng năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Hiền BẢNG CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid Bp Base pair CPP Copalyl diphosphate Cs Cộng E coli Escherichia coli cDNA Complementary DNA dNTP Deoxynucleotide triphosphate EtBr Ethidium bromide LB Luria and Bertani Taq Thermus aquaticus Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction Rnase Ribonuclease v/p vòng/phút ESTs Expressed Sequence Tags NH4OAc Amonium Acetate DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt enzyme BsrGI Bảng 3.1 Các thành phần vector pDONRTM 222 Bảng 3.2: Kích thước đoạn cDNA chèn vào vector DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ vận chuyển chất mạch xylem Hình 1.2 Các bước việc xây dựng thư viện cDNA Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng BP kỹ thuật Gateway Hình 3.1 Kết tách chiết RNA từ mẫu gỗ Bạch đàn Hình 3.2 Kết tách RNA loại DNA DNAse Hình 3.3 Mơ hình tạo cDNA Hình 3.4 Kết phép thử đánh dấu đĩa thạch Hình 3.4 Sơ đồ vector pDONRTM222 Hình 3.5 Vị trí phân đoạn cDNA chèn vào vector pDONRTM222 Hình 3.6 Kết chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp mơi trường chứa kháng sinh Kanamycin Hình 3.7 Kết tách plasmid Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm cắt Hình 3.9 Trình tự phân đoạn cDNA số Hình 3.10 So sánh trình tự cDNA số với trình tự Genbank (bằng BLAST) MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 2BẢNG CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Bạch đàn (Eucalyptus urophylla S.T Blake) nghiên cứu gen loại 1.2 Cấu trúc vai trò xylem thực vật 1.3 Giới thiệu thƣ viện cDNA 1.4 Một số kĩ thuật sử dụng nghiên cứu tạo thƣ viện cDNA CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Vật liệu hóa chất 12 2.1.1 Vật liệu 12 2.1.2 Hóa chất 12 2.1.3 Máy móc, thiết bị 13 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Tách chiết RNA 14 2.2.2 Điện di gel agarose 1% 14 2.2.3 Tổng hợp sợi cDNA thứ 15 2.2.4 Tổng hợp sợi cDNA thứ gắn attB1 16 2.2.5 Phân đoạn kích thƣớc cDNA cột sắc kí lực 17 2.2.6 Biến nạp vào dịng tế bào kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 mơi trƣờng kháng sinh Kanamycin 19 2.2.7 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu gỗ Bạch đàn urô 22 3.2 Thu phân đoạn cDNA kiểm tra chất lƣợng phân đoạn 27 3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 30 3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp cắt plasmid Enzyme BrsG I 32 3.5 Đánh giá chất lƣợng cDNA 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Rừng bao phủ gần 30% diện tích bề mặt trái đất với diện tích gần tỉ hecta Rừng giữ nhiều chức quan trọng cho sống bao gồm việc trì đa dạng sinh học, cung cấp oxy cho khí quyển, ngăn cản xói mòn, cung cấp gỗ thức ăn (FAO, 2005) [12] Trong nghiên cứu phát triển nguồn vốn gen rừng, cần chọn lọc cá thể có tính trạng q, mong đợi để nhân dịng gìn giữ nguồn gen quý cho sản xuất Tuy nhiên, việc xác định cá thể có tính trạng q thường gặp phải khó khăn thời gian sinh trưởng loài rừng thường dài (Grattapaglia, 2004) [15] Những tiến nghiên cứu gen học trở thành công cụ quan trọng hiệu cho nhà chọn giống lâm nghiệp việc rút ngắn thời gian sàng lọc cá thể mang tính trạng (hoặc gen) quan tâm Trong năm qua, nghiên cứu xác định loại gen mã hóa cho tính trạng quý tiến hành phổ biến nhiều loài thực vật gen loài giải mã hoàn chỉnh Để thực nghiên cứu nhà khoa học chọn lọc cách