Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay, trên thị trường xuất hiện nhiều các sản phẩm làm trắng da chứa acid kojic, arbutin, hydroquinon... nhưng các chất này lại có nhiều tác dụng phụ. Do đó, nhu cầu phát triển những hợp chất thiên nhiên có tác dụng làm sáng da ngày càng tăng cao. Đề tài nhằm đánh giá tác động ức chế enzym tyrosinase kết hợp với tác động chống oxy hóa của các cao chiết từ lá Tía tô.
Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ TYROSINASE VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TÍA TƠ Nguyễn Thị Hạnh Trúc*, Nguyễn Thùy Dương*, Võ Thị Diễm*, Nguyễn Quốc Thái*, Huỳnh Ngọc Trinh* Mở đầu: Hiện nay, thị trường xuất nhiều sản phẩm làm trắng da chứa acid kojic, arbutin, hydroquinon chất lại có nhiều tác dụng phụ Do đó, nhu cầu phát triển hợp chất thiên nhiên có tác dụng làm sáng da ngày tăng cao Mục tiêu: Đề tài nhằm đánh giá tác động ức chế enzym tyrosinase kết hợp với tác động chống oxy hóa cao chiết từ Tía tơ Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Cao tồn phần (cao TP) Tía tơ chiết phương pháp ngấm kiệt với ethanol 50% Các cao phân đoạn chiết phương pháp lắc phân bố lỏng-lỏng với cloroform ethyl acetat thu cao cloroform (CF), ethyl acetat (EA), cao ethyl acetat/cloroform (EA/CF) Tác động ức chế tyrosinase cao Tía tơ đánh giá thơng qua phản ứng với L-DOPA, từ tính IC50 cao tiềm Hoạt tính chống oxy hóa xác định qua thử nghiệm DPPH Kết quả: Trong cao khảo sát, cao EA cao EA/CF thể rõ tác động ức chế tyrosinase Cao EA/CF có hoạt tính mạnh với IC50 thấp chất đối chiếu acid kojic (0,07 mg/mL so với 0,12 mg/mL) Cao có tác động chống oxy hóa mạnh với IC50= 9,47 µg/mL so với 4,6 µg/mL acid ascorbic Kết luận: Các cao chiết từ Tía tơ có tác động ức chế tyrosinase, cao phân đoạn EA/CF thể đồng thời tác động ức chế enzym tyrosinase chống oxy hóa mạnh Từ khóa: DPPH, melanin, Tía tơ, tyrosinase ABSTRACT EVALUATION OF TYROSINASE INHIBITORY EFFECT AND ANTIOXYDANT ACTIVITY OF PERILLA EXTRACTS Nguyen Thi Hanh Truc, Nguyen Thuy Duong, Vo Thi Diem, Nguyen Quoc Thai, Huynh Ngoc Trinh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 24 - No - 2020: 94 - 99 Introduction: Various whitening products containing kojic acid, arbutin, hydroquinon are currently available However, these substances have many side effects Therefore, the requirement in development of whitteners originating from natural sources is increasing Objectives: This study aimed to evaluate the inhibitory effect of tyrosinase enzyme and the antioxidant effect of perilla leaf extracts Materials and methods: Total extract (TP) was obtained by maceration method with 50% ethanol from Perilla leaves TP extract were then fractionated by liquid-liquid distribution with chloroform and ethyl acetat to obtain extracts of chloroform (CF), ethyl acetat (EA) and ethyl acetat/chloroform (EA/CF) The tyrosinase inhibitory effect of perilla extracts was assessed by reaction with L-DOPA, thereby calculating IC50 of potential extracts