Chương 6: Sức sống và bệnh hạt giống Khái niệm: Năm 1876 Fredrich Noble lần đầu tiên đưa ra khái niệm sức sống, ông giới thiệu một thuật ngữ Tricbkraft với nghĩa là lực truyền hoặc cường độ của mầm để tryền đạt ý tưởng về sức sống hạt giống.
CHƯƠNG SỨC SỐNG VÀ BỆNH HẠT GIỐNG 6.1 Sức sống hạt giống 6.1.1 Khái niệm Năm 1876 Fredrich Noble lần đưa khái niệm sức sống, ơng giới thiệu thuật ngữ Tricbkraft với nghĩa “lực truyền” cường ñộ mầm ñể truyền ñạt ý tưởng sức sống hạt giống Ngoài tỷ lệ nảy mầm tốc độ đồng nảy mầm thông số quan trọng ñể ñánh giá chất lượng hạt giống ðến năm 1950 hội nghị kiểm nghiệm hạt giống Quốc tế bắt ñầu quan tâm ñến vấn ñề sức sống hạt giống Các phịng thí nghiệm Châu Âu Mỹ năm 1950 ñưa kết kiểm nghiệm nảy mầm chưa thống Frank cho khác khái niệm phương pháp kiểm nghiệm nảy mầm phịng thí nghiệm Các phịng thí nghiệm Châu Âu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nảy mầm với hạt ñậu ñiều kiện tối ưu, mơi trường đặc thù gạch vụn đất để ñánh giá sức sống hạt giống Các phòng kiểm nghiệm Mỹ sử dụng ñất gần Châu Âu ñể kiểm nghiệm ñánh giá sức khoẻ Có sai khác giá trị tỷ lệ nảy mầm ñồng ruộng phòng kiểm nghiệm, sai khác hai yếu tố: Thứ kiểm nghiệm phịng thử điều kiện mơi trường, ñộ ẩm, ánh sáng ñiều kiện khác tối ưu, ñổng ruộng phụ thuộc vào ñiều kiện tự nhiên, tỷ lệ mầm phịng cao đồng ruộng Thứ hai nảy mầm tự nhiên sai khác với phịng kiểm nghiệm hạt bị hư hỏng q trình gieo điều kiện tự nhiên, đồng ruộng xác định nảy mầm hay khơng nảy mầm mà khơng đánh giá sức khỏe mầm tiềm dự trữ hạt Chính ñiều gợi ý cần có phương pháp kiểm nghiệm sức sống hạt giống để cung cấp thơng tin chất lượng hạt giống ðịnh nghĩa sức sống hạt giống ñã ñược ñề xuất ñến năm 1972 Haydecker Perry,1978 Hiệp hội kiểm nghiệm hạt giống quốc tế “ International Seed Testing Association” ñịnh nghĩa: “Sức sống hạt giống tổng tồn đặc tính xác ñịnh tiềm hạt hoạt ñộng sống, thực hoạt ñộng trao ñổi chất vật chất lượng trình nảy mầm xuất con” Năm 1979 Uỷ ban phân tích sức khoẻ hạt giống Quốc tế ñưa ñịnh nghĩa khác “ Sức sống hạt giống đặc tính hạt xác ñịnh tiềm nảy mầm nhanh, ñồng phát triển thành bình thường điều kiện rộng ñồng ruộng” Như khái niệm phản ánh khả hạt: + Hoạt ñộng trao đổi chất phản ánh: Q trình sinh hố phản ứng hố học khác q trình nảy mầm phản ứng enzim hoạt động hơ hấp hạt + Tỷ lệ nảy mầm cao, ñồng sinh trưởng + Tỷ lệ nhú con, ñồng sinh trưởng ñồng ruộng Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 92 + Khả nhú ñiều kiện phù hợp 6.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sức sống hạt giống Hình thành phát triển hạt trải qua loạt giai đoạn từ phát triển hình thành hạt, tích luỹ dinh dưỡng, chín, làm khơ, ngủ nghỉ Mỗi giai đoạn có thay đổi hình thái sinh lý thay đổi tiềm hạt Tại thời ñiểm hạt ñạt khối lượng tối ña tối ña gọi giai ñoạn chín sinh lý Cũng thời ñiểm tiềm sức sống nảy mầm tối đa Tuy nhiên thời điểm chín sinh lý hạt có độ ẩm cao khơng an tồn cho bảo quản phải đảm bảo q trình chín sau thu hoạch với hàm lượng nước thấp bị gây hại học mức nhỏ Thời gian chín sinh lý đến thu hoạch hạt bảo tồn cần thiết khơng để giảm độ ẩm mà cịn ảnh hưởng ñến chất lượng hạt Các yếu tố ảnh chủ yếu hưởng ñến sức sống hạt giống: + Yếu tố di truyền + Môi trường dinh dưỡng mẹ + Giai đoạn chín thu hoạch + Kích thước hạt + Khối lượng hạt + Tính tồn vẹn hạt + Sự hư hỏng tuổi hạt + Sâu bệnh 6.1.2.1 Vật chất di truyền Trong nhiều năm nhà chọn giống trồng khơng ý đến sức sống hạt giống mà tập trung cố gắng tăng suất Các nhà chọn giống cải tiến ñặc ñiểm hạt ñộ chắc, chống chịu sâu bệnh, hàm lượng protein kích thước hạt Những yếu tố hướng ñến khả nảy mầm ñồng ruộng tốt thường cho suất cao Ngoài nảy mầm biểu lý học sức sống hạt giống cần quan tâm Sức sống hạt giống liên quan ñến ưu lai, yếu tố liên quan ñến sức sống hạt ñều nhân tố di truyền ñiều khiển + Sức sống ưu lai Sức sống ưu lai tổ hợp ưu bố mẹ di truyền sang hệ lai, có giá trị số tính trạng cao bố mẹ Sự vượt lên lai biểu cao ñiều kiện bất thuận (stress condition) điều kiện thuận lợi.Ví dụ hạt ngơ lai, lúa lai nảy mầm sinh trưởng nhanh hẳn bố mẹ chúng Tiềm sinh trưởng quan tử hệ thống enzim bổ sung giúp tăng hiệu hấp thu sử dụng carbon + ðộ hạt Hạt cứng đặc tính di truyền khơng phù hợp với cơng nghệ hạt giống biến động cực ñoan nảy mầm tỷ lệ ñậu hạt, gần xem xét tính trạng hạt cứng số giống trồng nhằm giúp bảo vệ tuổi thọ hạt liên kết tính trạng với dinh dưỡng trình hấp thụ Hạt cứng hạn chế dễ dàng lai dòng hạt mềm với dòng cứng hệ F1 dạng trung gian gần mềm, tính thấm hạt hệ F2 mức trung Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 93 bình hai bố mẹ Kết tính trạng hạt cứng điều khiển vài gen Kyle Randall, 1963 Kiểm nghiệm hạt giống lồi đậu miền cực Bắc Mexican cho thấy lỗ lỗn vị trí hút nước ñậu miền Bắc ñậu Mexican hút nước sống rốn hạt Tính khơng thấm noãn rốn hạt gen lặn liên kết chặt với gen P hạt ñậu trắng Mặc dù lai loại ñậu ñỏ trắng ñã nhận ñược loại