Bài giảng môn học Nguyên lý và phương pháp chọn giống cây trồng - Chương 5: Phương pháp tạo biến dị di truyền trong chọn giống cây trồng cung cấp cho người học các kiến thức: Phương pháp lai hữu tính, đột biến tạo biến dị di truyền, đa bội thể, đơn bội thể và đơn bội kép,... Mời các bạn cùng tham khảo.
Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 7/18/15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 5.1 PHƢƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH 5.1.1 Khái niệm Chƣơng PHƢƠNG PHÁP TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG “Lai giống giao phối (thụ phấn, thụ tinh) hai hay nhiều dạng bố mẹ có di truyền khác để tạo biến dị tái tổ hợp theo mục tiêu chọn giống ” Sự giao phối xảy tự nhiên (lai tự nhiên) ngƣời tiến hành (lai nhân tạo) tạo biến dị tái tổ hợp Lai hai bố mẹ có cặp gen alen khác nhau, khơng liên kết, số chúng trội, phân chia nhiễm sắc thể giao phối ngẫu nhiên giao tử đực giao tử cái, hệ F1 có kiểu gen tái tổ hợp gen hai bố mẹ Tổng quát để tính số kiểu gen lai hai bố mẹ khác n gen, có 2n giao tử số kiểu gen 3n Quần thể nhỏ F2 cần thiết để biểu biến dị 4n cá thể Phƣơng pháp lai hữu tính tạo giống thƣờng đƣợc ứng dụng trồng có cấu tạo hoa hồn chỉnh Trong phép lai, ngƣời ta có ký hiệu bố (male parent - cho phấn) mẹ (female parent - nhận phấn) Đối với thực vật có cấu tạo hoa hồn chỉnh gồm đủ nhị nhuỵ cần tiến hành khử đực (emasculation) mẹ trƣớc tiến hành lai Các lồi trồng có sinh sản đặc thù nhƣ: bất dục đực (male sterility), đơn tính (Gynoecious), tự bất hợp (self incompatibility) yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất hay yếu tố mơi trƣờng lợi dụng tƣợng để giảm bớt công khử đực, hạt thu đƣợc mẹ hạt lai 5.1.2 Các phƣơng pháp lai hữu tính a) Lai đơn (single cross) Lai hữu tính tạo giống đƣợc phân chia thành lai gần lai xa: Lai gần lai hai bố mẹ lồi Ví dụ, lai giống lồi lúa trồng Oryza sativa L (châu Á), O glaberrima (châu Phi)… Lai xa giao phối hai bố mẹ khác lồi hay khác lồi phụ Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ lúa Indica x Japonica; lai loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay lai chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen (Secale) tạo Triticale d) Lai đỉnh (topcross) Dòng AxB Ký hiệu: A/B (theo IRRI USDA) A - B ( theo CIMMYT) Dòng Tester b) Lai ba (three-way cross) (A x B) x C Ký hiệu A/B//C (theo IRRI USDA) A - B x C (theo CIMMYT) c) Lai kép (double cross) Dòng * * * (A x B) (C x D) Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA); A/B//C///D (theo IRRI) A – B x C- D ( theo CIMMYT) Dòng n Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 7/18/15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ e) Lai dialen (dialen cross) g) Lai trở lại (backcross) A B C D A AxA AxB AxC AxD B BxA BxB BxC BxD C CxA CxB CxC CxD D DxA DxB DxC DxD Griffing (1956) đƣa phƣơng pháp lai nhƣ sau: Phƣơng pháp 1: Lai thuận, lai nghịch tự phối (bố mẹ) số tổ hợp lai = p2 Phƣơng pháp 2: Lai chiều tự phối (bố mẹ) số tổ hợp lai = p(p + 1)/2 Phƣơng pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự phối số tổ hợp lai = p(p - 1) Phƣơng pháp 4: Lai chiều không tự phối số tổ hợp lai = p(p - 1)/2 f) Lai thuận nghịch (reciprocal cross) A♀ x B♂ Lai thuận B♀ x A♂ Lai nghịch h) Lai trở lại nhờ marker (Marker-assisted backcrossing- MAB) MAB có nhiều mức: Mức thứ nhất: chọn lọc gen hay QTL điều khiển tính trạng có lợi, nhƣng tính trạng khó đánh giá dựa kiểu hình gen lặn điều khiển Giảm bớt gen không mong muốn liên kết kéo theo trình lai trở lại Mức thứ hai: sử dụng hai marker liên kết hai đầu locus mục tiêu để chọn lọc phối hợp, tối thiểu gen kéo theo yêu cầu quần thể lớn tùy thuộc vào khoảng cách hai marker với locus mục tiêu Yêu cầu quan trọng thể cho (donor) giống địa phƣơng Mức thứ ba: chọn lọc di truyền, sử dụng marker không liên kết để chọn donor tƣơng phản, lấy lại nhanh genome bố mẹ nhận gen Sử dụng kỹ thuật tiết kiệm 2, chí hệ lai trở lại i) Lai hồi quy (Conservatative cross) j) Lai nhiều bậc (convergent cross) Beloturca x Potapca Alpha x Xaroza Albidum-24 x Liutexen55/11 Xaratopca-29 Hình 5.7 Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P Sekhudin) 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization) l) Lai quy tụ gen dựa marker phân tử (Marker-Assisted Gene Pyramiding) Năng suất cao Thời gian sinh trưởng ngắn 10 11 12 Kháng rầy nâu bạc Năng suất cao TGST ngắn 1 2 10 11 12 Kháng rầy nâu bạc 10 11 12 10 11 12 Dòng/ giống quy tụ gen quy định tính trạng mong muốn lúa TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc – O longistaminata Lƣu ý: Để tiến hành đƣợc phƣơng pháp này, nghiên cứu cần tạo dòng đẳng gen (NIL – nearly isogenic line) Sau đó, dịng NIL đƣợc tiến hành lai với Chọn lọc sử dụng marker liên kết với gen mong muốn để chọn m) Lai tế bào soma (Somatic hybridization) 5.1.3 Kỹ thuật lai hữu tính a) Nguyên lý chọn cặp bố mẹ Các bƣớc lai tế bào soma: Nguyên lý 1: Chọn cặp bố mẹ dựa loại hình sinh thái xa cách di truyền Bƣớc 1: Phân lập tế bào soma từ mô con, tinh Bƣớc 2: Lai tế bào soma kiểm tra tế bào lai Bƣớc 3: Tái sinh Bƣớc 4: Đánh giá chọn lọc hệ sau lai tế bào soma Nguyên lý 2: Chọn cặp bố mẹ dựa khả kết hợp Nguyên lý 3: Chọn cặp bố mẹ dựa khả chống chịu bệnh Nguyên lý 4: Chọn cặp bố mẹ dựa suất yếu tố tạo thành suất Nguyên lý 5: Dựa thị phân tử chọn bố mẹ có tính trạng mục tiêu c) Chuẩn bị lai dụng cụ lai b) Gieo trồng, chăm sóc vƣờn bố mẹ chọn bố mẹ Các dịng, giống bố mẹ đƣợc trồng ruộng riêng, có sơ đồ bố trí để