Antioxidant activity was determined by DPPH test Results: Among studied extracts, EA and EA/CF exhibited clearly tyrosinase inhibition effect EA/CF Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Huỳnh Ngọc Trinh ĐT: 0907733259 * 94 Email: hntrinh@ump.edu.vn B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu presented the highest activity with IC50 lower than the reference substance kojic acid (0.07 mg/mL vs 0.12 mg/mL) This extract also had strong antioxidant effect with IC50 = 9.47 µg/mL compared to 4.6 µg/mL of ascorbic acid Conclusion: All studied extracts exhibited tyrosinase inhibition effect EA/CF represented the strongest tyrosinase inhibition and antioxidant effect Key words: DPPH, melanin, Perilla, tyrosinase ĐẶT VẤNĐỀ Hiện nay, da người thường xuyên tiếp xúc với tác nhân gây tổn thương ADN từ bên ánh sáng mặt trời hay ô nhiễm môi trường Cơ thể cần có nhiều chế nội sinh nhằm chống lại sửa chữa sai hỏng này; chế quan trọng chế sản sinh sắc tố da melanin(1) Tuy nhiên, việc sản xuất mức melanin dẫn đến bất thường da nám, tàn nhang, sạm da tăng hắc tố bào (lentigo) bất thường khác gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tính thẩm mỹ người bệnh(2,3) Melanin hình thành thơng qua loạt phản ứng oxy hóa liên quan đến acid amin tyrosin với xúc tác enzym tyrosinase(4) Các chất ức chế tyrosinase an tồn hiệu khơng đáp ứng nhu cầu làm trắng da mà tảng cho việc nghiên cứu thuốc để điều trị rối loạn sắc tố da(5) Hiện nay, có nhiều hoạt chất làm trắng da sử dụng rộng rãi acid kojic, arbutin, hydroquinon chất lại có nhiều tác dụng phụ(5) Do đó, nhu cầu phát triển chất có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày tăng cao Bên cạnh đó, gốc tự khơng ngun nhân gây q trình lão hóa, ung thư, bệnh lý tim mạch… mà yếu tố thúc đẩy trình tổng hợp melanin da Các chất đánh bắt gốc tự hay ức chế hình thành gốc tự làm giảm hình thành melanin da Vì thế, ngồi chất ức chế tyrosinase tác động trực tiếp vào trình sinh tổng hợp melanin, chất chống oxy hóa thường phối hợp vào cơng thức sản phẩm làm trắng da(6) Tía tơ (Perilla frutescens (L.) Britt.) phổ biến, dễ dàng tìm thấy trồng trọt nước châu Á(7) Trong thành phần Tía tơ B - Khoa học Dược chứng minh có chứa nhiều hợp chất phenolic flavonoid cho hoạt tính chống oxy hóa tốt có tiềm ức chế enzym tyrosinase(4,8-10) Bên cạnh đó, kết thử nghiệm tác động chống oxy hóa cao chiết từ Tía tơ thu hái địa điểm khác cho thấy cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ cao toàn phần cồn 50% có tác dụng tốt nhất(9) Từ lý nêu trên, đề tài thực nhằm khảo sát tác động ức chế hình thành melanin thơng qua khả ức chế enzym tyrosinase kết hợp với tác động chống oxy hóa từ Tía tơ ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Dược liệu Tía tơ trồng thu hái Hà Nội vào tháng năm 2019 Sau thu hái, nhặt lá, rửa sạch, phơi râm cho khô; khô tiếp tục xay thành bột thơ để chiết xuất Hóa chất, trang thiết bị Enzym tyrosinase từ nấm Agaricus bisporus, L – DOPA (3,4-dihydoxy-L-phenylalanin), DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), acid kojic mua từ Sigma-Aldrich, Đức; acid ascorbic viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh; NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.12H2O, ethyl acetat, cloroform, cồn ethanol (EtOH), dimethyl sulfoxyd (DMSO) Trung Quốc Các thiết bị bao gồm: máy đo quang ELISA iMark™ Microplate Absorbance Reader, máy quang phổ UV - Vis SP 8001, máy đo pH Neo Met, bếp cách thủy Memmert, đĩa 96 giếng Phương pháp chiết xuất cao Tía tơ Bột Tía tô chiết phương pháp ngấm kiệt với cồn 50% dịch chiết khơng cịn phản ứng với thuốc thử FeCl3 5% ethanol ngừng trình chiết Tồn 95 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 dịch chiết cao toàn phần thu hồi dung môi máy cô quay chân không nhiệt độ 55 oC Dịch sau cô quay chia làm phần, phần thứ hai gấp đôi phần thứ Phần thứ tiếp tục cô bếp cách thủy đến thể chất cao đặc, thu cao toàn phần (cao TP) Phần thứ chia làm phần nhau: phần thứ lắc phân bố lỏng lỏng với ethyl acetat, phần thứ lắc với cloroform sau đến ethyl acetat; dịch lắc khơng cịn phản ứng với FeCl3 dừng q trình lắc phân bố Cơ thu hồi dung mơi thu cao phân đoạn ethyl acetat (cao EA), cao phân đoạn cloroform (cao CF) cao phân đoạn ethyl acetat sau lắc với cloroform (cao EA/CF) Các cao sau loại hết dung môi bảo quản nhiệt độ 2-8 oC trước tiến hành thí nghiệm Thử nghiệm ức chế tyrosinase in vitro Sàng lọc hoạt tính ức chế enzym tyrosinase cao Các cao hịa tan dung mơi khác đến nồng độ tối đa tan giếng phản ứng Theo đó, cao tồn phần hịa tan đệm natri phosphat 50 mM pH 6,5 nồng độ 3,4 mg/mL; cao EA EtOH nồng độ 0,75 mg/ml; cao CF EA/CF DMSO với nồng độ 0,5 mg/mL mg/mL Tyrosinase L-DOPA hòa tan đệm phosphat với nồng độ tương ứng 100U/mL 10 mM Thành phần hỗn hợp phản ứng cho vào giếng trình bày Bảng Bảng Các thành phần phản ứng Chứng Trắng (BE) chứng (B) Đệm phosphat (µL) Cao Tía tơ (µL) Dung mơi (µL) Tyrosinase 100U/ml (µL) Thử (CE) Trắng thử (C) 80 110 80 110 10 10 10 - 10 - 30 - 30 - Ủ phút 25 80 80 oC L-DOPA 10 mM (µL) 80 80 Mỗi mẫu thực giếng, sản phẩm sau phản ứng đo động học độ hấp 96 thu (Abs) sản phẩm sau phản ứng bước sóng 490 nm 10 giây thời gian 10 phút tính vận tốc phản ứng (Abs/phút) mẫu(11) Đánh giá % ức chế tyrosinase theo công thức: VCE – VC ) BE – VB % ức chế = (1 – V × 100 Trong đó: VBE : vận tốc phản ứng mẫu chứng VB: vận tốc phản ứng mẫu trắng chứng VCE: vận tốc phản ứng mẫu thử VC: vận tốc phản ứng mẫu trắng thử Xác định IC50 cao tiềm so với acid kojic Dựa vào kết sàng lọc tác động ức chế tyrosinase chọn cao có tiềm Với cao, tiến hành pha thành dãy nồng độ xác định % ức chế tyrosinase nồng độ Acid kojic dùng làm chất đối chứng dương Các thành phần phản ứng quy trình thực giống thử nghiệm sàng lọc hoạt tính ức chế enzym tyrosinase cao Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính mơ tả liên quan logC với phần trăm ức chế tyrosinase chất khảo sát: y = ax + b với y % ức chế, x log nồng độ cao giếng; từ tính