hạt ñậu trắng mềm + Tính trạng dễ tổn thương giới hạt Tổn tương giới xảy trình thu hoạch, chế biến hạt giống, tính trạng mẫn cảm tổn thương giới ñiều khiển di truyền Barriga 1961 ñã chứng minh 41 giống ñậu biển chống chịu với va ñập giới khác Atkin,1958 Wester,1970 chứng minh giống ñậu nổ chống chịu giới tốt giống ñậu trắng Walters Caviness nghiên cứu sức sống hạt đậu tương xác định tính trạng mẫn cảm tổn thương giới tính trạng di truyền số lượng chọn giống quan tâm cải tiến chất lượng hạt thông qua chọn tạo giống cải tiến tính trạng + Thành phần hố học hạt Cải tiến chất lượng dinh dưỡng hạt thường liên quan đến sức sống hạt giống, ví dụ giống ngơ có hàm lương lysine cao thường gặp vấn đề tăng chất lượng hạt giống sức khoẻ hạt giống yếu, hạt nhỏ, hạt co ngót, méo mó Các nhà chọn tạo giống trồng cố gắng tìm hệ thống gen ñiều khiển chất lượng dinh dưỡng không làm giảm sức sống sức khoẻ hạt giống Nass Crane ,1970 tìm nhiều gen ñiều khiển biểu nội nhũ ảnh hưởng ñến nảy mầm hạt 15 , 20 25 oC Những hạt chứa gen A1 tạo hạt giống có sức khoẻ tốt khơng chứa gen Ullrich Eslick so sánh ảnh hưởng gen nội nhũ co ngót với khối lượng hạt lúa mạch, phạm vi biến dị từ 38 đến 95% bình thường, chất lượng hạt giống cải tiến chọn lọc 6.1.2.2 Môi trường trình phát triển hạt Mơi trường ảnh hưởng đến phát triển chất lượng hạt giống sản xuất hạt giống cần thực vùng có điều kiện thuận lợi phù hợp với lồi trồng để đảm bảo chất lượng hạt giống.Ví dụ sản xuất hạt giống số loại cỏ thức ăn gia súc cỏ nấm dày, cỏ thảm Tây Bắc Thái Bình Dương cho chất lượng hạt giống tốt hạt chín, khơ thu hoạch khơng gặp thời tết bất thuận mưa ñộ ẩm cao Những vùng có tưới California, Idaho Mỹ nơi sản xuất hạt giống bông, rau , hoa thức ăn gia súc họ ñậu chất lượng cao độ ẩm khơng khí thấp, lượng mưa nhỏ nhiệt độ ơn hồ ðiều kiện mơi trường làm giảm sâu bệnh hại hạt rủi ro giai ñoạn thu hoạch Mặc dù sản xuất hạt giống vùng tiêu thụ giảm chi phí vận chuyển, cơng ty đơn vị sản xuất cần chọn ñịa ñiểm sản xuất ñáp ứng hai yêu cầu chất lượng giảm chi phí, hạ giá thành + ðộ ẩm dinh dưỡng ñất ðộ ẩm khơng phù hợp giai đoạn phát triển hạt dẫn ñến sức khoẻ hạt giống thấp, ñộ phì ñất thấp dẫn ñến hạt nhỏ, hạt ñược tạo từ ñiều kiện dinh Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 94 dưỡng ñầy ñủ xung quanh ruộng hạt thường có sức sống sức khoẻ tốt Legatt 1948 chứng minh hạt ñậu thiếu hụt Bo tạo khơng bình thường tình trạng khắc phục bón Bo trực tiếp sản xuất hạt Hạt đậu tương sản xuất nơi đất có molypden cao chúng khơng u cầu bón phân molypđen trồng Lạc mẫn cảm ñặc biệt với ñất thiếu nguyên tố vi lượng đất có Bo Ca thấp gây biến màu mầm, rễ sinh lý rễ hút nước bị phá vỡ ñất thiếu hụt Ca Phân đạm bón cho lúa mỳ ngun nhân tăng protein hạt, tỷ lệ nảy mầm sức khoẻ hạt giống tăng hàm lượng protein hạt lúa mỳ tăng + ðộ chín hạt Rất nhiều thơng tin chứng minh có mối quan hệ độ chín, kích thước hạt sức sống hạt giống(Haydecker, 1972 Mc Donald ,1975) Mơi trường q trình chín khơng ảnh hưởng trực tiếp đến sức sống tiềm hạt liên quan đến độ đẫy hạt Hạt ñậu tương lớn biểu nảy mầm, sức sống tiềm năng suất tốt hạt ñậu tương nhỏ Một nghiên cứu khác lại cho kết hạt đậu tương trung bình có sức sống hạt giống tốt loaị hạt lớn hạt nhỏ Hạt ngô lai tỷ lệ nảy mầm không phụ thuộc vào kích thước hạt Như sức sống hạt giống phụ thuộc chủ yếu vào độ chín hạt khơng phải kích thước hạt lớn hay nhỏ + Mơi trường thu hoạch sau thu hoạch Hạt giống bị hư hỏng sau chín, trước thu hoạch ảnh hưởng mơi trường vấn đề nghiệm trọng miền ðơng nước Mỹ điều kiện ẩm độ cao, mưa nhiều nhiệt độ ấm gây gía trị gieo trồng sức sống hạt giống giảm nhanh Simpson Stone ,1935 chứng minh hạt giống khả gieo trồng 20 - 30% sau tuần điều kiện mưa tỷ lệ cịn cao với lồi nang mở vỏ Hạt ñậu tương thu hoạch ñiều kiện mưa ẩm ñộ cao khả gieo trồng, tổn thương trình thu hoạch, chế biến bảo quản Thí nghiệm thời vụ trồng điều kiện thu hoạch ñến chất lượng hạt giống ñậu tương Green ,1966 chứng minh đậu tương trồng sớm, chín vào thời kỳ nóng, thời tiết khơ chất lượng hạt giống thấp trồng muộn tránh ñược thời tiết Sức sống hạt giống bị ảnh hưởng trước thu hoạch cịn ngun nhân nhiễm nấm, tăng nhiệt độ ñộ ẩm + Bảo quản hạt giống Hạt giống sau thu hoạch gieo trồng khơng qua thời gian bảo quan thời gian bảo quản, phương pháp bảo quản môi trường bảo quản ( nhiệt độ, độ ẩm hàm lượng oxy) có ảnh hưởng ñến sức sống hạt giống Theo George (1980), ñộ ẩm an toàn với hạt dự trữ tinh bột 12%, bảo quản hạt giống chứa dầu 9%, hạt giống để dự trữ bình thờng 6-8% 6.1.3 Nguyên lý kiểm tra sức sống hạt giống 6.1.3.1 Chỉ tiêu kiểm nghiệm sức sống hạt giống Một yêu cầu kiểm nghiệm sức khoẻ hạt giống phải nhận biết tiêu lượng hố được, thơng thường tiêu xác định suy giảm hạt giống Tất thay ñổi trình hư hỏng hạt giống ñã xảy Trường ðại học Nông nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống cơng nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 95 dự