Bài viết phân tích các độc tố nấm Aflatoxin B1, Citrinin, Ochratoxin A trên gạo và đánh giá khả năng tách chiết và tinh chế của các chất có tác động lên gạo. Để nắm nội dung mời các bạn cùng tham khảo.
Tạp chí Khoa học-Cơng nghệ Thủy sản Số 2/2006 Trường Đại học Thủy sản TÌNH HÌNH NHIỄM ĐỘC TỐ NẤM (AFLATOXIN B1, OCHRATOXIN A, CITRININ) TRÊN GẠO TẠI NHA TRANG Nguyễn Minh Trí – Khoa Chế biến Tóm tắt Bằng phương pháp tách chiết với acetonitrile/ nước (9/1), tinh chế lỏng-lỏng, định lượng HPLC, chúng tơi phân tích đồng thời độc tố nấm Aflatoxin B1 (AFB1), Citrinin (CIT), Ochratoxin A (OTA) gạo, với giới hạn định lượng theo thứ tự 0,15 ; 0,17 ; 0,26 ng/g Chúng tiến hành định lượng độc tố 64 mẫu gạo thu thập từ chợ lớn Nha Trang Nhiễm AFB1 chủ yếu Tỷ lệ nhiễm AFB1 36/64 (41%), chủ yếu mùa mưa (84%), loại gạo rẻ tiền (100%), mẫu nhiễm cao 7,2 ng/g Đặt vấn đề Hiện quan tâm nhiều đến chất lượng thực phẩm, chất lượng thực phẩm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người Có nhiều mối quan tâm, bên cạnh vấn đề giá trị dinh dưỡng, vấn đề an tồn thực phẩm đặc biệt trọng, nhiễm chất gây hại cho người kim loại nặng, thuốc trừ sâu, dư lượng phân bón, độc tố khác … Trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu gió mùa, chế độ mưa ẩm cao Điều kiện bảo quản lúa gạo quan tâm, nhiên cịn quy mơ lớn, kho lúa gạo lớn nước, kho xuất khẩu, địa phương, kho nhỏ lẻ chưa quan tâm hiểu chưa mức, hậu ảnh hưởng khơng nhỏ đến chất lượng thực phẩm cung cấp cho người dân Trong điều kiện vậy, nấm mốc phát triển sinh độc tố gọi độc tố nấm (mycotoxin), gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khoẻ người tiêu dùng, đặc biệt gây ung thư Trong kể đến Aflatoxin B1 (AFB1), Ochratoxine A (OTA), Citrinine (CIT) Để đánh giá mức độ nhiễm, tiến hành điều tra mức độ nhiễm độc tố nấm gạo (AFB1, OTA, CIT) bán chợ Nha Trang Độc tố Aflatoxin B1 Ochratoxin A Citrinin ma (g/mol) 312 403 250 2.4 Định lượng AFB1, OTA CIT HPLC Sử dụng thiết bị HPLC Nhật Để tối ưu hoá độ nhạy cảm phân tích AFB1, OTA, CIT sử dụng thơng số huỳnh quang kích thích phát xạ khác (AFB1 365 440 nm ; OTA 335 465 nm ; CIT 331 500 nm) Phân tích tiến hành cột C18 (3µm C18, 0,46 x 25 cm) Hệ thống phân tích với phase động H3PO4 (0,33 M)/ acetonitrile/ propanol-2 26 Vật liệu phương pháp 2.1 Thu thập mẫu 64 mẫu gạo lấy ngẫu nhiên chợ Nha Trang : Chợ Đầm, Chợ Xóm Mới, Chợ Vĩnh Hải, chợ Phước Thái Mẫu lấy lần vào mùa mưa mùa khơ 2.2 Hố chất Tất hoá chất (chlorua kali, acid chlohydric, acid phosphoric, …) mức PA Tất dung môi (methanol, chloroform, acetonitrile, propanol-2-ol, n-hexane) mức HPLC Nước khử ion sử dụng để chuẩn bị dung dịch dùng q trình tách chiết, tinh chế phân tích HPLC 2.