tốn giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase cao chiết) Xác định khả tương tác cao tiềm với Cu2+ Các cao Tía tơ tiềm ức chế tyrosinase hòa tan DMSO đến nồng độ 0,4 mg/ml Nhằm đánh giá sơ khả tương tác với ion Cu(II) cao chiết, giúp xác định chế tác động cao chiết với enzym tyrosinase, nồng độ cao chiết giếng phản ứng cố định 60 μg/ml, sau cho vào mẫu cao tiếp xúc với dung dịch CuSO4 nồng độ khác (từ mM đến mM) so với mẫu dung dịch CuSO4 mM Sau ủ 25 oC 10 phút đo phổ hấp thu bước sóng từ 190 đến 600 nm để đánh giá chuyển dịch bước sóng hấp thu hỗn hợp phản ứng(12) B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vitro Các cao Tía tơ tiềm pha thành dãy nồng độ khác cho phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH (0,5 mL) eppendorf Lắc hỗn hợp phản ứng, để yên tối nhiệt độ phòng thời gian 30 phút Sau cho mẫu vào cuvet, đo quang máy UV-Vis bước sóng 515 nm(9) Sử dụng acid ascorbic làm chứng dương, so sánh khả đánh gốc tự cao tiềm Mỗi mẫu thực lần lấy giá trị trung bình Phần trăm đánh bắt gốc tự tính theo cơng thức: % đánh bắt = (1 – ) x 100 Trong đó: ABE : độ hấp thu mẫu chứng Nghiên cứu tyrosinase giá trị IC50 cao trình bày Bảng Bảng Sàng lọc hoạt tính ức chế tyrosinase cao Tía tơ Cao Tía tơ Cao TP Cao CF Cao EA Cao EA/CF Nồng độ tối đa % ức chế enzym (%) 3,4 mg/mL 46,58 ± 14,52 0,5 mg/mL 37,42 ± 12,93 0,75 mg/mL 68,44 ± 0,57 mg/mL 68,74 ± 6,48 Bảng IC50 cao tiềm so với acid kojic thử nghiệm ức chế tyrosinase Phương trình hồi quy IC50 (mg/mL) Cao EA y = 28,213x + 73,749 (R2 = 0,996) 0,14 Cao EA/CF y = 16,579x + 68,679 (R2 = 0,998) 0,07 Acid kojic y = 33,537x + 80,685 (R2 = 0,980) 0,12 Kết cho thấy giá trị IC50 cao EA AB: độ hấp thu mẫu trắng chứng xấp xỉ với giá trị chất đối chiếu acid ACE: độ hấp thu mẫu thử kojic cao EA/CF có IC 50 thấp AC: độ hấp thu mẫu trắng thử acid kojic Điều chứng tỏ hoạt tính ức Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính chế tyrosinase tương đối mạnh cao mô tả liên quan logC phần trăm khảo sát đánh bắt DPPH; từ suy giá trị IC50 Tương tác cao ion Cu2+ chất khảo sát Khi cao tiếp xúc với dung dịch đồng có gia tăng độ hấp thu khoảng bước sóng 350-450 nm cao EA 380-470 nm cao EA/CF làm xuất peak đặc trưng phổ hấp thu so với phổ CuSO4 cao chiết (Hình 1A Hình 1B) Sự xuất peak cho thấy có thành lập phức hợp ion Cu2+ thành phần cao chiết; phức hợp làm thay đổi độ hấp thu hỗn hợp cao Tía tơ với CuSO4 bước sóng khác so với mẫu có cao Tía tơ (mẫu CuSO4 0,00 mM) mẫu khơng có cao Tía tơ mà có Cu2+ nồng độ 3,00 mM Khảo sát thay đổi độ hấp thu hỗn hợp cao chiết CuSO4 bước sóng 400 nm cịn cho thấy độ hấp thu hỗn hợp phụ thuộc theo logarit nồng độ CuSO4 (Hình 1C Hình 1D) KẾT QUẢ Tác động ức chế tyrosinase in vitro Sàng lọc hoạt tính ức chế enzym tyrosinase cao Hoạt tính ức chế tyrosinase cao nồng độ cao tan giếng trình bày bảng Trong cao Tía tơ khảo sát, cao EA cao EA/CF có phần trăm ức chế tyrosinase lớn 50% nồng độ cao giếng Do hai cao lựa chọn để tiếp tục xác định