đốn xu hướng xảy với chất lượng hạt Một mơ hình lý thuyết Delouche Baskin phát triển năm 1973 ñưa số tiêu để xác định sức sống hạt giống sau: - Tính tồn vẹn tế bào tiêu ñánh giá sức sống hạt giống trước ñánh giá nảy mầm, tiêu phản ánh khả hạt bảo tồn, sức nảy mầm, chống xâm nhập nước, nấm bệnh vi khuẩn virus Thành tế bào cần thiết cho nhiều hoạt ñộng trao ñổi chất hạt giống như: hoạt ñộng hô hấp, cung cấp cho hạt lượng cho hoạt động tiếp tục q trình nảy mầm sinh trưởng Màng lưới nội chất quan tử màng tế bào có nhiều enzim hình thành axít ribonucleic mã di truyền Do suy giảm chức thành tế bào giảm lượng tổng số ATP hình thành Nhiều nghiên cứu kết luận suy giảm màng (memberance) dẫn ñến suy giảm hư hỏng hạt giống - Những nghiên cứu mức ATP, RNA hơ hấp suy giảm, đồng thời thúc đẩy già hóa hạt giống nhanh sau bảo quản Tiếp theo suy giảm khả hơ hấp, hoạt động hố sinh, mức độ đồng giảm tỷ lệ nảy mầm ñến mức thấp - Một nguyên nhân khác hư hỏng hạt giống môi trường bảo quản nhiễm sâu bệnh dẫn ñến giảm tỷ lệ nảy mầm ñồng ruộng Những nguyên nhân gây suy giảm chất lượng hạt giống dẫn ñến hậu cuối ảnh hưởng ñến suất trồng Biểu hay suy giảm chất lượng hạt giống xảy tiêu riêng rẽ tăng số khơng bình thường tổ hợp tiêu kiểm nghiệm - Chỉ tiêu cuối ñể ñánh giá sức khoẻ hạt giống tỷ lệ nảy mầm tiêu quan trọng xác ñịnh sức sống hạt giống tiêu bổ sung thêm cho kiểm nghiệm nảy mầm hạt giống Thay đổi sinh lý, sinh hố xảy q trình hư hỏng hạt giống xác ñịnh qua nhiều tiêu, kiểm nghiệm hạt giống tập trung xác ñịnh hay số tiêu Trên sở số tiêu kiểm nghiệm sức sống hạt giống phân loại kiểm nghiệm 6.1.3.2 Phân loại kiểm tra sức sống hạt giống Isely, 1957 chia kiểm nghiệm sức sống hạt giống làm loại kiểm nghiệm trực tiếp kiểm nghiệm gián tiếp + Kiểm nghiệm trực tiếp kiểm nghiệm trực tiếp ñồng ruộng với số phương pháp xác ñịnh ñược khả nảy mầm ñiều kiện bất lợi ñồng ruộng ví dụ kiểm nghiệm đánh giá sức sống hạt giống ñiều kiện lạnh ñưa hạt giống thử đồng ruộng nơi có nhiệt độ thấp, độ ẩm hệ vi sinh vật tự nhiên + Kiểm nghiệm gián tiếp xác ñịnh thành phần sinh lý đặc thù hạt, ví dụ kiểm tra độ dẫn điện để giám định tính tồn vẹn tế bào Mặc dù đánh giá gián tiếp sai lệch cần kết hợp ñánh giá nhiều tiêu sinh lý ñánh giá ñiều kiện tự nhiên ñồng ruộng Phương pháp ñộ dẫn ñiện xác định mức độ hồn chỉnh hình thái, ảnh hưởng vi sinh vật ñất yếu tố khác thường ñánh giá không ñầy ñủ Kiểm nghiệm sức Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 96 sống hạt giống phân loại sở tổ hợp tiêu xác ñịnh sức sống hạt giống Woodstock, 1973 chia kiểm nghiệm sức sống hạt giống kiểm nghiệm sinh hoá kiểm nghiệm sinh lý + Kiểm nghiệm sinh lý xác định số khía cạnh nảy mầm hạt sinh trưởng + Kiểm nghiệm sinh hố đánh giá phản ứng hố học hoạt động enzim hơ hấp liên quan ñến biểu nảy mầm Mc Donand bổ xung thêm kiểm nghiệm vật lý kích thước hạt, mật độ hạt, độ chín hạt có liên quan ñến sức sống hạt giống Một phương pháp khác ñể xác ñịnh sức sống hạt giống phân hai loại là: Kiểm nghiêm môi trường bất thuận kiểm nghiệm nhanh + Kiểm nghiệm môi trường bất thuận (stress test) kiểm nghiệm hay số mơi trường khác nhau, điều kiện mơi trường nhiệt độ nhiệt độ cao, nhiệt độ thấp, có đất hay khơng đất, loại đất cho vào mơi trường đánh giá có tính chất khác Phương pháp kiểm nghiệm thực chủ yếu ñánh giá nảy mầm (lá mầm, chiều dài mầm ) + Phương pháp kiểm nghiệm nhanh với phản ứng hố học liên quan đến sức sống hạt giống, không thời gian dài kiểm nghiệm ñiều kiện bất thuận 6.1.3.3 Nguyên tắc kiểm tra sức sống hạt giống + Chi phí thấp: chi phí lao động, trang thiết bị phịng thí nghiệm, phương tiện dụng cụ cần tính tốn kỹ lưỡng khơng chi phí kiểm nghiệm mẫu hạt giống cao khó thực tế chấp nhận + Nhanh: Có nhiều phương pháp kiểm nghiệm nhiện lựa chọn phương pháp cho kết nhanh ñể ñáp ứng yêu cầu sản xuất nhà kinh doanh hạt giống + Khơng phức tạp: Phương pháp đơn giản, phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm trang thiết bị có để khơng phải trang bị hay đào tạo bổ sung + ðạt ñược mục tiêu kiểm tra: ñảm bảo ñộ xác theo tiêu chuẩn tiêu kiểm nghiệm + Kết kiểm nghiệm phải tương ñương thực tế ñồng ruộng 6.1.4 Các phương pháp kiểm tra sức sống hạt giống Thông thường kiểm nghiệm sức sống hạt giống thực hienẹ ñiều kiện tối ưu kết thường cao thực tế đồng ruộng Vì ngồi kiểm nghiệm phịng cần thiết phải kiểm nghiệm ñồng ruộng ñể ñánh giá bổ sung kết kiểm nghiệm ñáng tin cậy Một số phương pháp kiểm nghiệm sức sống hạt giống ñược người sản xuất kinh doanh chấp nhân trình bày 6.1.4.2 Xử lý lạnh Kiểm tra ñiều kiện lạnh phương pháp sớm ñể ñánh giá sức khoẻ hạt giống, ñược áp dụng rộng rãi với ngơ, đậu tương số trồng khác Nguyên lý chung phương pháp là: Hạt ñặt mơi trường đất giấy thấm Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 97 lạnh cho giai ñoạn ñặc thù, giai ñoạn hoạt ñộng hấp phụ, nhiệt ñộ có hoạt ñộng vi sinh vật xảy ñối với hạt Sau xử lý lạnh ñưa hạt vào ñiều kiện thuận lợi cho