thuận tiện cho cơng tác chăm sóc nhƣ chọn để lai Các kỹ thuật nhƣ thời vụ, phân bón, tƣới nƣớc phịng trừ sâu bệnh cỏ dại tối ƣu loài trồng để lai sinh trƣởng phát triển tốt, quan sinh sản (hoa) phát triển hoàn chỉnh thuận tiện cho thao tác khử đực thụ phấn Trƣớc thực thao tác lai, lai cần đƣợc chọn kỹ chuẩn bị chu đáo: cắt bỏ không dùng cho lai, dọn chết, vàng úa, cắt bỏ hoa không khử đực hoa nở đầu, hoa cuối cành hoa Ví dụ, lúa đƣợc chọn làm vật liệu lai đƣợc đánh trồng chậu, cắt bỏ thừa để lại từ - bông, dọn chết Tiến hành cắt bỏ hoa nở hoa non để lại khoảng 15 - 20 hoa thành thục để khử đực Dụng cụ lai cần thiết gồm panh, kéo, thẻ đánh dấu, bao cách li giấy bóng kính, lọ mầu đen đựng hạt phấn, ghim, bút chì bút dầu viết bao cách li khơng bị phai… Bố trí thời điểm gieo bố mẹ để bố mẹ nở hoa trùng nhau, trƣờng hợp bố mẹ lệch sử dụng kỹ thuật điều chỉnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, hóa chất… 7/18/15 d) Khử đực bao cách li e) Thụ phấn đánh dấu Thu hoa bố tách bao phấn lấy phấn thụ hoa mẹ đƣợc khử đực Có phƣơng pháp sau: Thu hoa bố khỏa mạnh, không sâu bệnh thời gian thu hoa nở rộ thƣờng vào buổi sáng Khử đực tay: áp dụng với trồng có hoa đủ lớn, phận đực thời điểm khử đực phân biệt rõ ràng nhƣ lúa, cà chua, thuốc lá, đậu, vừng… Một số lồi phấn hoa dính để tách lấy phấn phải hong khô nhƣ cà chua, khoai tây Khử đực máy: máy hút chân không đƣợc sử dụng để khử đực lúa Những loài giao phấn, hoa đơn tính thu nhận hạt phấn vào lọ tối sau thụ phấn cho hoa Khử đực hố chất: lồi có hoa nhỏ (kê, rau dền, hành…) Các hoá chất thƣờng dùng để khử đực có hiệu cao hydrazid axit malic ester thơm, sodium methyl arsenate, Maleic hydrazide, NAA, IAA, FW450, Ethrel, RH531, MSMA, ZMA Dùng panh gắp bao phấn đƣa lên đầu nhụy hoa mẹ khử đực bóp nhẹ để bao phấn vỡ tung phấn lên đầu nhụy, dùng bút lông chấm vào cốc phấn chấm lên đầu nhụy, đƣa phấn lên ngón tay vật phẳng vít đầu nhụy chấm vào phấn bố… Quá trình thụ phấn cần lặp lại vài lần để đảm bảo thụ phấn thành công Khử đực nƣớc nóng: Nhiệt độ thời gian khử đực tuỳ thuộc vào loài trồng (lúa sử dụng nhiệt độ 430C phút; lúa miến sử dụng nhiệt độ 47 - 480C 10 phút) f) Chăm sóc thu hoạch hạt lai Sau lai, lai phải đƣợc theo dõi thƣờng xuyên để ngăn chặn kịp thời côn trùng động vật phá hoại hạt lai Cây yếu cần đƣợc bón thêm phân kali hydrophotphat (KH2PO4) Hình 5.13 Bao cách ly ghi thông tin sau thụ phấn lai tạo giống lúa để hạt lai đƣợc chắc, sức sống cao Hạt lai chín cần thu hoạch kịp thời, phơi khơ vào bảo quản tránh sứ nảy mầm Hạt lai bảo quản túi ghi đầy đủ thông tin, cất trữ nhiệt độ thấp khô để sử dụng giai đoạn trình chọn tạo giống 5.1.4 Lai xa a) Một số ứng dụng lai xa Tạo loài mới: kết lai xa lúa mì lúa mạch đen, lƣỡng bội hoá nhiễm sắc thể lai F1 tạo loài triticale Chọn tạo giống trồng Trƣờng hợp 2: Con lai không kết hạt (thu đƣợc hạt lai F1 nhƣng lai F1 bất thụ) Nguyên nhân: Do bố mẹ sai khác lớn di truyền sinh lý; Tạo biến dị mới, tính trạng, đặc điểm mà dạng bố mẹ chƣa có Hệ thống sinh sản lai bị phá vỡ Tạo giống kháng bệnh kháng sâu vào trồng Biện pháp khắc phục: Tạo giống trồng chống chịu với điều kiện bất thuận phi sinh học Kéo dài thời gian sinh trƣởng lai; Tạo giống lai có ƣu lai cao Kỹ thuật canh tác chăm sóc phù hợp; Tạo dịng đơn bội, tạo lai tế bào đa dạng loại bất dục tế bào chất… Xử lý đa bội thể 7/18/15 b) Những khó khăn lai xa biện pháp khắc phục Trƣờng hợp 1: Cây lai không kết hạt Nguyên nhân do: Môi trƣờng đầu nhụy hoa mẹ không phù hợp cho hạt phấn nảy mầm Ống phấn ngắn khơng thực đƣợc q trình thụ tinh khả xuyên ống phấn phát triển chậm dẫn đến thụ tinh trứng sức sống Sai khác q lớn di truyền khơng hình thành đƣợc hợp tử, phơi hình thành phơi nhƣng không phát triển tiêu biến 5.2 ĐỘT BIẾN TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN 5.2.1 Khái niệm ý nghĩa Đột biến thuật ngữ thay đổi vật chất di truyền tế bào (gene nhiễm sắc thể) Theo định nghĩa từ điển thuật ngữ khoa học trồng thay đổi di truyền vật chất di truyền tế bào, mức lớn phá vỡ xếp lại nhiễm sắc thể, đột biến di truyền lại cho hệ sau Hugo de Vries (1980) đƣa “Học thuyết đột biến” bao gồm nội dung có ý nghĩa sau: (i)Đột biến xảy đột ngột, không qua bƣớc trung gian nào; Biện pháp khắc phục: (ii)Các dạng đột biến xuất hồn tồn ổn định, bền vững; Thụ phấn bổ sung (iii)Đột biến tạo nên biến đổi rời rạc, không tập trung; Lai trung gian (iv)Đột biến xảy ngẫu nhiên, có lợi có hại; Cứu phôi (v)Sự xuất đột biến phụ thuộc vào số lƣợng cá thể; (vi)Một đột biến lặp lại nhiều lần Bảng 5.1 Đột biến tạo giống thành công số trồng Brazil Cây trồng Thuốc Đặc điểm tính trạng cải tiến Kháng virus; khắc phục khó khăn lai xa khác lồi Cam qt Kiểu gọn, chín tuần tự, khơng hạt Đậu co ve Hàm lƣợng protein cao hơn; màu hạt mới, tập tính sinh trƣởng, kháng virus khảm vàng đậu Chuối Giảm chiều cao cây, chịu mặn Hoa cúc Màu sắc hoa mới, thấp cây, nhiều canh hoa Lúa mỳ Kháng rỉ sắt thân; rỉ sắt lá; thân mềm; chín sớm; thấp cây; chống chịu chua phèn Lúa Thời gian chín ngắn; chín sớm; thấp cây; cải tiến chất lƣợng hạt Đậu tƣơng Lá hẹp, rộng, nhiều màu sắc, hạt to, chín sớm Cà chua Quả ơvan; màu xanh đậm, chín chậm, giảm kích thƣớc cây, tăng độ Brix giảm độ Brix Ý nghĩa đột biến: Tạo nguồn biến dị di truyền phong phú cho chọn giống Đặc biệt tính trạng mong muốn mà nguồn biến dị tự nhiên khơng có Có khả tạo giống mới, nhanh, ổn định, khơng phân ly, có nhiều đặc tính, tính trạng q nhƣ chín sớm, khơng cảm quang (tám thơm đột biến), suất cao, chống chịu