ngẫu nhiên dòng cDNA quan tâm thư viện cDNA xây dựng điều kiện cụ thể, đường nhanh có hiệu cao (Brauetigam et al., 2005) [10] Bằng việc sử dụng phương pháp này, nhiều tính trạng phân tích lồi rừng hình thành gỗ, khả chịu lạnh… Tuy nhiên, nghiên cứu dừng lại việc phân tích biểu gen có liên quan đến tính trạng nghiên cứu cụ thể mà chưa mở rộng tìm hiểu tác động lên chu trình trao đổi chất khác Chi Bạch đàn (Eucalyptus) gồm lồi cơng nghiệp có giá trị kinh tế cao Gỗ Bạch đàn sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực từ việc trang trí, đóng đồ gỗ gia dụng, xây cất nhà cửa cơng trình xây dựng khác Những cơng trình nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh thái, trình sinh trưởng, phát triển Bạch đàn quan tâm ý Sự sinh trưởng, phát triển thực vật nói chung Bạch đàn nói riêng có liên quan chặt chẽ với với môi trường sống Cây Bạch đàn phát triển nhanh cho suất gỗ lớn, ngược lại sinh trưởng chậm, hoa sớm suất gỗ thấp [15] Sự khác khả sinh trưởng dịng Bạch đàn hệ khác biểu gen đặc trưng Thư viện cDNA từ dòng với khả sinh trưởng khác công cụ cần thiết cho nghiên cứu sâu biểu gen mô hay tế bào nghiên cứu Phương pháp có nhiều ý nghĩa quan trọng nghiên cứu cấu trúc chức gen [6] Chính lý mà tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu quy trình xây dựng thư viện cDNA từ xylem Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) trồng Việt Nam" CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Bạch đàn (Eucalyptus urophylla S.T Blake) nghiên cứu gen loại Chi Bạch đàn (Eucalyptus) thuộc họ Mytarceae gồm 700 lồi Theo cách phân loại hai chi Bạch đàn Corymbia Angophora, nhiên vài nhà phân loại thực vật lại cho chúng chi độc lập Cây Bạch đàn có nguồn gốc từ Australia chúng sinh trưởng phổ sinh thái rộng [14] Ngày Bạch đàn gỗ lâm nghiệp quan trọng trồng phổ biến nhiều quốc gia giới với diện tích canh tác khoảng 17 triệu hecta Trong số Eucalyptus grandis, E globus, E camandulensis trồng phổ biến nhất, chiếm khoảng 80% diện tích canh tác Ngồi ra, lồi E nitens, E saligna, E deglupta, E urophylla, E tereticornis E pilularis trồng phổ biến Gỗ từ Bạch đàn sử dụng xây dựng, cơng nghiệp giấy Cây Bạch đàn lồi gỗ sinh trưởng nhanh, chiều cao đạt tới 15 - 20 m, đường kính đạt tới 40 cm Thân thẳng, vỏ mịn, bao phủ bên loại chất dạng bột [21] Những nghiên cứu gen Bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh cấu trúc, chức thành phần trình tự gen Đặc điểm gen, bao gồm nhân nhân, xác định dựa việc tạo đồ liên kết vị trí thị phân tử locus tính trạng số lượng [15] Những nghiên cứu chức gen chủ yếu tập trung vào việc tách dịng xác định gen mới, phân tích biểu gen, định vị gen locus quy định tính trạng số lượng, mối liên kết tính đa hình DNA hình thái cá thể, cuối tạo dòng chuyển gen mang tính trạng mong muốn [22] 1.2 Cấu trúc vai trò xylem thực vật Mạch gỗ thuật ngữ khoa học xylem (chữ "xylem" bắt nguồn từ từ cổ điển Hy Lạp (xylon), có nghĩa "gỗ"), tổ chức dẫn truyền nhựa nguyên (khống nước) thân cây, có gỗ rộng Mạch gỗ chiếm 2030% thể tích thân Cấu tạo mạch gỗ tập hợp tế bào mạch gỗ nối tiếp thành ống dài theo chiều dọc thân Quan sát kính hiển vi, tế bào mạch gỗ có hình dạng: hình trụ, hình trống viên trụ Mạch gỗ thành phần lớn cấu tạo gỗ nên dễ quan sát nhất, mặt cắt ngang có hình tròn elip nên gọi lỗ mạch, mặt cắt xuyên tâm tiếp tuyến có dạng ống nên gọi ống mạch Mạch gỗ yếu tố giúp phân biệt loại