nảy mầm sinh trưởng để đánh giá Khó khăn lớn xử lý lạnh đất (mơi trường) khơng đồng độ ẩm, pH, hệ vi sinh vật gây sai số kiểm nghiệm Một số ý kiến cho sử dụng dung dịch ñất ñể biến động mơi trường nhỏ nhất, lại khơng gần với điều kiện tự nhiên đồng ruộng Khi số lượng lớn mẫu lớn cần xử lý nhà (thay cho phịng thí nghiệm) 6.1.4.2 Xử lý thúc đẩy già hố nhanh(Accelerated Aging (AA) Test) Phương pháp kiểm nghiệm kết hợp chặt chẽ nhiều tính trạng quan trọng kiểm nghiệm sức sống hạt giống Ban ñầu phương pháp ñược ñề xuất ñể ñánh giá khả bảo quản hạt giống ðây phương pháp kiểm nghiệm nhiều tính trạng mong muốn lần kiểm nghiệm sức sống hạt giống Nguyên lý phương pháp xử lý hạt thời gian hai mơi trường thay đổi ngun nhân hạt bị suy giảm nhanh, lơ hạt có sức sống cao suy giảm chậm lơ hạt có sức sống thấp gặp ñiều kiện áp lực nhiệt ñộ cao ẩm ñộ cao ñiều kiện xử lý Phương pháp thực sau: + Hạt không hấp thụ ñiều kiện nhiệt ñộ cao ( 41oC) ñộ ẩm (100%) thời gian ngắn - ngày + Hạt sau xử lý chuyển ñiều kiện nảy mầm tối ưu Phương pháp nhanh, tốn sử dụng cho tất loài đánh giá hạt Phương pháp cho kết ñáng tin cậy ñể xác ñịnh sức sống hạt giống, cần ý ñộ ẩm hạt trước xử lý 6.1.4.3 Kiểm tra thơng qua tính dẫn điện Hạt có sức sống yếu biểu qua đặc điểm tính tồn vẹn thành tế bào hư hỏng bảo quản hay gây hại học Trong trình hấp thụ, hạt có cấu trúc màng khơng bền vững phóng thích dung dịch tế bào chất mơi trường, dung dịch có đặc tính dẫn điện phát máy đo độ dẫn điện(conductivity meter) Xác định tính dẫn ñiện qua chất thấm lọc hạt thực nhanh, xác ít, tốn thực ñơn giản Mặc dù ñộ ẩm ban ñầu hạt, kích thước hạt có ảnh hưởng đến tỷ lệ chất phóng thích từ hạt nên cần có tiêu chuẩn định Xử lý hạt chất kháng sinh ảnh hưởng đến tính dẫn điện nên phải làm chất xử lý hạt trước kiểm nghiệm phương pháp Một hạn chế phương pháp số mẫu hạt kiểm tra 25 hạt trở lên, kết tính dẫn điện phản ánh gía trị trung bình mẫu kiểm tra mà khơng có giá trị cho hạt Kết kiểm nghiệm tốt phản ánh ñược sức sống hạt giống sở hạt riêng rẽ Ngày có thiết bị ñể xác ñịnh sức sống cho hạt xác định sức sống hạt giống nhanh hạt giống đậu tương, bơng, đậu biển, ngô 6.1.4.4 Xử lý nảy mầm mát Không giống xử lý lạnh xử lý mát thực phịng thí nghiệm tiêu chuẩn với mức nhiệt độ thấp 18oC khơng phụ thuộc vào hoạt động vi sinh vật đến Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống cơng nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 98 nảy mầm hạt Nó thể trồng nhiệt ñới (cây trồng nơi điều kiện ấm) bơng sức sống, nảy mầm sinh trưởng Tiến phương pháp cho kết gần phương pháp kiểm nghiệm nảy mầm tiêu chuẩn, giải thích cho nguyên lý sức sống hạt giống tốt tạo bình thường 6.1.4.5 Tỷ lệ sinh trưởng Sức sống hạt giống khả ñể tổng hợp có hiệu vật chất chuyển sản phẩm đến phơi nảy mầm, kết tăng khối lượng khô mầm Tỷ lệ sinh trưởng xây dựng sở nguyên lý Sức sống hạt giống ñược biểu mg khối lượng khô (mg/cây con) Phương pháp ñược thực chung cho kiểm nghiệm nảy mầm hạt giống Sau ñánh giá phần sinh trưởng phôi phát triển thành bình thường tạo nên từ quan dự trữ ( mầm phơi), sấy khơ cốc thí nghiệm nhiệt độ 80oC 24 ñể xác ñịnh tốc ñộ tăng khối lượng chất khơ Vũ Văn Liết, Lê Thị Thanh, 2006, nghiên cứu ảnh hưởng mật độ phân bón ñến chất lượng hạt giống lúa khang dân nguyên chủng cho kết khối lượng mầm tương quan chặt (ở mức 0,739 0,897) với khối lượng 1000 hạt tỷ lệ nảy mầm Bảng 6.1 Tương quan giưa khối lượng mầm với khối lượng hạt tỷ lệ nảy mầm Cơng thức thí nghiệm KLH M1 P1 P2 P3 P4 19,16 TLNM 98,67 KLM 1,69 M2 19,15 98,00 1,69 M3 19,10 97,67 1,63 M4 19,00 93,00 1,50 M1 19,02 91,67 1,53 M2 19,08 92,33 1,52 M3 18,88 93,00 1,49 M4 18,48 92,33 1,47 M1 19,15 97,00 1,68 M2 19,15 96,67 1,68 M3 19,08 94,00 1,62 M4 18,88 91,67 1,50 M1 18,67 92,00 1,53 M2 18,63 91,33 1,52 M3 18,35 90,67 1,47 87,00 1,47 M4 18,10 Tương quan với KLM 0,739 0,897 Ghi : M1, M2,M3, M4 mật độ tương ứng: 50,60,70 90 khóm/m2 P1: 10 phân chuồng, 90kg N + 70kg P2O5 + 60kg K2O), P2 P1 khơng bón đạm, P3 P1 Trường ðại học Nông nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống cơng nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 99 khơng bón lân, P4 P1 khơng bón kali, KLH: khối lượng hạt, TLNM : Tỷ lệ nảy mầm, KLM: khối lượng mầm Tỷ lệ tương quan với phát triển sinh dưỡng ñồng ruộng ( Burris, 1976 Kimel ,1979) Phương pháp ñảm bảo ñộ tin cậy ñánh giá sức sống hạt giống Tuy nhiên phương pháp vấn ñề cần xem xét là: + ðộ ẩm ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng + Sinh trưởng cịn chi phối yếu tố di truyền giống loài 6.1.4.6 Phân loại sức khoẻ Phương pháp xác ñịnh sức sống hạt giống phát triển từ kiểm nghiệm nảy mầm hạt giống, phân loại sức khoẻ thành ba mức yếu, bình thường khoẻ Phương pháp địi hỏi phương tiện sử dụng thuật ngữ quen thuộc nhà phân tích hạt giống thường sử dụng Phương pháp có khó khăn phân chia bình thường cần có tiêu tỷ mỷ, phân chia dựa ñặc ñiểm biến động Phương pháp cần có trợ giúp