sâu bệnh, tăng hàm lƣợng protein, lipid, glucid sản phẩm; dòng bất dục đực dùng tạo giống ƣu lai… Có thể tạo biến dị cho số loài trồng sinh sản đƣờng vơ tính hay nhóm sinh sản vơ tính nhƣ đột biến khảm đƣợc ứng dụng tạo giống hoa cảnh Làm mối liên kết cũ, xây dựng mối liên kết dẫn đến làm tăng khả tổ hợp gen 5.2.2 Phân loại đột biến Hạn chế đột biến: Tạo biến dị không định hƣớng; a) Đột biến mức phân tử ADN Đột biến làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN đƣợc gọi “đột biển điểm” hay “đột biến gen” nhiều mức khác nhau: Khơng xác định đƣợc vị trí, số lƣợng gene đột biến; Đột biến điểm (Point Mutation) đột biến làm thay đổi cặp phân tử ADN, thay nucleotide nucleotide khác Phần lớn đột biến biến dị có hại, tỉ lệ biến dị có lợi thấp (10-6) Đột biến đoạn (Deletion mutation) đột biến làm hay nhiều nucleotide gen hoạch nhiễm sắc thể Ngày nay, cơng nghệ gene khắc phục đƣợc khó khăn Đột biến chèn đoạn (Insertion mutation) đột biến lồng thêm nucleotide chuỗi ADN Ngồi cịn có đột biến tạo gen chức chức năng, đột biến gây xếp ADN trở dạng hoang dại chúng, đột biến phá vỡ gen định dẫn đến gây chết quan sông phát triển… 7/18/15 c Đột biến thể khảm (Chimaras): b) Đột biến mức độ nhiễm sắc thể: Bao gồm thay đổi cấu trúc NST số lƣợng NST Đột biến thiếu đoạn, đảo đoạn, đổi đoạn, lặp đoạn Theo R Daniel Lineberger: “Một đƣợc gọi đột biến thể khảm tế bào có kiểu gen đƣợc tìm thấy mơ sinh trƣởng liền kề cây” Các có đốm màu khác dạng chung để nhận biết đột biến thể khảm Dạng đột biến đƣợc gọi “đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể” Thể khảm có ý nghĩa quan trọng chọn tạo giống sinh sản vơ tính, hoa, cảnh Mức độ thay đổi số lƣợng nhiễm sắc thể nhƣ tăng hay giảm số lƣợng nhiễm sắc thể tạo thể đa bội, đơn bội hay lệch bội Phân loại đột biến thể khảm: Đột biến thể khảm đỉnh sinh trƣởng phát triển lớp khác phân thành loại khảm là: Dạng đột biến đƣợc gọi “đột biến số lƣợng nhiễm sắc thể” Khảm phần Khảm quạt Khảm vòng 5.2.3 Các tác nhân gây đột biến a) Tác nhân vật lý Tác nhân Đặc điểm Bƣớc sóng ngắn λ = 0,05 - 10Å, sức đâm xuyên mạnh từ vài mm đến vài cm Bƣớc sóng ngắn λ < 0,05Å, sức xuyên mạnh tia X nhƣng không mang điện nên có tác dụng điện ly gián Tia Gamma (γ) tiếp nhờ hiệu ứng quang điện Trong sinh học thƣờng sử dụng tia γ đồng vị phóng xạ Co60 Ce137 Neutron Tạo từ lò phản ứng nhiệt hạch, nguy hiểm, mức đâm (nhanh, chậm, xuyên mạnh nhiệt) Đƣợc hình thành từ hạt nhân nguyên tử helium (He), Tia alpha (α) gồm proton nơtron tia α có khả xuyên sâu 0,07mm mơ sinh vật Bƣớc sóng 200 – 400nm (nanomet) Photon tia UV có lƣợng thấp, khơng xuyên sâu nên không tác động đến tế bào nằm sâu thể sinh vật nhƣng có tác Tia tử ngoại UV dụng xử lý hạt phấn noãn Tần số gây đột biến tia cao bƣớc sóng trùng với bƣớc sóng DNA hấp phụ (từ 260 – 265nm) Tia X Hình 5.15 Hình thành phát triển khảm Các tác nhân gây đột biến gồm: b) Tác nhân hoá học Trình tự tác động tác nhân hố học: Trước hết, chúng vào phận tế bào, gây chấn thương mức phân tử; Sau đó, tác nhân hoá học tương tác với sản phẩm trung gian tế bào với sản phẩm tương tác tác động vào ADN Đây giai đoạn tiền đột biến Cuối cùng, liên kết hoá học làm sai lệch thông tin gây đột biến Các chất oxy hoá khử gốc tự do: H2O2, HNO2, aldehyd, muối kim loại nặng Các chất alkyl hoá: ethylmethan sunfonat (EMS), nitrozoethyl-urea (NEU), nitrozomethylurea (NMU), ethylenimin (EI), diethylsulphat (DES), dimethylsunphat (DMS),… Các chất đồng đẳng base nitơ: cafein, 5-bromuaraxin (5-BU), aminopurin, hợp chất chứa halogen… Các chất cảm teobromin… ứng với base: ethylurethan, 5-aminouracin, Các chất nhóm acridin (C13H9N): proflavin đƣợc dùng nhiều nghiên cứu đột biến gene Ngồi cịn số chất hóa học: H2S2O7, Na2CO3, Na3PO4, 7/18/15 5.2.4 Vật liệu phƣơng pháp xử lý đột biến a) Vật liệu xử lý phận có khả hoạt động sống Các phận xử lý: cây, hạt khô, hạt ƣớt, mầm, phận sinh dƣỡng, hạt phấn, tế bào, phôi, calus nuôi cấy mô c) Tác nhân sinh học: b) Phƣơng pháp xử lý Virus nhóm sinh học mang gen lạ, xâm nhập vào thể trồng để gây đột biến Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào tính chất tia, liều lƣợng, loại hoá chất, nồng độ Khi xử lý đột biến cần ý đến đặc tính sinh lý cây, thời gian phận trồng đƣợc xử lý Đây công cụ phƣơng pháp Liều lƣợng nồng độ hoá chất vào liều lƣợng gây chết (lethal dose) - giá trị LD50 chuyển gen LD50 đƣợc xác định nghiên cứu cụ thể với loại tác nhân vật liệu xử lý Liều lƣợng xử lý TNVL đƣợc đo đơn vị Rad, Kr hay Gray Đơn vị tiêu chuẩn thống Gray viết tắt Gy (Gray (Gy) = Joule = 100rad, rad = 100erg/g vật chất), Nồng độ xử lý tác nhân hóa học có đơn vị mM ppm Bảng 5.3 Liều lƣợng thời gian xử lý đột biến hạt lúa khô Tác nhân đột biến Liều lƣợng thời gian xử lý c) An toàn xử lý đột biến Phải tuân thủ quy tắc, quy định an toàn đảm bảo hiệu xử lý Neutrons nhanh - Gy X-rays X-rays 95 - 250 Gy Tia gamma gamma rays 100 – 350 Gy MNH (MNU) MNH (MNU) (0,7–1,5 mM) x (3 – h) Cán thực phải đƣợc đào tạo ENH (ENU) ENH (ENU) (1,7–2,5 mM) x (3 - h) Phải đầy đủ trang thiết bị bảo hiểm an toàn cho ngƣời thực EMS EMS (0,2 – 0,5%) x (8–20 h) NaN3 NaN3 (0,5 – mM) x (3-5 h) Việt Nam ban hành luật “Luật lƣợng nguyên tử” năm 2008 Một số nguyên tắc là: Phải có phịng thí nghiệm chun dụng đủ tiêu chuẩn an toàn, khu vực xử lý an tồn Sau sử lý phải có phƣơng pháp đảm bảo phân rã hết phóng xạ hay độc tố đƣợc sử dụng 5.2.5 Chọn lọc sau đột biến Vật liệu xử lý đột biến hệ M0 đƣợc gieo trồng thu hoạch gieo trồng M1 thu trồng quần thể M2 Bắt đầu