gỗ, yếu tố làm tăng độ xốp rỗng gỗ Số lượng kích thước mạch gỗ ảnh hưởng định đến bề mặt gỗ (lỗ mạch nhiều lớn thớ gỗ thô) Các chất dinh dưỡng nước từ đất chất hữu sinh phân phối vào khu vực cụ thể thông qua xylem phloem [7] Xylem đưa nước chất dinh dưỡng từ rễ lên phần phía thân cây, cịn phloem vận chuyển chất khác, chẳng hạn glucose sinh từ trình quang hợp, chất hữu tạo cho nguồn lượng để phát triển kết hạt Xylem bao gồm quản bào, tế bào chết có vách cứng xếp để tạo ống nhỏ có chức vận chuyển nước Vách quản bào thông thường chứa lignin Phloem lại bao gồm tế bào sống gọi thành viên ống sàng Giữa thành viên ống sàng sàng, có lỗ phép phân tử qua Các thành viên ống sàng thiếu phận nhân hay ribosom, tế bào cạnh (tế bào đồng hành) có chức trì hoạt động thành viên ống sàng Chuyển động nước, chất dinh dưỡng, đường chất thải thực nhờ truyền dẫn, hấp thụ thoát nước Sau sử dụng phương pháp trên, thu 20 phân đoạn Để kiểm tra nồng độ phân đoạn chất lượng cDNA tiến hành phép thử đánh dấu đĩa thạch Nguyên lý phép thử đánh dấu đĩa thạch là, nhuộm DNA Ethidium Bromide (EtBr), quan sát phân tử DNA sợi kép, hàm lượng DNA tỉ lệ thuận với độ sáng EtBr chiếu đèn UV Do phương pháp cho phép kiểm tra phân tử DNA thu trạng thái đơn hay kép, đồng thời bước đầu định lượng số phân đoạn có chứa nồng độ cDNA cao Kết 20 phân đoạn thể hình 3.4 Hình 3.4 Kết phép thử đánh dấu đĩa thạch Hàng trên: marker pEXP7- tet có chứa nồng độ 1; 5; 10; 25; 50 ng/µl Hàng dưới: Các phân đoạn cDNA từ 1→20 Từ kết hình 3.4 ta thấy: - Phân đoạn 1→7 không xuất chấm sáng, điều chứng tỏ phân đoạn chứa cDNA mạch đơn - Phân đoạn 8→18 thu chấm sáng khác soi đèn UV Vậy phân đoạn có chứa cDNA sợi đôi Khi so sánh với mẫu chuẩn xác định nồng độ cDNA phân đoạn dao động từ 5-25 ng/ μl Theo lý thuyết, phân đoạn đầu có kích thước lớn 0,5 kb Do đó, chúng tơi sử dụng phân đoạn có nồng độ khoảng từ đến 10 ng/µl để tiến hành gắn vào vector pDONRTM222 phản ứng BP Trong nghiên cứu sử dụng vector pDONR TM222, vector có thành phần sau: Bảng 3.1 Các thành phần vector pDONRTM222 Thành phần Chức rrnB T1 T2 trình tự Bảo vệ dịng gen từ q trình mã hóa promoter kết thúc phiên mã M13-F Cho phép đọc trình tự có định hướng theo chiều 5’ M13-R Cho phép đọc trình tự định hướng theo chiều 3’ attP1 attP2 Bổ sung với attB1 attB2 phản ứng BP Vị trí giới hạn BsrG I Cho phép phát xác định cDNA gắn vào vector Cho phép chọn lọc âm tính Gen ccdB CmR (Gen kháng Cho phép chọn lọc plasmid Chloramphenicol) Gen kháng Kanamycin Chọn lọc plasmid pUC origin Điểm khởi đầu phiên mã Hình 3.4 Sơ đồ vector pDONRTM222 Vị trí phân đoạn cDNA chèn vào vector pDONRTM222 thể hình 3.5 Hình 3.5 Vị trí phân đoạn cDNA đƣợc chèn vào vector pDONRTM222 Sau đó, chúng tơi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 Vector tái tổ hợp pDONRTM222- cDNA biến nạp vào tế bào khả biến kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 theo phương pháp xung điện Dịch khuẩn sau cấy trải mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Kanamycin 50 mg/l Trong thành phần vector pDONRTM222, quan tâm đến trình tự bao gồm gen ccdB gen kháng Kanamycin, gen phục vụ cho công việc chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp: - Các tế bào kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 dạng dại (khơng mang vector pDONRTM222, khơng mang gen kháng Kanamycin) khơng phát triển mơi trường có chứa Kanamycin - Các tế bào