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Các dung dịch chuẩn chuẩn bị 10 mg AFB1, OTA hay CIT/ml methanol Một loạt dung dịch chuẩn từ 0,3 đến 100 ng AFB1, OTA, CIT/ml chuẩn bị pha loãng Nồng độ dung dịch chuẩn gốc xác định độ hấp phụ tia cực tím (A) theo cơng thức : ρ (µg / ml ) = Dung môi Methanol Methanol Methanol λmax 360 333 321 1000ma A ε -1 ε (cm mol ) 21800 5440 5490 (650/400/50) ; tốc độ dòng 0,5 ml/ phút Thời gian lưu độc tố nấm : AFB1 14 phút, CIT 28 phút, OTA 56 phút Các sắc ký đồ phân tích dựa vào phần mềm ClassLC10 Shimadzu version 1.60 - Chiết xuất: Thêm 10 ml dung dịch KCl 4% (pH 1,5) vào 20 g mẫu nghiền nhỏ Rồi thêm vào 90 ml acetonitrile, lắc 20 phút Chất chiết lọc qua giấy lọc nhờ hút chân không - Tinh chế: 100 ml n-hexane thêm vào dịch lọc, lắc phút, sau để lắng, bỏ lớp trên, Tạp chí Khoa học-Cơng nghệ Thủy sản Số 2/2006 lặp lại bước lần Thêm vào lớp 50 ml nước khử ion, 100 ml chloroform Lớp dung môi chiết lại lần với 50 ml chloroform Trộn chung chloroform chiết Cho bay cô quay gần khô 40 C, tránh ánh sáng Bình chứa chloroform tráng rửa choloroform Mẫu gạo nhiễm Trường Đại học Thủy sản chuyển sang ống nghiệm làm khô khí nitơ 2ml methanol thêm vào, đánh siêu âm, lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ 0,45 µm Làm khơ khí nitơ 500 µl methanol thêm vào đem phân tích HPLC Gạo khơng nhiễm + độc tố nấm Hình 1: Sắc ký đồ mẫu gạo nhiễm độc tố mẫu gạo không nhiễm+độc tố chuẩn Kết thảo luận 3.1 Đánh giá khả tách chiết tinh chế phương pháp Dựa vào tính chất tan dung môi hữu giống độc tố nấm phân tích (AFB1, OTA, CIT) chúng tơi đưa phương pháp tách chiết tinh chế Đánh giá khả tách chiết tinh chế dựa vào khả thu hồi Khả thu hồi xác định cách thêm độc tố (AFB1, OTA, CIT) vào mẫu gạo sạch, sau định lượng độc tố mẫu gạo gây nhiễm Xác định tỷ lệ phần trăm định lượng Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Kết trình bày bảng Bảng 1: Tỷ lệ thu hồi độ lệch chuẩn tương đối RSD độc tố khảo sát Độc tố AFB1 CIT OTA Nồng độ gây nhiễm ng/g ng/g ng/g Tất kết thí nghiệm nằm khoảng giới hạn cho phép Châu Âu (Số 472/2002 26/2002), nồng độ gây nhiễm 1-10 ng/g, tỷ lệ thu hồi chấp nhận khoảng 70-110% RSD nhỏ 20% 3.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng Tỷ lệ thu hồi (%) 96,9 84 101,9 RSD (%) 2,7 5,2 5,7 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) xác định cách lấy 3,3 10 lần độ lệch chuẩn (theo thứ tự) chia cho độ dốc đường cong chuẩn loại độc tố Kết thí nghiệm trình bày bảng 27 Tạp chí Khoa học-Cơng nghệ Thủy sản Số 2/2006 Trường Đại học Thủy sản Bảng : Giới hạn phát giới hạn định lượng độc tố thử nghiệm LOD (ng/g) LOQ (ng/g) AFB1 0,048 0,144 CIT 0,056 0,168 OTA 0,086 0,260 Với kết thấy phương pháp nhạy, cho phép phát độc tố nấm quan tâm 0,1 ng/g; giới hạn định lượng 0,3 ng/g 3.3 Kết phân tích Kết phân tích 64 mẫu gạo chợ lớn Nha Trang trình bày bảng 3, 4, 5, Bảng 3: Kết phân tích mẫu gạo Chợ Đầm Kí hiệu 1(a) 2(a) 3(a) 4(a) 5(b) 6(b) 7(b) 8(b) 9(a) 10(a) 11(a) 12(a) 13(b) 14(b) 15(b) 16(b) Thời điểm lấy mẫu Mùa mưa Mùa mưa Mùa mưa Mùa mưa Mùa mưa Mùa mưa Mùa mưa Mùa mưa Mùa khô Mùa khô Mùa khô Mùa khô Mùa khô Mùa khô Mùa khô Mùa khô Độc tố (ng/g) AFB1