quan kiểm nghiệm chuyên gia giỏi để đảm bảo độ xác 6.1.4.7 Kiểm tra Tetrazolium (TZ) Kiểm tra TZ kỹ thuật tiến để phân tích chất lượng hạt Nó dựa vào hoạt ñộng phân tử TZ phản ứng với ngun tử hydro giải phóng từ hoạt động enzim thuỷ phân mơ sống Kết hình thành dung dịch nước có màu đỏ forman dựa màu ñỏ ñể ñánh giá giá trị gieo trồng hạt giống ñược sử dụng ñánh giá sức sống hạt giống Sau đặt hạt nhuộm màu bảng so màu ñể xác ñịnh sứng sống mức độ : Khơng có khả nảy mầm, thấp, trung bình sức sống cao Tuy nhiên phương pháp gặp khó khăn khả xác định chắn hạt có sức sống tốt hai hạt ngủ nghỉ có độc đố xử lý dẫn đến sai sót Hình 6.1 Hạt ngơ kiểm nghiệm TZ ñánh giá sức sống hạt giống ( nguồn Seed Laboratory at Oregon State University,2002) 6.1.4.8 Tốc ñộ nảy mầm Tốc ñộ nảy mầm nguyên lý ñời lâu ñể xác ñịnh sức sống hạt giống Lô hạt nảy mầm giống thường khác tỷ lệ nảy mầm sinh trưởng Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 100 Nhiều phương pháp xác ñịnh tỷ lệ nảy mầm ñã ñược thực Số ngày yêu cầu ñể nảy mần ñạt 90% ñã ñược ñề xuất Belcher, Miller,1974 số nảy mầm hạt ðể ñánh giá lô hạt chất lượng thấp giá trị phần trăm (50%) sử dụng cách tính tốn khác tính cơng thức Maguire : X= Số bình thường + .+ Số bình thường Lần đếm Lần đếm cuối Tỷ lệ nảy mầm tương tự ñược Czabator,1962 ,Djavanshir Pourbeik,1976 đề xuất để tính tỷ lệ nảy mầm với thân gỗ sau Giá trị nảy mầm = giá trị cao Số bình thường Lần đếm ngày X Tổng BT Ngày đếm cuối Hình 6.2 Sinh trưởng mầm ngơ đánh giá sinh trưởng ( nguồn Seed Laboratory at Oregon State University,2002) Các bình thường xác định xếp loại từ rễ mầm, trục mầm ñến phát triển ñầy ñủ vỏ hạt hoàn rụng khỏi mầm Wang 1973 phân chia thành loại theo giai ñoạn phát triển con, kết phần trăm tốc ñộ nảy mầm tương quan có ý nghĩa với khả nảy mầm chúng vườn ươm Kiểm nghiệm nảy mầm tiêu chuẩn thực ñếm hạt nảy mầm ñầu cuối cùng, phần trăm nảy mầm lần ñếm ñầu ñại diện cho hạt nảy mầm nhanh sử dụng số ñánh giá sức khoẻ hạt giống Khi nghiên cứu hạt ñậu tương lần ñếm ñầu tiên (4 ngày) ñã cung cấp số tốt cho đánh gía sức sống sử dụng số ñánh giá sức sống hạt giống Nghiên cứu ăn hàm lượng chất khô suất xuất phát từ hạt có tốc độ nảy mầm nhanh hẳn từ hạt nảy mầm chậm Phương pháp bị ảnh hưởng nhiệt ñộ ñộ ẩm buồng xử lý dụng cụ xử lý nảy mầm 6.1.4.9 Kiểm tra phương pháp Hiltner ( gieo hạt lớp gạch sỏi vụn) Phương pháp gieo hạt lớp gạch sỏi vụn (Brick Grit Test) ñược biết phương pháp kiểm nghiệm sức sống hạt giống Hiltner Ihssen ñề xuất năm Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 101 1911 ñể xác ñịnh khả nảy mầm hạt ngũ cốc nhiễm nấm bệnh( Fusarium) Kết nghiên cứu sử dụng phương pháp ñể xác ñịnh mức ñộ mạnh khỏe hay yếu hạt Phương pháp Hiltner sau: Hạt ñược gieo gạch vụn ẩm hộp cát trải lên lớp gạch vụn ẩm dày cm ðặt hộp phịng tối điều chỉnh nhiệt độ thời gian định tùy theo lồi Những hạt bị bệnh, tổn thương giới hư hỏng nảy mầm xuyên qua lớp gạch vụn Phần trăm bình thường xem mức sức sống hạt giống Phương pháp ñược sử dụng phổ biến Mỹ khơng cung cấp thơng tin tốt kiểm nghiệm nảy mầm chi phí cao, khoảng khơng gian kiểm tra cần rộng 6.1.4.10 Xử lý hạt dung dịch hạn chế thẩm thấu ( Osmotic Stress) Khi hạt gieo ñồng ruộng thường bị phụ thuộc vào ñộ ẩm ñồng ruộng ñiều kiện bất thuận hạn ñất dẫn ñến nảy mầm Như điều kiện hạn tạo phịng thí nghiệm ñất hay dung dịch ñất hệ thống dung dịch khác ( Sharma,1973) ðiều kiện ñất tiêu chuẩn khó nhận phịng thí nghiệm, hệ thống dung dịch khác thay hạn ñất phù hợp ñể ñánh giá phịng thí nghiệm Các dung dịch có tiềm thẩm thấu ñặc thù sodium clorid (NaCl), glycerol, sucrose, polyethylene glycol (PEG), manitol phù hợp ñể thay hạn đất thực đánh giá phịng thí nghiệm Nhưng chất thẩm thấu có khối lượng phân tử thấp (sodium clorid, glycerol, sucrose, manitol ) ñi vào hạt nảy mầm nguyên nhân gây ñộc cho hạt sử dụng Các chất có khối lượng phân tử cao PEG (4000 hơn) hỗn hợp phù hợp thay ñiều kiện hạn ñất sử dụng ñể ñánh giá khơng có độc tố ảnh hưởng đến hạt (Manorha,1966 Moore,1968) Dung dịch PEG- 6000 nhiều nồng ñộ nhiệt ñộ khác ñược dùng ñể xác ñịnh sức sống hạt giống(Michel Kaufmann,1973) Tỷ lệ nẩy mầm ñiều kiện giảm ñi rõ rệt ảnh hưởng ñến mầm nhiều rễ mầm Hạt giống có sức sống tốt có khả chống chịu tốt với ñiều kiện nhân tạo sử dụng PEG, ñây phương pháp ñể xác ñịnh sức sống hạt giống + Ưu ñiểm phương pháp không cần phương tiện thiết bị ñặc biệt huấn luyện kỹ thuật cho cán kiểm nghiệm + Nhược ñiểm hạt nhỏ hạt lớn nhu cầu nước khác nhau, hạt nhỏ cần nước nên có khả nảy mầm tốt ngâm PEG 6.1.4.11 Phương pháp kiểm tra hô hấp Sự nảy mầm hạt sinh trưởng yêu cầu sử lượng trao ñổi chất nhận từ q trình hơ hấp Vì giảm tỷ lệ hô hấp hạt nảy mầm giảm sinh trưởng Tỷ lệ hô hấp ño 18 ñầu hạt nảy mầm sử dụng ñể phát gây hại tia gama ngơ, lúa miến, lúa mì, củ cải ñỏ lạnh gây hại ñậu lima, cacao Có tương quan thuận tỷ lệ hút oxy trình hấp phụ sinh trưởng con, nghiên cứu khác lại cho mối liên hệ không