từ quần thể M2 phân thành hai khu chọn lọc, khu vực tiếp tục chọn lọc hệ phân ly, khu vực khác đánh giá dòng để phát triển giống làm vật liệu khởi đầu cho phƣơng pháp tạo giống khác nhƣ lai, chuyển gen… Chọn lọc sau đột biến sinh sản sinh dƣỡng phân thành nhóm, (i)Nhóm cần tách đột biến riêng rẽ khỏi thể khảm sử dụng nhân ghép vơ tính tạo thành dịng vơ tính hệ sau Qua số hệ chọn lọc đánh giá độ đặc điểm nông sinh học khác để phát triển thành giống Hình 5.16 Cánh đồng xử lý đột biến Viện Đột biến tạo giống (IRB) quốc gia Nhật Bản (ii)Nhóm khơng cần tách đột biến khỏi thể khảm nhƣ hoa cảnh đánh giá đột biến ổn định nhân vơ tính phát triển thành giống 7/18/15 Chọn lọc sau đột biến với sinh sản hữu tính: tƣơng tự nhƣ chọn lọc phân ly sau lai điểm khác biệt chọn lọc quả, Bảng 5.4 Yêu cầu số cá thể gia đình M2 đảm bảo xuất đột biến bơng để hình thành dịng hệ sau mà khơng thiết từ hay khóm nhƣ chọn lọc sau lai Yêu cầu chọn lọc quần thể phân ly lớn, ƣớc lƣợng độ lớn quần thể M1 theo Brock (1971) N Số gia đình M2 Tỉ lệ đột biến log(1 p1 ) log(1 ) p1 = 0,90 p1 = 0,99 10-2 233 465 10-3 2.326 5.652 10-4 23.260 46.520 10-5 232.600 465.200 Trong đó: N số cá thể M1 sống sót để tạo gia đình M2; µ tỉ lệ đột biến; p1 xác suất xảy đột biến 5.3 ĐA BỘI THỂ 5.3.1 Khái niệm ý nghĩa đa bội chọn giống Khái niệm: “Đa bội thể sinh vật tế bào sinh dƣỡng có số lƣợng nhiễm sắc thể tăng theo bội số nguyên lần nhiễm sắc thể đơn bội (từ 3n trở lên)” Sinh trƣởng, phát triển mạnh nên khả thích ứng tốt nhƣ chuối Thân to nên suất xanh cao Bất dục đặc biệt dạng tam bội 3n Nhiều trƣờng hợp bất dục hoàn toàn - Một số dạng đa bội Bảng 5.5 Đa bội số loài trồng Loài trồng Đặc điểm dạng đa bội Đơn bội (n) Đa bội Hàm lƣợng chất cao nhƣ đƣờng, methol bạc hà… Những điểm hạn chế đa bội Họ cà 12 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108 Lúa nƣớc 12 24, 48 Đa bội thể cao (6n, 8n…) có tƣợng sinh trƣởng phát triển khơng bình thƣờng, thấp tế bào dầy không phát triển chiều dài Cải bẹ 8, 9, 10 16, 18, 20 Hiện tƣợng bất dục khó khăn lấy hạt Mía 40 80, 120 Trong trƣờng hợp nhân giống hữu tính, q trình sản xuất hạt giống khó khăn 5.3.2 Phân loại đa bội thể a) Đa bội nguồn (autopoly ploidy) Đa bội nguồn hay đƣợc gọi đồng nguyên đa bội, tự đa bội tƣợng đa bội thể đƣợc tạo nên từ nhiễm sắc thể giống loài - Tam bội - Autotriploidy (3x) - Tứ bội - Autotetraploidy (4x) - Ngũ bội - Autopentaploidy (5x) - Lục bội - Autohexaploidy (6x) b) Đa bội khác nguồn (Allopolyploidy) - Tứ bội khác nguồn - Allotetraploidy (2x1+2x2) - Lục bội khác nguồn - Allohexaploidy (2x1+2x2 + 2x3) - Bát bội khác nguồn - Allooctaploidy (2x1+2x2 + 2x3 + 2x4) Hình 5.17 Những đƣờng chủ yếu hình thành đa bội 7/18/15 c Đa bội lệch (aneuploid) Đa bội lệch thay đổi NST không bội số mà NST riêng biệt Công thức tổng quát: 2n ± x (x: số NST) Đa bội lệch đƣợc phát nhiều lồi trồng: lúa mì, ngơ, cà chua, bông, thuốc lá… Các dạng đa bội lệch dẫn tới biến dị dị hình, sức sống cân NST, không phân bào đƣợc nên bất dục, khơng có giá trị chọn giống mà sử dụng để xác định nhóm gen liên kết 5.3.3 Phƣơng pháp tạo đa bội thể Nguyên tắc xử lý đa bội: xử lý đa bội dùng tác nhân lí, hố học tác động vào sơ thể sinh vật đặc biệt lúc tế bào phân chia dẫn đến phân chia khơng bình thƣờng hình thành đa bội Các phƣơng pháp xử lý Phƣơng pháp gây chấn thƣơng: có hiệu họ cà Phƣơng pháp thay đổi nhiệt độ đột ngột Phƣơng pháp hoá học: xử lý chất colchicine, idol axetic axit, sunfamit Phƣơng pháp tạo đa bội thể colchicine (C22H25NO6) Colchicine chất hoá học đƣợc chiết từ (Colchicum autumnale) có nhiều vùng Địa Trung Hải, colchicine dạng tinh thể, màu trắng tan rƣợu benzen, không tan nƣớc Tạo đa bội thể lai Nồng độ thời gian xử lý tùy thuộc vào vật liệu loài trồng, nồng độ dao động từ 0,01 – 1,6%, thời gian xử lý từ 30 phút đến 10 Các thể đa bội tiến hành lai với nhƣ lai dạng tứ bội (4n) nhị bội (2n) tạo dạng tam bội (3n) Một số loài trồng xử lý có bổ sung thêm hóa chất khác nhƣ DMSO (Dimethyl sulfoxide - (CH3)2SO) Phƣơng pháp đƣợc áp dụng thành công số loài trồng nhƣ dƣa hấu tam bội, dâu tằm tam bội Khi xử lý trực tiếp lên đỉnh sinh trƣởng đồng ruộng thời gian ngắn lặp lại vài ngày Sử dụng vật liệu đa bội theo hƣớng sau: Sau xử lý phải rửa nƣớc vô trùng 30 phút Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào trƣờng hợp cụ thể Tiêm vào đỉnh sinh trƣởng Chọn lọc sử dụng trực tiếp Tạo giống lai làm vật liệu cho tổ hợp lai Khắc phục tƣợng bất dục lai xa Dùng thấm đặt lên đỉnh sinh trƣởng mầm mở Nhúng đỉnh sinh trƣởng đỉnh rễ vào dung dịch colchicine Phun dung dịch colchicine lên đỉnh sinh trƣởng 5.4.2 Giá trị đơn bội đơn bội kép 5.4 ĐƠN BỘI THỂ VÀ ĐƠN BỘI KÉP 5.4.1 Khái niệm Đơn bội (Haploid) thực vật có nhiễm sắc thể n = nhƣ giao tử đực hạt phấn giao tử tế bào trứng Để tiến hành nghiên cứu di truyền tính trạng Tạo đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro Đến nay, số lƣợng đơn bội 247 loài thuộc 88 chi 34 họ thực vật hạt kín đƣợc tạo từ ni cấy bao phấn hạt phấn Đơn bội kép (Double Haploid - DH) có nhiễm sắc thể 2n giống hệt nhân lên từ NST đơn bội hình thành từ tế bào trứng hạt phấn H.H Geiger G.A Gordillo (2010) cho tiến chủ yếu dòng DH chọn tạo giống ngô lai Chawla (2002) khái niệm đơn bội kép (DH) kiểu gen đƣợc đƣợc hình thành tế bào đơn bội trải qua trình nhân đơi nhiễm sắc thể (ii)đồng hợp hồn tồn, (i)biến di di truyền tối đa, (iii)nhanh thƣơng mại, (iv)đơn giản, (v)giảm chi phí (vi)(vi) tối ƣu cho ứng dụng marker 7/18/15 5.4.3 Phƣơng pháp