nồng độ IC50 (Bảng 2) Xác định IC50 cao tiềm acid kojic Phương trình hồi quy tương quan lgC cao EA cao EA/CF với phần trăm ức chế B - Khoa học Dược 97 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 B A C D Hình Phổ hấp thu cao EA (Hình A) cao EA/CF (Hình B) với CuSO4 nồng độ khác đồ thị tương quan log [CuSO4] với thay đổi độ hấp thu hỗn hợp cao EA (Hình C) cao EA/CF (Hình D) CuSO4 bước sóng 400 nm Hoạt tính chống oxy hóa in vitro Kết thử nghiệm tác động ức chế tyrosinase cao chiết Tía tơ cho thấy cao EA cao EA/CF hai cao tiềm nên cao tiếp tục đánh giá hoạt tính chống oxy gấp lần, cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tốt cao Bảng Phần trăm đánh bắt DPPH dãy nồng độ cao EA Cao EA hóa so sánh với chất đối chiếu acid ascorbic Phương trình hồi quy tương quan Cao EA/CF lgC cao EA cao EA/CF với phần trăm Acid ascorbic đánh bắt gốc tự DPPH giá trị IC50 Phương trình hồi quy y = 59,558x – 30,469 (R2 = 0,979) y = 78,273x – 26,336 (R2 = 0,998) y = 113,86x – 25,477 (R2 = 0,984) IC50 (µg /mL) 22,44 9,45 4,6 cao trình bày Bảng So cao BÀNLUẬN Tía tơ thử nghiệm, cao EA/CF có IC50 nhỏ Các chất ức chế tyrosinase sử dụng y khoa để điều trị bệnh tăng sắc tố da mà thành phần phổ biến mỹ phẩm làm trắng da Kết từ đề tài cho thấy cao Tía tơ khảo sát, cao EA khoảng 0,42 lần cao EA, chứng tỏ hoạt tính chống oxy hóa mạnh cao EA/CF Ngồi ra, so với acid ascorbic, IC50 cao EA/CF 98 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 cao EA cao EA/CF cao tiềm năng, có đồng thời tác động ức chế tyrosinase hoạt tính chống oxy hóa Điều cao EA cao EA/CF tập trung nhiều chất phân cực thuộc nhóm polyphenol nhóm hợp chất flavonoid, nhóm hợp chất nhiều nghiên cứu chứng minh có tác động ức chế tyrosinase(4,8) Tyrosinase enzym có chứa đồng, nhiều chất ức chế tyrosinase dựa khả tạo phức với đồng đồng đóng vai trị quan trọng hoạt động enzym này(12) Trong vùng UV-Vis khảo sát có dịch chuyển bước sóng tăng độ hấp thu vùng phổ đặc trưng cho phức đồng với cao chiết chứng tỏ có tương tác thành phần cao EA cao EA/CF với Cu2+(13) Điều dự đốn số thành phần có cao Tía tơ thử nghiệm ức chế hoạt động tyrosinase theo cách tương tác với đồng vị trí hoạt động enzym Bên cạnh đó, hoạt tính chống oxy hóa cao EA cao EA/CF góp phần quan trọng tác động ức chế tyrosinase cao Các kết hoạt tính ức chế tyrosinase tác động chống oxy hóa cao chiết phân đoạn từ Tía tô cho thấy tiềm ứng dụng cao chiết Các nghiên cứu sâu cần thực để đánh giá tác dụng làm sáng da, điều trị rối loạn sắc tố da thông qua ức chế q trình tổng hợp melanin mơ hình tăng sắc tố da động vật thử nghiệm KẾT LUẬN Ngồi hoạt tính chống oxy hóa, cao chiết từ Tía tơ cịn có tác động ức chế tyrosinase, cao phân đoạn EA cao EA/CF thể rõ tác động thông qua tương tác với Cu2+ Đây tác dụng sinh học mới, cần nghiên cứu sâu nhằm phát triển chế phẩm an tồn hiệu từ Tía tô dược mỹ phẩm B - Khoa học Dược Nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 Brenner M, Hearing VJ (2008) The protective role of melanin