chắn Phương pháp đánh giá sức sống hạt giống thơng qua tỷ lệ hô hấp thực nhanh số lượng mẫu lớn yêu cầu thiết bị máy ño hô hấp ñào tạo cán kỹ thuật Những hạt bị dập vỡ giới kết qủa ño khơng xác Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống cơng nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 102 6.2 Bệnh hạt giống kiểm nghiệm bệnh hạt giống Nhiều quốc gia giới kiểm nghiệm bệnh quy ñịnh bắt buộc kiểm nghiệm chất lượng hạt giống, kiểm nghiệm bệnh hạt giống có yêu cầu trang thiết bị, dụng cụ ñiều kiện ñịnh Thứ có nhiễm bệnh lấy bệnh lây nhiễm hạt , xây dựng tiêu chuẩn nhiễm bệnh làm sở sở đánh giá Ví dụ 5% số hạt ảnh hưởng ñến giá trị kinh tế hạt giống suất trồng mức có ý nghĩa Hơn quy định sản xuất hạt giống khu vực không nhiễm sâu bệnh sâu bệnh di chuyển từ vùng khác ñến, kiểm nghiệm bệnh hạt giống cần thiết Phương pháp kiểm nghiệm bệnh hạt giống ñã ñược cải tiến nước phát triển kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn số trồng quan trọng kết suất sản lượng trồng cải thiện có ý nghĩa sử dụng hạt giống bệnh 6.2.1 Vi sinh vật hạt Theo Sinclair, 1979 hạt giống giới vi mơ vi sinh vật , đặc biệt nấm bệnh, vi khuẩn, virus đơi giun trịn Những vi sinh vật hạt nhiều nguyên nhân gây bệnh trồng Một số vi sinh vật sống bề mặt hạt không làm sức sống hạt, chúng gây hại điều kiện mơi trường thuận lợi Những vi sinh vật nguyên nhân làm yếu rễ ảnh hưởng ñến kết kiểm nghiệm nảy mầm hạt giống Một số vi sinh vật khác sống phận hạt bắc, vỏ vỏ hạt xâm nhập vào con, mầm ñiều kiện thuận lợi Một số sống tồn bên hạt mô phôi nội nhũ, không gây hại cho hạt kìm hãm nảy mầm hay suy yếu con, số lây nhiễm vào trồng gây hại ảnh hưởng ñến suất 6.2.2 Xử lý ngăn ngừa bệnh hạt giống 6.2.2.1 Xử lý trước thu hoạch Xử lý bệnh hạt giống trước thu hoạch biện pháp ngăn ngừa bệnh hạt giống hữu hiệu thực ba phương pháp sau: 1) Chọn khu vực sản xuất bệnh 2) Áp dụng kỹ thuật canh tác tiến 3) Kiểm tra kỹ lưỡng loại bỏ sớm bị sâu bệnh Một phương pháp sản xuất hạt giống môi trường hạn chế bệnh sản xuất hạt giống ñậu nổ ñậu thức ăn gia súc Califolia Mỹ thực khu vực khơ, có tưới hạt giống khơng bị bênh bạc (Pseudomonas vulgaris) Ngoài chọn nơi sản xuất cần áp dụng kỹ thuật sản xuất tiên giải pháp ngăn ngừa bệnh hạt giống như: + Trồng giống bệnh + Xử lý hạt giống (bằng thuốc hoá học) trước gieo trồng + Rắc hạt ñồng với thuốc trừ nấm, vi khuẩn thuốc hố học khác Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống cơng nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 103 + Ngắt hay nhổ bỏ bị bệnh + Khơng tưới phun để tạo mơi trường ẩm độ khơng khí thuận lợi cho nấm bệnh phát triển + Kiểm tra kỹ lưỡng ñồng ruộng ñể ngăn ngừa, xử lý loại bỏ bệnh trước thu hoạch 6.2.2.2 Xử lý trình thu hoạch Xử lý bệnh hạt giống trình thu hoạch sau thu hoạch giải pháp cuối diệt trừ tận gốc bệnh hại hạt gồm phương pháp: + Tẩy uế bề mặt hạt hoá chất + Phân loại hạt bệnh hạt + Xử lý nước nóng + Xử lý chất kháng sinh hữu Xử lý chất kháng sinh kháng sinh hữu không xử lý bề mặt hạt số chất thấm vào hạt nên diệt bệnh nằm mô hạt Xử lý nước nóng cần xem xét nhiệt độ nước diệt mầm bệnh không gây hại hạt giống 6.2.3 Nấm bệnh liên kết với hạt Nấm nguyên nhân lớn gây hại trồng, hạt phổ biến bệnh vi khuẩn virus Hơn 8000 lồi nấm hại trồng có hạt giống ñược nhận biết Nấm hại hạt giống gồm hai loại ký sinh hoại sinh Nấm hoại sinh không lựa chọn ký chủ nên tìm thấy hạt nhiều lồi trồng nấm ký sinh có lựa chọn ký chủ nên tìm thấy phạm vi số lồi định Cả hai loại tìm thấy bề mặt hạt, bắc vỏ hạt, nấm ký sinh tự phát sinh hạt nấm hoại sinh nguyên nhân lây nhiễm từ bên vỏ hạt, dụng cụ nảy mầm khơng khử trùng trước kiểm nghiệm nguyên nhân lây nhiễm nấm Nấm ký sinh gây thiệt hại sản lượng trồng lớn vấn đề quan trọng sản xuất nơng nghiệp vì: + Nấm ký sinh gây hại dẫn đến hạt khơng nảy mầm + Nấm ký sinh hạt sau phát tán bệnh ñồng ruộng + Nấm ký sinh hạt trước thu hoạch làm giảm suất chất lượng hạt Nấm gồm tổ hợp sợi sinh dưỡng gọi sợi nấm, chúng sinh sản bào tử hạt thực vật bậc cao Cũng hạt trồng, bào tử nấm ña dạng kích thước,màu sắc, chúng có kích thước nhỏ phải quan sát kính hiển vi Một số nấm khơng có bào tử giới tính mà sinh sản cấu trúc sinh dưỡng 6.2.4 Phương pháp xác ñịnh bệnh nấm hạt giống 6.2.4.1 Kiểm tra nấm Agar ðây phương pháp lâu ñời phổ biến ñể kiểm tra bệnh nấm hạt Agar cacbohydrat trung tính chế từ rong biển, chứa lượng nhỏ dinh dưỡng cho sinh trưởng nấm, kiểm tra cần bổ xung thêm chất chiết từ củ khoai tây, rau Agar trung tính ñược pha chế sau: agar dạng bột cộng lượng nước phù hợp bổ sung dinh dưỡng làm môi trường Hỗn hợp ñược khử trùng nồi hấp 15 Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 104 - 20 phút làm lạnh ñến 50oC cho thêm chất kháng sinh Hỗn hợp rót cẩn thận vào ñĩa petri , tránh làm nhiễm bẩn, ñể nguội sau 20 phút sử dụng ñược Hạt kiểm tra làm bề mặt trước NaOCl 1% (dung dịch Sodium Hypochlorite) Chuẩn bị dung dịch chất tẩy sau: pha 20 phần