kháng phage ElectroMAXTM0BTMT1 mang vector pDONRTM222 khơng tái tổ hợp (có mang gen ccdB) không phát triển thành khuẩn lạc - Các tế bào kháng phage ElectroMAXTM10BTMmang vector pDONRTM222 tái tổ hợp (gen ccdB bị thay phân đoạn cDNA) phát triển thành khuẩn lạc mơi trường có bổ sung kháng sinh Kanamycin Hình 3.6 Kết chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp mơi trƣờng chứa kháng sinh Kanamycin Kết hình 3.6 cho ta thấy, trình biến nạp tế bào kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 xung điện thành công, số lượng khuẩn lạc thu môi trường chọn lọc lớn Các dòng khuẩn chứa vector pDONRTM222 tái tổ hợp mang đoạn cDNA gen kháng Kanamycin Tuy nhiên, tất khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn cDNA, xảy khả plasmid khơng chứa đoạn cDNA mà chứa adapter khuẩn mọc bình thường mơi trường có kháng sinh chọn lọc Như vậy, dòng tế bào thu dòng tế bào tiềm để tạo thư viện cDNA 3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp cắt plasmid Enzyme BrsG I Vì số lượng khuẩn lạc lớn, tiến hành chọn ngẫu nhiên 28 dịng khuẩn lạc, dịng ni ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kanamycin 50 mg/l Tiến hành tách plasmid phương pháp thủy phân kiềm có sử dụng SDS Sản phẩm tách plasmid kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1%, kết điện di hình 3.7 11 13 15 17 M 10 12 14 19 16 18 21 23 25 27 M 20 22 24 26 28 Hình 3.7 Kết tách plasmid M: Thang DNA 1kb; số 1-28: Sản phẩm tách plasmid Kết điện di hình 3.7 cho thấy, plasmid tái tổ hợp có băng rõ nét khơng bị đứt gãy, phần lớn dịng có kích thước tương tự nhau, cịn số dịng có kích thước khác biệt Điều chứng tỏ plasmid tách có chất lượng tốt đủ điều kiện để thực nghiên cứu Dựa vào kết điện di hình 3.7 ta phân dịng plasmid thành nhóm: - Nhóm I: gồm dịng plasmid 11, 15, 19, 21, 2, 4, 18 Các dòng plasmid có kích thước phân tử nhỏ dịng plasmid khác Do khơng chứa phân đoạn cDNA chứa phân đoạn cDNA có kích thước nhỏ Vì chúng tơi khơng quan tâm đến dịng - Nhóm II: gồm dịng 1, 22, 4, 6, 7, 8, 9, 5, 13, 10, 23, 24, 26, 27 Các dịng plasmid có kích thước lớn dịng Do dịng plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA có kích thước lớn 0,5kb mà chúng tơi quan tâm Để khẳng định điều này, tiến hành cắt dịng plasmid nhóm II enzyme BsrGI Nếu cấu trúc plasmid có chứa phân đoạn cDNA sản phẩm cắt gồm có hai băng, băng vector pDONRTM222 (kích thước 2,5kb), băng cịn lại đoạn cDNA chèn vào Kết điện di sản phẩm cắt gel agarose 1% thể trên hình 3.8 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm cắt M: Thang DNA 1kb Số 1, 22, 4, 6, 7, 8, 9, 5, 13, 10, 23, 24, 26, 27: Sản phẩm cắt plasmid enzyme BsrGI Kết điện di sản phẩm cắt BsrGI hình 3.8 cho thấy, số dịng plasmid có 12 dịng (1, 22, 6, 8, 9, 5, 13, 10, 23, 24, 26, 27) chứa băng điện di có kích thước 2,5 kb tương ứng với kích thước vector băng cịn lại tương ứng với kích thước đoạn cDNA quan tâm chèn vào vector Những dòng xuất băng bao gồm băng có kích thước 2,5 kb vector, hai băng cịn lại đoạn cDNA gắn vào có chứa trình tự enzyme cắt BsrGI chúng cắt thành hai băng có kích thước khác Như kết cho phép nhận định phân đoạn cDNA có kích thước khác gắn vào vector pDONRTM222 3.5 Đánh giá chất lƣợng cDNA Dùng thang DNA 1kb để xác định kích thước băng dịng chèn vào Từ kết điện di ta tính được, kích thước cDNA gắn vào vector tính tổng kích thước băng (khơng tính băng vector) Từ xác định