against UV damage in human skin Photochemistry Photobiology, 84(3):539-549 No JK, Kim YJ, Shim KH, et al (1999) Inhibition of tyrosinase by green tea components Life Sciences, 65(21):PL241-PL246 Anderson RT, Rajagopalan R (1997) Development and validation of a quality of life instrument for cutaneous diseases Journal of the American Academy of Dermatology, 37(1):41-50 Kim YJ, Uyama H (2005) Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future Cellular Molecular Life Sciences CMLS, 62(15):1707-1723 Ya W, Chun-Meng Z, Tao G, et al (2015) Preliminary screening of 44 plant extracts for anti-tyrosinase and antioxidant activities Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 28(5):1737-1744 Huang HC, Wang HF, Yih KH, et al (2012) The dual antimelanogenic and antioxidant activities of the essential oil extracted from the leaves of Acorus macrospadiceus (Yamamoto) FN Wei et YK Li Evidence-Based Complementary Alternative Medicine, DOI:10.1155/2012/781280 Ahmed H (2019) Ethnomedicinal, phytochemical and pharmacological investigations of Perilla frutescens (L.) Britt Molecules, 24(1):102 Hong E, Park KH, Kim GH (2011) Phenolic‐enriched fractions from Perilla frutescens var acuta: Determinating rosmarinic acid and antioxidant activity Journal of Food Biochemistry, 35(6):1637-1645 Huỳnh Ngọc Trinh, Lê Thị Mưu Huỳnh, Phạm Quỳnh Hương, et al (2019) Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa in vitro cao chiết từ Tía tơ thu hái địa điểm khác Dược Học, 517(59):47-51 Nguyễn Thị Ngọc Thúy, Nguyễn Thị Thu Huyền, Trương Quang Duy, et al (2018) Ảnh hưởng dung môi pH đến trình trích ly hợp chất có khả kháng oxy hóa từ Tía tơ (Perilla frutescens) Khoa Học Cơng Nghệ Thực Phẩm, 14(1):66-74 Huang HC, Hsieh WY, Niu YL, et al (2012) Inhibition of melanogenesis and antioxidant properties of Magnolia grandiflora L flower extract BMC Complementary Alternative Medicine, 12:72, DOI:10.1186/1472-6882-12-72 Pintus F, Spano D, Corona A, et al (2015) Antityrosinase activity of Euphorbia characias extracts PeerJ, 3:e1305; DOI: 10.7717/peerj.1305 Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, et al (2000) Flavonols from Heterotheca inuloides: tyrosinase inhibitory activity and structural criteria Bioorganic & Medicinal Chemistry, 8:1749-55 Ngày nhận báo: 14/05/2020 Ngày phản biện nhận xét báo: 31/05/2020 Ngày báo đăng: 20/07/2020 99 ... tính ức chế enzym tyrosinase cao Hoạt tính ức chế tyrosinase cao nồng độ cao tan giếng trình bày bảng Trong cao Tía tơ khảo sát, cao EA cao EA/CF có phần trăm ức chế tyrosinase lớn 50% nồng độ cao. .. nghiệm ức chế hoạt động tyrosinase theo cách tương tác với đồng vị trí hoạt động enzym Bên cạnh đó, hoạt tính chống oxy hóa cao EA cao EA/CF góp phần quan trọng tác động ức chế tyrosinase cao Các. .. chống oxy hóa in vitro Kết thử nghiệm tác động ức chế tyrosinase cao chiết Tía tơ cho thấy cao EA cao EA/CF hai cao tiềm nên cao tiếp tục đánh giá hoạt tính chống oxy gấp lần, cho thấy hoạt tính chống