nước tẩy (NaOCl = 5,25%) với 85 phần nước, loại ký sinh ăn ngầm pha đặc Cơng việc ñể loại trừ nấm hoại sinh vỏ hạt phát triển nhanh agar ngăn cản che lấp nấm bệnh hạt phát triển chậm Thơng thường 10 hạt vệ sinh sau kiểm tra, hạt ñược kẹp ñặt lên mặt agar, ñỉnh kẹp ñược vệ sinh cách nhúng cồn 70% hơ qua lửa ñèn cồn ðôi vi khuẩn phát triển agar giấy thấm chiếm môi trường nấm, ngăn cản nấm khơng phát triển dẫn đến nhận biết khó khăn Khắc phục cách cộng thêm chất kháng sinh steptomycine sulfate vào nồi hấp agar trung tính để nguội 50 - 55oC sử lý nước trường hợp kiểm tra giấy thấm Sau cấy ñĩa petri ñược ủ 20 - 25oC khoảng ngày với hạt nhiễm bệnh nhận biết sở đặc ñiểm quan sinh dưỡng bào tử Ngày sử dụng đĩa petri nhựa thay thuỷ tinh cho phép tiết kiệm lao động khơng phải làm sau hay trước nuôi cấy 6.2.4.2 Phương pháp giấy thấm Phương pháp kiểm tra bệnh hạt giấy thấm tương tự kỹ thuật kiểm tra nảy mầm, ñặt hạt giấy thẩm ẩm ủ ñiều kiện thuận lợi cho nấm phát triển Phương pháp bao gồm ñã thấm nước ñã khử trùng cho nước bão hoà vào giấy thấm, nước q đậm gạn bớt trước đặt hạt với kẹp, tránh hạt dính liền Hạt giấy thấm nảy mầm sinh trưởng giấy thấm khó khăn kiểm tra bệnh hạt giống Tình trạng khắc phục kỹ thuật lạnh, cho hạt hập thụ 24 (48 ñến 72 ñối với ngô) 24 nhiệt - 15oC sau ủ bình thường cho nấm bệnh phát triển.( nhiệt ñộ 20 - 25oC với 12 tối sáng chu kỳ - ngày) Nhiều loại nấm kích thích phát triển ánh sáng xanh tối xen kẽ ñược xác dịnh phương pháp agar 6.2.4.3 Phương pháp tính độc Kiểm tra tính độc tách nấm bệnh nghi ngờ từ kiểm tra agar giấy thấm Ni cấy agar để nhận biết bào tử quan dinh dưỡng nấm lây nhiễm lên trồng (thường con) ñể quan sát triệu chứng bệnh, tiếp sau lại lấy nuôi cấy bệnh lại mơi trường phù hợp để xác định xác Phương pháp Koch nêu thành lý thuyết phương pháp nhận biết loại bệnh hạt Lây nhiễm mầm bệnh lên chích phương pháp khác (Phun, rắc trà học) 6.2.4.4 Phương pháp không nuôi cấy Một số loại bệnh hạt quan sát qua mẫu hạt kỹ thuật không nuôi cấy đặc biệt, ví dụ nấm cựa gà quan sát thấy thấy có mặt vẩy sừng tối lớn tạo nên thể, nấm mốc loại hạt hầu hết quan sát ñược mắt thường Kiểm tra quan sát thể có hiệu với nấm than lúa mỳ, nấm hoa cúc lúa nước, nấm thường vỡ tuốt làm hạt Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 105 giống, phát tán đến hạt khác lơ hạt ảnh hưởng nghiêm trọng ñến chất lương hạt giống Phương pháp xác định tỷ lệ nấm bệnh lơ hạt quan sát sau: Làm mềm hạt ngâm dung dịch NaOH qua ñêm Tách phôi qua tia nước ấm gạn lọc lại qua rây kiểu giây bột Rửa nhanh với dung dịch lactophenol nước, phôi cịn vỏ trấu nội nhũ chìm xuống đáy gạn ðặt phơi tách ñĩa thuỷ tinh ñáy dày ñã ñược khử trùng trước ñun lactophenol 10 ñến 20 phút Xếp phôi theo trật tự kiểm tra sợi nấm kính kiển vi phóng đại Phương pháp kiểm tra ñược loại nấm bệnh ăn sâu vào phôi hạt, nhiên kiểm nghiệm bệnh hạt cần có cán chun mơn đào tạo để thực phân loại chủng loại bệnh, chủng nấm gì? 6.2.5 Bệnh nấm hoại sinh hạt giống Nấm hoại sinh sinh trưởng mơ chết, tồn tồn hạt, chúng khơng nguyên nhân gây bệnh trồng nấm ký sinh, bào tử nấm hoại sinh tồn khắp nơi hạt khơng khí Chúng có số lượng lớn hạt bảo quản nẩy mầm, sinh trưởng với số lượng vơ lớn với điều kiện bảo quản khơng vượt q độ ẩm 75% 15oC 6.2.6 Bệnh vi khuẩn 6.2.6.1 Bệnh vi khuẩn hạt giống Bệnh vi khuẩn hạt ñược kiểm nghiệm nhiều phịng thí nghiệm giới bắc Mỹ có 20 phịng thí nghiệm kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn, hầu hết kiểm nghiệm bệnh bạc ñậu, rau, cà chua bắp cải Bốn phương pháp kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn là: 1) Quan sát nhiễm vi khuẩn đặc điểm ngồi vỏ hạt 2) Chuẩn đốn triệu chứng lây nhiễm từ dịch chiết vi khuẩn từ lô hạt giống 3) Tách chiết vi khuẩn ñể nhận biết trực tiếp 4) Phối hợp phương pháp 6.2.6.2 Phương pháp kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn hạt giống a) Kỹ thuật huyết Kỹ thuật huyết sở chuỗi phản ứng kháng nguyên kháng thể Kỹ thuật nhận biết dương tính vi khuẩn virus, huyết miễn dịch chứa kháng thể ñặc thù chuẩn bị sau : Kháng nguyên ñược nhiễm vào (vi khuẩn hay virus) máu ñộng vật, thường thỏ, máu chống lại kháng nguyên tạo kháng thể Huyết miễn dịch dùng để kiểm tra có mặt vi khuẩn hạt giống Phương pháp thực hiện: hạt giống ñược nghiền với nước tạo thành dung dịch trộn mơi trường agar, huyết đối kháng cho loại vi khuẩn đặc thù đưa vào mơi trường xảy kết tủa chứng tỏ có mặt kháng nguyên ( vi khuẩn gây hại) Nếu không xảy kết tủa tác nhân bệnh khơng có mặt Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 106 b) Gây nhiễm trồng Gây nhiễm trồng phương pháp hữu ích để nhận biết vi khuẩn virus ñặc thù gây hại hạt giống Phương pháp kiểm tra ñơn giản dễ thực Hạt kiểm tra ñược ngâm nước ñã khử trùng vài sau chắt lọc lấy nước lây nhiễm vào con, khoẻ mạnh ðôi nghiền hạt thành dung dịch ñồng ñể lây nhiễm vào Lây nhiễm vào libe để dịch nhiễm chuyển tồn Sau lây nhiễm theo dõi chặt chẽ triệu chứng