phần trăm tái tổ hợp cách tính tỷ lệ phần trăm số dịng mang cDNA tổng số dòng thu Một thư viện cDNA đánh giá có chất lượng tốt thỏa mãn số tiêu chuẩn có tiêu chuẩn quan trọng phân đoạn cDNA chèn vào vector có kích thước lớn 0,5 kb Từ hình 3.8 chúng tơi thống kê kích thước đoạn cDNA chèn vào Kết thể bảng 3.2: Bảng 3.2: Kích thước đoạn cDNA chèn vào vector Dòng 22 Kích thước 0,75 0,6 (-) 1,2 0,9 1,6 đoạn chèn (kb) Dịng Kích thước đoạn 2,1 + 0,51 13 10 23 24 26 27 2,1 2,1 0,4 2,1 0,4 0,6 chèn (kb) Từ bảng 3.2 nhận thấy 14 dòng cDNA chèn vào vector, có 10 mẫu xuất băng có kích thước lớn 0,5kb Trong dịng số có kích thước đoạn cDNA chèn vào cao (2,1 + 0,51 = 2,61 kb) (Hình 3.7) Bên cạnh dịng 1, 22, 6, 8, 9, 13, 10, 24, 27 chứa phân đoạn cDNA có kích thước nhỏ 2.61kb khác Như vậy, thư viện cDNA bước đầu đánh giá có chất lượng tốt Khi chọn 28 dòng tế bào số dòng thu được, 12 dịng tế bào có chứa phân đoạn cDNA có kích thước khác nhau, có 10 dịng mang đoạn chèn cDNA có kích thước lớn 0,5kb, bao gồm dòng: 1, 22, 6, 8, 9, 5, 13, 10, 24 27 3.6 Giải trình tự định danh cDNA: Chúng chọn ngẫu nhiên dịng plasmid số để giải trình tự so sánh với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế để định danh trình tự thu Kết giải trình tự hình 3.9 cDNA Hình 3.9 Trình tự phân đoạn cDNA số Hình 3.10 So sánh trình tự cDNA số với trình tự Genbank (bằng BLAST) Sau giải trình tự, chúng tơi tiến hành so sánh trình tự thu với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế phương pháp BLAST trang web NCBI Kết hình 3.10 cho thấy, trình tự cDNA số khơng giống với trình tự cơng bố Genbank Như ta kết luận trình tự cDNA số chúng tơi thu trình tự hồn tồn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Đã tách chiết RNA tổng số có chất lượng tốt từ mẫu gỗ Bạch đàn urô phương pháp sử dụng CTAB 1.2 Đã tổng hơp thành công cDNA, tạo vector pDONR TM 222-cDNA tái tổ hợp mang đoạn cDNA có kích thước khác bước đầu xây dựng thư viện cDNA mẫu gỗ Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) 1.3 Đã tiến hành xác định trình tự nucleotide dịng cDNA so sánh với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI Kết cho thấy trình tự hồn tồn KIẾN NGHỊ 2.1 Tiếp tục phân tích dịng khuẩn lạc thư viện 2.2 Xác định tên trình tự cDNA thu từ thư viện TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kĩ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh Chu Hồng Mậu, Nguyễn Thị Tâm (2006), Di truyền học, NXB Giáo dục, Hà Nội Đồn Thị Thanh Nhàn (1996), Giáo trình công nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dung, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng anh Allona I., Quinn M., Shoop E., Swope K., Stcyr S., Carlis J., Riedl J., Retzel E., Campbell M., Sederoff R., Whetten R (1998), “Analysis of xylem formation in pine by cDNA sequencing”, Poceedings of the National Acadeny of Sciences of the United States of America, 95(16), 9693-9698 Altschul S., Madden T., Scherrer A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST; a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Research, 25(17), 33893402 Bartel D.P (2004), “MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function’’, Cell., 116, 281-296 10 Brautigam M., Lindlof A., Zakhrabetkova S., Ghartichhetri G., Olsson B., Olsson O (2005), “Generation and analysis of 9792 EST sequences from cold acclimated oat”, Avena sativa BMC Plant Biology, 5, 18-19 11 Brown TA (2001), “Gene Cloning- An Introduction”, 4th ed Blackwell Science, Oxford, UK 12 FAO (2005), Global Forest Resources Assessment 2005, Progress Towwards Sustainable Forest Management: FAO Forestry Paper.147 (Paperback), 129-147 13 Fleischmann W., Moeliler S., Gateau A., Apweiler R.A (1999), novel method for automatic functional annotation of proteins Bioinformatics, 15(3), 228-233 14 Fukushima K.