tạo đơn bội (Haploid) đơn bội kép (DH) Phƣơng pháp 1: Tạo đơn bội nuôi cấy bao phấn Các bƣớc nuôi cấy bao phấn tạo đơn bội: Một số kỹ thuật tạo đơn bội nhƣ: Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen Chiếu xạ hạt phấn Bƣớc 2: Trồng chăm sóc cho phấn Trì hỗn thụ phấn Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Sử dụng tế bào chất lạ tác nhân thụ phấn Bƣớc 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản Lai xa Tạo đa phôi Bƣớc 5: Nuôi cấy tạo calus tái sinh Bƣớc 6: Chuyển giá thể, đất đánh giá chọn lọc dịng Ghép Xử lý hóa chất Bƣớc 2: Trồng chăm sóc Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen Kiểu gen dòng, giống thuần, giống thụ phấn tự lai F1 đƣợc chọn để trồng cho phấn Bƣớc lựa chọn kiểu gen quan trọng, định khả nuôi cấy thành cơng Kiểu gen lồi trồng phản ứng khác với nuôi cấy bao phấn Trồng chăm sóc lấy bao phấn điều kiện phù hợp với loài, trong số trƣờng hợp trồng nhà kính, nhà lƣới chậu vại Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy bao phấn môi trƣờng MS bản, số lồi mơi trƣờng N6 Chu (1978) Mơi trƣờng nuối cấy bao phấn nghiên cứu cải tiến phù hợp với loài trồng kiểu gen Nhiều nhà nghiên cứu khẳng định nuôi cấy bao phấn lúa (Ozyza sativa L.) gặp khó khăn khả tạo calus hạt phấn thấp sai khác lớn tái sinh Ví dụ lúa lồi phụ Indica mơi trƣờng N6 bổ sung thêm galactose (0,1M), lactose (0,1M), nƣớc dừa (5%), caseine hydrolisate (0,05% w/v), Lglutamine (1,3mM), biotin (2mM), ascorbic acid (2,8mM) chất điều tiết sinh trƣởng Loài phụ Japonica khả tạo calus tốt lồi phụ Indica Lồi phụ Japonica mơi trƣờng SK-I hiệu cao Kết nuối cấy tạo đơn bội, lƣỡng bội tam bội, sau nuôi cấy tiến hành đánh giá chọn lọc đơn bội Môi trƣờng MS bổ sung thêm 2,4D BAP hiệu đối nuôi cấy bao phấn họ thập tự Các nhà khoa học Úc cho môi trƣờng B5 + 2,4-D (2mg/l) + 9% sucrose phù hợp cho họ đậu Bƣớc 4: Thu nụ hoa, khử trùng tách bao phấn nuôi cấy Bước 5: Nuôi cấy tạo calus tái sinh Thu nụ hoa giai đoạn hình thành tiểu bào tử đơn nhân (lúa bơng bẹ địng, khoảng cách đòng tai cuối 3cm) Môi trường nuôi cấy bao phấn dựa môi trường MS N6 cải tiến phù hợp với loài trồng kiểu gen Sau thu hoa, phƣơng pháp nhuộm màu để xác định thời điểm ni cấy phù hợp, số hóa chất nhuộm màu sử dụng nhƣ iron alum haematoxylin nhuộm màu bao phấn lúa, DAPI (4,6 diamidino 2-phenylindol dichloride) với bao phấn họ cam quýt Thu hoa khử trùng bảo quản nhiệt độ thấp Sau bảo quản, tách bao phấn khỏi hoa đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy đĩa petri Số lƣợng ni cấy tùy theo lồi, sở vật chất Bình quân số lƣợng bao phấn nuôi cấy đĩa petri khoảng 30 bao phấn, nuôi cấy tổng số 100 bao phấn cho kiểu gen Môi trường cải tiến thường bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng hóa chất khác (xem bước chuẩn bị môi trường) Điều kiện buồng nuôi cấy thường nhiệt độ 25 ± 1oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ ánh sáng 1000lux (đối với lúa) Một số lồi trồng u cầu mơi trường tạo calus môi trường tái sinh khác như: lúa sau tạo calus tuần chuyển sang môi trường tái sinh môi trường MS bổ sung thêm 1-2mg NAA (Naphthalene acetic acid), 4mg/l kinetin, 40mg/l adenine sulfat 15% CM Điều kiện nuôi cấy giống nuôi cấy tạo calus cường độ ánh sáng tăng lên 2000lux 10 7/18/15 Bƣớc 6: Chuyển ngồi giá thể ngồi đất đánh giá chọn dịng Trồng tái sinh chậu chứa đất dinh dƣỡng phù hợp, ngồi đất nhà kính, nhà lƣới đánh giá đặc điểm nông sinh học xác định độ bội Ví dụ lúa: xác định độ bội xử lý đỉnh rễ dung dịch 8- hydroxyquinoline 18oC giờ, cố định dung dịch ethanol-acetic axít (3:1 v/v) qua đêm nhuộm màu kỹ thuật Feulgen squash quan sát kính hiển vi Những tiến khoa học có thiết bị xác định độ bội nhanh tiết kiệm chi phí nhƣ máy đo độ bội sử dụng marker phân tử Phƣơng pháp 2: tạo đơn bội kích tạo đơn bội tự nhiên Phƣơng pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay gọi phƣơng pháp tạo đơn bội kép (DH) in vivo Geiger (2009) thông báo thụ phấn ngơ có kiểu gen đặc thù gọi kích tạo (inducer), nhận phấn tạo tỉ lệ hạt định có phơi đơn bội (haploid embryo) nội nhũ tam bội Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòng tạo giống ngơ lai thƣơng mại Các bƣớc tạo dịng DH ngơ đƣợc trình bày hình 5.20 Sau thu hạt đơn bội lƣỡng bội hóa tạo dòng đơn bội kép từ hệ * Lƣỡng bội hóa đơn bội tạo đơn bội kép (DH): Phƣơng pháp lƣỡng bội hóa đơn bội từ ni cấy bao phấn hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổ biến sử dụng colchicine Chất alkaloid hoạt động cản trở trình phân chia tế bào dẫn đến không giảm số lƣợng nhiễm sắc thể phân chia Colchicine có tính độc cao, ngày sử dụng số chất khác thay thuốc trừ cỏ, pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxide gas (Kato, 2002), nhƣng chất thay không phù hợp xử lý số lƣợng lớn Hình 5.20 Các bƣớc tạo dịng DH ngô băng Phƣơng pháp in vivo 5.4.4 Ứng dụng đơn bội đơn bội kép cải tiến giống trồng Phƣơng pháp phát triển dòng truyền thống thụ phấn cƣỡng (tự phối) qua - 10 hệ thu đƣợc dòng thuần, nhiên khơng thể tạo đồng hợp hồn tồn Tỉ lệ đồng hợp tăng qua hệ tự thụ phấn Giả sử lai bố mẹ đồng hợp AA x aa thu đƣợc lai F1 (Aa), F1 cho thụ phấn hoàn toàn tỉ lệ đồng hợp dị hợp thu đƣợc qua hệ nhƣ sau: Bảng 5.6 Tỉ lệ đồng hợp qua thể hệ tự thụ phấn Thế hệ tự thụ phấn F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 Tỉ lệ (%) Đồng hợp 50 75 87,5 93,75 96,88 98,44 99,32 Dị hợp 100 50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 5.5 TẠO BIẾN DỊ BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Nuôi