bệnh để đánh giá thơng qua triệu chứng biểu ñể xác ñịnh tác nhân gây bệnh Một phương pháp thường ñược sử dụng, ñặc biệt ñánh giá bệnh virus hại hạt giống chà sát hỗn hợp dịch hạt (dịch mẫu hạt) chất ñộn kim loại lên bề mặt lá, chất ñộn châm vào mô ñưa nguồn bệnh vào triệu chứng bệnh biểu Yêu cầu phương pháp sử dụng khoẻ, bệnh, trồng điều kiện vơ trùng( nhà kính nhà lưới) Triệu chứng bệnh biểu sau - tuần lây nhiễm 6.2.7 Bệnh virus hạt giống Corroll, 1979 ñã ghi nhận có khoảng 200 loại virus gây bệnh trồng 100 loại biết, cịn 500 loại virus khác khơng gây bệnh hạt giống Trong số có 80 loại virus chuyển qua hạt, số bề mặt hạt cịn lại tồn bên bên ngồi phơi 6.2.7.1 Kiểm nghiệm sinh học Kiểm nghiệm sinh học gồm quan sát trực tiếp hạt trồng quan sát triệu chứng trồng + Kiểm nghiệm qua triệu chứng quan sát triệu chứng phát triển bệnh con, kiểm nghiệm đơn giản, tốn phù hợp ñể kiểm nghiệm hạt Kiểm nghiệm thông qua biểu triệu chứng thực cách nghiền hạt hay từ lô hạt kiểm tra, bột nghiền lây nhiễm học vào khoẻ, quan sát triệu chứng bệnh phát triển nhận biết nguyên nhân gây bệnh + Kiểm nghiệm trực tiếp hạt thực hạt bình thường hạt khơng bình thường, chiết dịch hạt lây nhiễm lên thị hay trồng theo dõi phát triển ñặc ñiểm triệu chứng bệnh Có thể kiểm tra hạt hay hỗn hợp số hạt 6.2.7.2 Kiểm nghiệm bệnh virus hạt huyết Nguyên lý kiểm nghiệm bệnh virus hạt giống huyết tương tự kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn Phương pháp sở phản ứng virus hạt dịch hạt với mẫu huyết miễn dịch máu ñộng vật (thỏ) Có kỹ thuật thử huyết ñược Carroll ñề xuất năm 1979 a) Kỹ thuật khuyếch tán kép: Kỹ thuật khuếch tán kép ñược sử dụng phổ biến phương pháp huyết miễn dịch Nó xét nghiệm hạt đơn phần hạt Thơng thường hạt kiểm nghiệm ñược ngâm nước rỉ nhẹ Khi tồn hạt phần hạt nghiền chuyển vào khoang cắt môi trường khuyếch tán (thường gel agar) sau đưa vào huyết miễn dịch chuyên biệt virus nghi ngờ cần kiểm tra vào Trường ðại học Nông nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống cơng nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 107 khoang riêng Trong thời gian phân tử virus kháng nguyên kháng thể khuếch tán hai phía khác Sự khuếch tán hai hướng khác gọi khéch tán kép Khi hai phản ứng huyết tiếp cận ñến ñiểm gel nơi tập trung tương ñối loại ñương lượng huyết học Phức hợp phân tử kháng nguyên kháng thể kết tủa cố ñịnh Sự kết tủa xuất dải trắng số điểm hai khoang ðể phát virus có cấu trúc kéo dài kỹ thuật khuếch tán, chuẩn bị hạt phải xử lý số tác nhân phá vỡ làm suy giảm virus kháng nguyên ñể tăng khuếch tán virus hạt (kháng nguyên) agar.Tác nhân suy giảm virus thường ñược sử dụng sodium dodecyn sulfat ( Na2SO4) Phương pháp ñặc thù độ nhạy chuẩn đốn nồng ñộ virus 10 - 25 µg/ml b) Kỹ thuật khuyếch tán toả tròn ( Radial difussion Test) Phương pháp khuyếch tán toả trịn khuyếch tán đơn giống kỹ thuật khuyếch tán kép khuyếch tán virus kháng nguyên khoang môi trường agar Huyết chứa kháng thể với virus ñặc thù ñược ñưa vào môi trường agar khoang với hạt con, virus có mặt chúng khuyếch tán khoang Khi chúng kéo dài ñến bề mặt khoang chúng phối hợp với kháng thể ñể kết tủa vùng gặp hình thành chuỗi quầng xung quanh khoang Thông thường huyết miễn dịch từ thỏ cho phép kiểm nghiệm với virus ñã ñược làm suy yếu ñược sử dụng thực phương pháp Phương pháp nhạy, nhanh phát virus với lượng nhỏ µg/ml virus suy yếu vài phút hay vài c) Phương pháp Kiểm tra nhựa mủ ( Latex flocculation test) Sự kết nhựa mủ phương pháp huyết sinh học khác ñược thực sau: xay 100 hạt sau ñó 0,1g hạt xay cho vào ml dung dịch ñệm ñể cho vào cối giã nghiền Khoảng 20 ml dịch chiết hạt cho vào pipet 100ml 10 ml với nhựa mủ đánh dấu có Nhựa mủ đánh dấu bao gồm huyền phù polystyrence nhựa mủ hình cầu (đường kính khoảng 0,81 µm) Nhựa mủ hình cầu nhạy cảm bao trùm tế bào kháng thể cho virus ñặc thù lắc pipet khoảng 15 phút quan sát kính hiển vi phân lớp Khi virus có mặt mẫu kiểm tra Nhựa mủ huyền phù kết d) Phương pháp Enzyme-linked immunosorbent Assay ( ELISA) Kỹ thuật ELISA có ñộ nhạy cao, số nghiên cứu cho phát virus nồng độ 0,1 µg/ml Phương pháp sử dụng phát virus đốm vịng hạt thuốc lá, khảm hạt ñậu tương với tỷ lệ thấp ( - 4%) Phương pháp cần có kỹ thật, trang thiết bị tốn thường ñược sử dụng kiểm nghiệm hạt giống trồng quý giá trị cao Trường ðại học Nông nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống cơng nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 108 ... triển hạt dẫn ñến sức khoẻ hạt giống thấp, độ phì đất thấp dẫn đến hạt nhỏ, hạt ñược tạo từ ñiều kiện dinh Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn... Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn 96 sống hạt giống phân loại sở tổ hợp tiêu xác ñịnh sức sống hạt giống Woodstock, 1973... xác ñịnh sức sống hạt giống Lô hạt nảy mầm giống thường khác tỷ lệ nảy mầm sinh trưởng Trường ðại học Nơng nghiệp - Giáo trình Sản xuất giống công nghệ hạt giống - http://www.ebook.edu.vn