(2001), “Regulation of syingyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis”, Journal of Plant Research, 114(4), 499-508 15 Grattapaglia D (2004), “Integrating genomics I Eucalyptus breeding”, Genetics and Molecular Research, 3(3), 369-379 16 Mullis K (1990), “The unusual origin of the polymerase chain reaction”, Sci Am., 262, 56-61 17 Murray M G., Thompson W F (1980), “Rapid isolation of high molecular weight DNA”, Nucleic Acids Res, 8, 4321-4325 18 Pandey R N., Adams R P., Flournoy L.E (1996), “Inhibition of random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) by plant polysaccharides”, Plant Mol Biol Reptr, 14, 17-22 19 Porebski S., Bailey L G., Baum B R (1997), “Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyohenol components”, Plant Mol Biol Report, 15, 8-15 20 Robinson G E., Grozinger C M , Whitfield C W (2005), “Sociogenomics: social life in molecular term”, Nat Rev Genet, 6, 257-270 21 V M Nieto, J Rodriguez (2003), Eucalyptus urophylla S T Blake, Tropical Tree Seed Manual, 473-475 22 Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O (1995), “Quantitative monitor-ing of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray”, Science, 270, 467-470 23 Wilkie S E., Issac P G., Slater R J (1993), “ Random amplification polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in Allium’’ Theor Appl Genet, 86, 497-504 PHỤ LỤC Thành phần 1lít mơi trƣờng LBi LB đặc: 15g bacto agar, 5g dịch chiết nấm men, 10g NaCl, 10g Tryptone LB lỏng: 5g dịch chiết nấm men, 10g NaCl, 10g Tryptone Trình tự Biotin-attB2 Oligo(dT) Primer Biotin-attB2 Oligo(dT) Primer thiết kế để gắn attB1 với đầu 3’ cDNA ligation adapter Trình tự attB1 Adapter Thành phần dung dịch tách plasmid Bảng Sol I Thành phần Nồng độ Thể tích (50 ml) Glucose 50mM 2M 1,25 ml 25mM Tris HCl 1M 1,25 ml 0,5M ml (pH 8.0) EDTA 10mM H2O 46,5 ml Bảng3 Sol II Thành phần Nồng độ Thể tích (50 ml) NaOH 0,2N 1N 10 ml SDS 1% 10% ml H2O 35 ml Bảng Sol III Thành phần Nồng độ Thể tích (50 ml) CH3COOK 5M 30 ml Axit acetic 11,5% 5,75 ml H2O 14,25 ml Bảng Thành phần đệm TAE 50X Thành phần Hàm lượng (1 lít) Tris-acetate 242g Acid acetic 57,1 ml EDTA 0,5M (pH 8.0) 100 ml Bảng Thành phần môi trường S.O.C Thành phần Nồng độ Yeast extract 0,5% Trypton 2% NaCl 10mM KCl 2,5mM MgSO4 10 mM MgCl2 10 mM Glucose 20mM ... urô (Eucalyptus urophylla S. T Blake) trồng Vi? ?t Nam" CHƢƠNG 1: T? ??NG QUAN T? ?I LIỆU 1.1 Giới thiệu Bạch đàn (Eucalyptus urophylla S. T Blake) nghiên cứu gen loại Chi Bạch đàn (Eucalyptus) thuộc... cDNA Hình 3.9 Trình t? ?? phân đoạn cDNA s? ?? Hình 3.10 So s? ?nh trình t? ?? cDNA s? ?? với trình t? ?? Genbank (bằng BLAST) Sau giải trình t? ??, chúng t? ?i tiến hành so s? ?nh trình t? ?? thu với trình t? ?? cơng bố Ngân... quốc t? ?? NCBI K? ?t cho thấy trình t? ?? hoàn toàn KIẾN NGHỊ 2.1 Tiếp t? ??c phân t? ?ch dịng khuẩn lạc thư viện 2.2 Xác định t? ?n trình t? ?? cDNA thu t? ?? thư viện T? ?I LIỆU THAM KHẢO T? ?i liệu tiếng Vi? ?t Lê Trần