cấy mô tế bào tạo lƣợng lớn biến dị di truyền loài thực vật, biến dị di truyền sử dụng chƣơng trình chọn tạo giống trồng Bằng chọn lọc in vitro đột biến đặc điểm nông sinh học có lợi, chống chịu mặn, hạn chống chịu sâu bệnh phân lập đƣợc thời gian ngắn Biến dị soma tạo thành giống thành công số trồng nhƣ cải, lúa trồng khác (S Mohan Jain, 2001) 11 7/18/15 5.5.1 Những thay đổi di truyền xảy trƣớc ni cấy mơ in vitro Trong q trình phát triển cá thể, phân hố già hố mơ tế bào, số thay đổi di truyền xảy đƣợc tích luỹ tế bào soma 5.5.2 Những thay đổi di truyền xảy trình in vitro Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, đƣợc tái sinh từ tế bào soma đột biến Mức độ đột biến tế bào soma lớn đến mức tần số đột biến chất đột biến gây Nguyên nhân gây đột biến cấu trúc bình thƣờng hạt tế bào bị phá vỡ - enzym tiếp xúc với chất tạo sản phẩm đột biến Có thay đổi số lƣợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến gen Tuỳ theo phƣơng thức nuôi cấy tế bào soma, ngƣời ta phân biệt loại biến dị dƣới đây: Auxin gây đa bội hố bên tế bào ni cấy Thay đổi di truyền phổ biến xảy tế bào nuôi cấy đa bội thể Biến dị dịng tế bào mơ sẹo (calusoclonal variation): biến dị tái sinh từ mô sẹo (calus) Đột biến tế bào soma xảy gen tế bào chất (ty thể lục lạp) Biến dị dòng tế bào trần (protoclonal variation) - biến dị tái sinh từ tế bào trần Đột biến tế bào soma ứng dụng vào chọn giống hiệu nhiều trồng nhƣ mía, khoai tây, cà chua, thuốc lá, lúa lúa mì Những biến dị di truyền xảy đƣợc phát q trình ni cấy in vitro gọi chung đột biến dòng tế bào 5.6 TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ GEN 5.5.3 Ứng dụng biến dị tế bào soma Biến dị chọn lọc đột biến tế bào soma xảy nuôi cấy in vitro cung cấp số lƣợng lớn biến dị ứng dụng đa dạng: Tạo dòng tế bào ni cấy có khả sản xuất chất hoạt tính sinh học với suất cao (xem cơng nghệ bioreactor) Tạo giống trồng mang đặc tính biến dị quý, Ví dụ, nhà khoa học Đài Loan chọn tạo đƣợc giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ nấm Fusarium gây Ở nƣớc ta, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo đƣợc giống lúa DR2 có khả chịu hạn, chịu lạnh phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma in vitro kết hợp xử lý điều kiện cực đoan từ giống lúa khơng có khả chống chịu Ứng dụng công nghệ gen tạo biến dị di truyền mức phân tử ADN, locus tính trạng số lƣợng (QTL) hay gen, sau gọi chung kỹ nghệ di truyền Chuyển gen kỹ nghệ di truyền công cụ bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống giúp cho việc mở rộng nguồn gen có lợi từ lồi khác chuyển sang loài trồng mong muốn Kỹ nghệ di truyền chuyển gen có lợi chuyển gen, số gen hay QTL mà phƣơng pháp truyền thống khó thực Khái niệm trồng chuyển gen theo J Machex (1997): “Cây trồng chuyển gen đƣợc chuyển hay nhiều gen từ ta thu đƣợc thêm hay nhiều đặc điểm Các gen đƣợc chuyển vào khơng phải đƣờng lai hữu tính hai bố mẹ mà đƣợc chuyển kỹ thuật di truyền” 5.6.1 Chuyển gen trực tiếp b) Chuyển gen nhờ phân tử PEG (polyethylene glycon) Là phƣơng pháp chuyển trực tiếp gen đƣợc thiết kế plasmid vào tế bào thực vật có trợ giúp yếu tố hoá học, vật lý tác nhân giới PEG phân tử lớn có phân cực, lợi dụng tính chất ngƣời ta tách gen cần chuyển, đƣa vào dung môi với phân tử PEG tế bào trần Chuyển gen trực tiếp sử dụng số kỹ thuật sau: a) Chuyển gen xung điện Sử dụng xung điện với thời gian ngắn điện trƣờng cực mạnh Khi tế bào trần (protoplast) điện trƣờng, dẫn điện tính thấm màng nguyên sinh bị thay đổi Sự thay đổi kéo theo ổn định chỗ tạm thời màng hình thành lỗ hổng Một loạt lỗ hổng đƣợc hình thành, ADN đƣợc chuyển qua lỗ hổng vào tế bào gắn vào máy di truyền Tế bào chuyển gen đƣợc nuối cấy tạo calus, tái sinh đánh giá chuyển gen Một tế bào thực vật tiếp thụ ADN nhờ xung điện mà không cần xử lý trƣớc nhƣ tế bào ngô, lúa phơi non lúa mì Các ADN bị hút vào đầu phân tử PEG có điện cực trái dấu, sau PEG bị tế bào trần hút phía Các ADN đầu PEG vào tế bào trần theo chế nuốt amip Thuốc hoa mào gà hai đối tƣợng đƣợc sử dụng cho chuyển gen trực tiếp nhờ tác động PEG Nhƣợc điểm lớn sử dụng phƣơng pháp chuyển gen xung điện nhờ xử lý PEG việc tái sinh hữu thụ tốn nhiều thời gian, công sức mà kết phụ thuộc vào kiểu gen loài trồng Ngoài ra, vấn đề biến dị soma, có nhiều gắn hệ gen, tái sinh bạch tạng… trở ngại cho việc chuyển gen sử dụng hai phƣơng pháp hoà thảo (cây lúa) 12 7/18/15 c) Chuyển gen vi tiêm Ngƣời ta sử dụng vi kim kính hiển vi để tiêm lƣợng nhỏ ADN vào tế bào định, tế bào trần hay tế bào nguyên Phƣơng pháp có ƣu điểm ADN đƣợc đƣa vào tế bào cách xác Phƣơng pháp cần thao tác khéo léo, yêu cầu trang thiết bị Vật liệu chuyển gen tế bào trần, qua ống phấn Khi hạt phấn rơi đầu nhuỵ (quá trình thụ phấn), hạt phấn nảy mầm hình thành ống phấn Lúc tiêm ADN mong muốn tách theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái, ADN cần chuyển kết hợp hình thành hợp tử có mang gen cần chuyển Phƣơng pháp thành công lúa bông, nhiên hạn chế phƣơng pháp kỹ thuật cao tốn d) Chuyển gen bắn gen Lịch sử thành tựu chuyển gen bắn gen: Phƣơng pháp chuyển gen bắn gen đƣợc Klein T.M., Wolf E.D Sanford J.C công bố lần năm 1987 với tiêu đề vi đạn tốc độ cao đƣa nucleic axít vào tế bào sống đăng tạp chí Nature số 327 Các nhà khoa học sử dụng hạt tungsten có kích thƣớc nhỏ, khối lƣợng phân tử lớn, bay với vận tốc nhanh xuyên qua thành màng tế bào không gây chết tế bào sống Các tác giả cho phƣơng pháp khắc phục khó khăn phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn bị hạn chế phạm vi ký chủ Nguyên lý chung chuyển gen bắn gen: Thiết kế vector mang ADN cần chuyển, kết tủa ADN lên bề mặt vi đạn, sử dụng áp lực khí He (helium) bắn vi đạn bay xuyên qua mô tế bào Các ADN bề mặt vi đạn đƣợc giữ lại mô tế bào gắn vào máy di truyền, tái sinh đánh giá tế bào chuyển gen Vi đạn loại vi đạn vàng, tungsten (Wolfram) Vật liệu sử dụng chuyển gen bắn gen: Vật liệu sử dụng bắn chuyển gen mơ tế bào, phơi, mơ hạt, calus tế bào huyền phù nuôi cấy mô tế bào Các bƣớc chuyển gen bắn gen gồm: chọn kiểu gen, tách mô, thiết kế vector chuyển gen, xử lý mơ, thiết kế q trình bắn gen (kết tủa ADN bề mặt vi đạn, nuôi cấy tạo mô chuyển gen, nạp đạn vi đạn), tái sinh cây, đánh giá chọn lọc chuyển gen Hình 5.21 Sơ đồ bƣớc bắn gen vào mô thực vật Bƣớc 2: Chuẩn bị vector chuyển gen Bƣớc 1: Chọn kiểu gen tách mô Kiểu gen sử dụng chuyển gen dòng, giống ƣu tú cần cải tiến tính trạng Tách mơ khử trùng đƣa vào nuôi cấy in vitro tạo vật liệu chuyển gen Ví dụ, chuyển gen CBF3 biểu tăng cƣờng tính chịu lạnh, chịu mặn chịu hạn Arabidopsis, thuốc (Nicotiana tabacum L.) lúa mỳ (Triticum aestivum L.) vào ngô hạt cho nảy mầm môi trƣờng MS + vitamin B5 bổ sung thêm µmol L–1 2,4-D (2,4dichlorophenoxyacetic acid, Sigma, St Louis, MO) đến ngày Cấu trúc mang gen có nhiều loại khác gọi vector chuyển gen Vector chuyển gen plamid phân tử ADN mạch đơi dạng vịng có kích thƣớc đến 400 kilobase pairs (kbp) Ví dụ: vector chuyển gen vào mô hạt ngô Diaa Al-Abed cs năm 2007 Plasmid pC1301 mang vùng khơng phiên mã intron ßglucuronuridase (GUS) Australia (Black Mountain, ACT, Australia) The GUS intron sử dụng để kiểm tra nhanh xác định điều kiện biểu bao mầm mô phân sinh chồi ADN cần chuyển đƣợc gắn vào vector trƣớc kết tủa lên bề mặt vi đạn Mỗi loài trồng, vật liệu chuyển gen thiết kế vector chuyển gen phù hợp có ý nghĩa quan trọng để bắn gen thành công 13 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 7/18/15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ Bƣớc 4: Chọn lọc tái sinh Xác định kết chuyển gen vector gắn GUS nhận biết mô chuyển gen thành công nhờ sử dụng nhuộm màu dung dịch X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid) sau bắn gen 48 quan sát kính hiển vi Các mô xác định chuyển gen thành công chuyển vào môi trƣờng nuôi cấy để tái sinh Bƣớc 3: Bắn gen Thiết kế bắn gen cần quan tâm đến điều kiện nâng cao hiệu bắn gen nhƣ: áp lực khí He Theo nghiên cứu Diaa Al-Abed cs (2007) áp lực khí He 10,69 MPa hiệu Môi trƣờng điều kiện ni cấy tùy thuộc lồi trồng Ví dụ nuôi cấy mô ngô chuyển gen môi trƣờng MSI ngày, nhiệt độ 26oC điều kiện ánh sáng 16/8 sáng/tối, chuyển sang môi trƣờng MSI chọn lọc bổ sung thêm 25 mg/l hygromycin, thay môi trƣờng hai tuần lần trƣớc chuyển sang môi trƣờng tạo rễ môi trƣờng MS có chứa 3,2 μmol/ L NAA (1-naphthaleneacetic acid), bổ sung thêm 10 mg/ l hygromycin trƣớc chuyển giá thể đất Bƣớc 5: Trồng đánh giá chọn lọc chuyển gen Cây chuyển gen đƣợc chuyển giá thể tiếp nhận, khỏe Theo Elina Helenius cs (1996) kết tối ƣu với Arabidopsis 75psi, nhƣng tối ƣu với thuốc bạch dƣơng 200psi Kích thƣớc vi đạn vàng tối ƣu 0,6µm lƣợng ADN vi đạn µg tối ƣu cho Khoảng cách từ súng bắn gen đến mô từ – 9cm phù hợp 5.6.2 Chuyển gen gián tiếp Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp gen đƣợc chuyển vào tế bào thực vật qua sinh vật trung gian, thƣờng vi khuẩn virus mạnh chuyển đất nhà kính, nhà lƣới, nhân * Chuyển gen nhờ virus: đánh giá Virus đƣợc coi vectơ chuyển gen thực vật Tiêu chuẩn để virus làm vectơ chuyển gen: Trên sở gen chuyển để thiết kế thí nghiệm đánh giá Thí nghiệm Có cấu trúc ADN đánh giá chuyển gen kháng bệnh lây nhiễm nhân tạo, chống chịu bất thuận gây bất thuận nhân tạo Ngày nhờ marker phân tử, đánh giá nhận biết chuyển gen nhanh xác Khơng gây hại có độ gây hại thấp Có phổ ký chủ rộng Có khả mang gen Có khả di chuyển qua lỗ tế bào Một số hạn chế phƣơng pháp mô bị phá huỷ dẫn tới khả phục hồi khả tái sinh thấp, khả tái sinh không hoàn chỉnh, nhiều đƣợc chuyển vào tế bào gây khó khăn cho việc phân tích, hiệu chuyển gen thấp Có hai loại virus đảm nhận vai trò làm vectơ chuyển gen là: Caulifower Mosaic Virus (CaMV): virus hại họ cải Geninivirus: nhóm virus gây hại phổ ký chủ rộng (cây mầm mầm) * Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium: Hai chủng đƣợc sử dụng phổ biến để chuyển gen A tumefaciens A rhizogenes Những nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium vào Arabidopsis thaliana (L.) Heynh nhà nghiên An, G cs (1986), Lloyd, A cs (1986), Sheikholeslam, S N & Weeks, D P (1987) Đến phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn thành cơng hầu hết lồi trồng nhƣ lúa, ngô, đậu tƣơng… Nguyên lý phƣơng pháp: dựa tƣợng nhóm vi khuẩn Agrobacterium mang plasmid gây khối u thực vật gọi Ti-plasmid nhƣ mô tả hình 5.23 Ghi chú:(a) Ti- plamid chứa T-DNA vai phải (RB) vai trái (LB), vùng phiên mã virulence (vir); (b) Các T-DNA khoảng 25bp lặp lại cung cấp điểm tiếp hợp để cắt DNA endonuclease VirD2–VirD1 Nó cắt nucleotides thứ ba thứ tƣ trình tự hai vai; (c) Bản T-DNA phóng thích phân tử DNA sợi đơn (T-strand) có phân tử VirD2 gắn đầu 5’ Chuỗi cịn lại T- DNA có chức sinh học khơng dài, thƣờng sử dụng nhƣ điểm định hƣớng toàn vẹn T-DNA tế bào thực vật; TDNA tổ hợp vào genome ký chủ; (d) độ dài đầy đủ sợi đơn; (e) phân tử TDNA bị cắt; (f) nhân phân tử T-DNA 14 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam 7/18/15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ Q trình vi khuẩn chuyển gen vào tế bào trải qua 10 bƣớc là: Cây bị nhiễm A tumefaciens qua vết thƣơng tạo thành khối u, khối u tiếp tục phát triển khơng có mặt vi khuẩn truyền đoạn ADN Ti-plasmid (T-ADN) vào gen Ti-plasmid ADN mạch vịng kép có cấu trúc đƣợc chia thành bốn vùng gồm hai vùng tác động trực tiếp đến hình thành khối u vùng T-ADN vùng vir, hai vùng cịn lại có chức trình tiếp hợp tái Ti-plasmid vi khuẩn Trong đoạn T-ADN gắn vào gen có chứa gen tổng hợp phytohormon auxin cytokinin nên liên quan đến việc sản sinh hay trì phân chia tế bào liên tục tạo thành khối u trồng Bƣớc 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật; Bƣớc 3: kích thích biểu vùng vir tín hiệu đặc thù ký chủ; Bƣớc 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổ hợp hoạt động protein VirD1 VirD2; Bƣớc 5: tế bào vi khuẩn tồn T-DNA nhƣ phức hợp protein ADN với phân tử VirD2 gắn đầu 5’ T-strand có số protein vir khác chuyển vào tế bào ký chủ hệ thống VirB/D4, bƣớc yêu cầu có tƣơng tác T-pilus với protein đặc thù ký chủ; Bƣớc 6: bên tế bào chất tế bào ký chủ T-DNA tồn chút Tcomplex thành thục, phân tử T-strand có độ dài hồn chỉnh với vỏ số phân tử VirE2 Những phân tử T-DNA cấu trúc protein cần thiết cho vận chuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, bƣớc trình biến nạp di truyền; Bƣớc 7: thâm nhập vào nhân; Bƣớc 8: vận chuyển nhân; Bƣớc 9: T- DNA khơng vỏ bọc; Bƣớc 10: hịa hợp với di truyền ký chủ Chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens phụ thuộc vào số yếu tố liên quan đến vi khuẩn thực vật Các bƣớc chuyển gen nhờ vi khuẩn Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: Bƣớc 1: Tách nhân vi khuẩn Chủng vi khuẩn, Vi khuẩn A tumefaciens vi khuẩn gram âm đất (hình 5.24), phân lập nuôi nhân vi khuẩn bƣớc phục vụ công việc chuyển gen Mật độ vi khuẩn, Thời gian lây nhiễm, Hoạt tính gen vir, Khả xâm nhập vào chủ loại vectơ Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm: Loại cây, kiểu gen, Dạng mẫu mô, Khả phân bào tế bào đích TP mơi trƣờng… Ni cấy, nhân vi khuẩn thông thƣờng môi trƣờng L-broth (LB), điều kiện 28oC, máy lắc 200 vòng phút, bổ sung kháng sinh phù hợp từ 8-12 Kháng sinh bổ sung nuôi nhân vi khuẩn, thƣờng kanamycin nồng độ 50 mg/ml, carbenicillin nồng độ 50 100 mg/ml, tetracycline nồng độ mg/ml Sau nhân tách dịch khuẩn ly tâm nhân vi khuẩn để sử dụng chuyển gen Bƣớc 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti - plamid vi khuẩn Các kỹ thuật chủ yếu bƣớc tách ADN cần chuyển ezime, tách Ti - plamid vi khuẩn cắt đoạn ADN tƣơng ứng vị trí nhân gen plamid (Multiple cloning site - MCS) Đƣa DNA Ti - plamid cắt đoạn tƣơng ứng enzyme T4 Ligase vào môi trƣờng đệm T4 để nối ghép DNA với Ti - plamid điều kiện nhiệt độ thấp qua đêm, kết thu đƣợc Ti plamid gắn gen DNA cần chuyển dạng vòng Bƣớc kiểm tra Ti - plamid E.coli xác định Ti plamid chuẩn đƣợc tách chuyển vào vi khuẩn A tumefaciens, bƣớc lây nhiễm vào mô, tế bào thực vật chuyển gen Hình 5.24 Vi khuẩn A.tumefaciens 15 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ Bước 3: Tách mô chuyển gen Vật liệu chuyển gen nhờ vị khuẩn đĩa lá, mơ, calus, mơ hạt tách từ kiểu gen mong muốn cần chuyển gen, khử trùng, đưa lên môi trường nuôi cấy in vitro Chuyển gen vào mô hạt phổ biến nhiều lồi trồng lúa, ngơ, họ thập tự Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn gắn plamid vào mô tế bào Lây nhiễm để chuyển gen trộn vi khuẩn với vật liệu nuôi cấy môi trường chọn lọc, môi trường chọn lọc môi trường có kháng sinh Những tế bào nhận gen chuyển đồng thời nhận promoter gen kháng kháng sinh sống sót tế bào khác bị chết mơi trường chọn lọc Hình 5.25 Vị trí nhân gen Ti-plamid vi khuẩn A tumefaciens Những tế bào nhận gen sống sót phát triển thành calus đưa sang môi trường tái sinh Bảng 5.7 Thành phần môi trƣờng ni cấy sử dụng thí nghiệm chuyển gen nhờ A tumafaciens (Theo Sambrook cs., 1989; Frame cs., 2002) Bƣớc 5: Tái sinh chuyển gen Môi trƣờng tái sinh môi trƣờng MS, có cải tiến đặc thù với lồi trồng bổ sung thêm chất điều tiết sinh trƣởng, vitamin hợp chất hữu khác Sau tái sinh in vitro chuyển giá thể tiếp nhận đất, nhân đánh giá chuyển gen Thành phần N6/MS Sucrose (g/l) Glucose (g/l) L-proline (g/l) MES (g/l) 2,4-D (mg/l) pH Phytagel (g/l) AgNO3 (1mg/l) AS (mM) Cefotaxime (mg/l) LBa 7,0 - Myo-inositol (g/l) - Paromycin (mg/l) - Hóa chất khác IM N6 30 60 5,2 200 CCM N6 20 10 0,7 5,8 0,85 200 ReM N6 20 10 0,7 0,5 5,8 0,85 SeM N6 20 10 0,7 0,5 5,8 0,85 RM MS 20 250 250 250 5,8 100 100 Cao nấm men: 5g; Trypton: 10g; NaCl: 10g; Agar 15g Bước 6: Đánh giá chuyển gen Đánh giá chuyển gen thực thí nghiệm đồng ruộng, thí nghiệm đánh giá nhà kính, nhà lưới Thí nghiệm đánh giá kiểu hình kết hợp với marker phân tử để đánh giá nhanh xác Cây trồng biến đổi gen trước đưa sản xuất đại trà cần đánh giá rủi ro an toàn sinh học, an toàn với sức khoẻ người an tồn với mơi trường 16 ... 200 CCM N6 20 10 0,7 5, 8 0, 85 200 ReM N6 20 10 0,7 0 ,5 5,8 0, 85 SeM N6 20 10 0,7 0 ,5 5,8 0, 85 RM MS 20 250 250 250 5, 8 100 100 Cao nấm men: 5g; Trypton: 10g; NaCl: 10g; Agar 15g Bước 6: Đánh giá... Bảng 5. 6 Tỉ lệ đồng hợp qua thể hệ tự thụ phấn Thế hệ tự thụ phấn F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 Tỉ lệ (%) Đồng hợp 50 75 87 ,5 93, 75 96,88 98,44 99,32 Dị hợp 100 50 25 12 ,5 6, 25 3,12 1 ,56 0,78 5. 5 TẠO... soma Nguyên lý 2: Chọn cặp bố mẹ dựa khả kết hợp Nguyên lý 3: Chọn cặp bố mẹ dựa khả chống chịu bệnh Nguyên lý 4: Chọn cặp bố mẹ dựa suất yếu tố tạo thành suất Nguyên lý 5: Dựa thị phân tử chọn