Bài viết này đề cập đến cách bố trí thí nghiệm để nghiên cứu đặc điểm cấu tạo, hoạt động của tinh trùng, các chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch. Các đặc điểm của tinh trùng được đề cập đến là hình thái, cấu tạo chung, acrosome, tinh trùng kì hình, các dạng vận động và đặc tính của tinh trùng. Các chỉ tiêu sinh lí của tinh dịch hoạt lực tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng kì hình.
JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE 2014, Vol 59, No 6BC, pp 125-130 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM QUAN SÁT CẤU TẠO, HOẠT ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÍ CỦA TINH DỊCH PHỤC VỤ CHO THỰC HÀNH NỘI DUNG SINH LÍ SINH SẢN, HỌC PHẦN SINH LÍ NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Nguyễn Đình Dũng1 , Nguyễn Văn Hiền2 Văn phòng Đảng uỷ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khoa Tóm tắt Đặc điểm cấu tạo, hoạt động tinh trùng, đặc điểm sinh lí tinh dịch nội dung quan trọng nghiên cứu giảng dạy sinh lí người động vật Bài viết đề cập đến cách bố trí thí nghiệm để nghiên cứu đặc điểm cấu tạo, hoạt động tinh trùng, tiêu sinh lí tinh dịch Các đặc điểm tinh trùng đề cập đến hình thái, cấu tạo chung, acrosome, tinh trùng kì hình, dạng vận động đặc tính tinh trùng Các tiêu sinh lí tinh dịch hoạt lực tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng kì hình Các phương pháp nghiên cứu đề xuất giải đông tinh đông lạnh nước ấm 37◦ C 50 giây; sử dụng dung dịch formon citrate 2,9% (hoặc formon Salina) phút để cố định tiêu bản; sử dụng dung dịch Acro - stain hãng IMV (Pháp) để nhuộm acrosome tinh trùng Từ khóa: Tinh ngun; tinh đơng lạnh; cấu tạo, hoạt động tinh trùng; tiêu sinh lí tinh dịch Mở đầu Theo Bộ Giáo dục Đào tạo, để nâng cao chất lượng đào tạo cần tập trung nhiều vào công tác học tập sinh viên, cần làm cho người học trở nên động việc học (Bộ Giáo dục Đào tạo, 2005) Phương pháp lĩnh hội kiến thức thông qua thực hành, thí nghiệm khẳng định có hiệu cao dạy học nói chung dạy học Sinh học nói riêng Phương pháp dạy học thực hành phương pháp giảng dạy sở quan sát giáo viên làm mẫu thực tự lực người học hướng dẫn giáo viên nhằm hoàn thành tập, công việc thuộc chuyên ngành, từ hình thành kĩ năng, kĩ xảo Thêm vào đó, phương pháp dạy học thực hành cịn giúp người học củng cố tri thức, phát triển lực tư để có đủ khả xử lí tình nghề nghiệp thực tế sống [3,7] Trong nghiên cứu giảng dạy nội dung sinh lí sinh sản, học phần Sinh lí người Động vật, đặc điểm cấu tạo, hoạt động tinh trùng, tiêu sinh lí tinh dịnh nội dung người học đặc biệt quan tâm Các đặc điểm tinh trùng tinh dịch từ lâu đề cập đến nhiều tài liệu Sinh học [1,2,4] Tuy nhiên, hình ảnh dù xuất với chất Liên hệ: Nguyễn Đình Dũng, e-mail: nddung@hnue.edu.vn 125 Nguyễn Đình Dũng, Nguyễn Văn Hiền lượng hình ảnh cao đến đâu, số liệu thống kê cụ thể không sinh động, tạo hiệu ghi nhớ cao quan sát hình ảnh thực tế Đặc biệt, mẫu vật tự tay người học làm tạo hứng khởi chủ động lĩnh hội tri thức người học Bài viết đề cập đến cách bố trí thí nghiệm nghiên cứu cấu tạo, hoạt động tinh trùng đánh giá số tiêu sinh lí tinh dịch nhằm nâng cao hiệu dạy học nội dung Sinh lí sinh sản, học phần Sinh lí người Động vật 2.1 Nội dung nghiên cứu Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu Vật liệu Sử dụng tinh dịch dạng tinh nguyên tinh đông lạnh lợn đực khoẻ mạnh, trưởng thành sinh dục thuộc giống lợn Yorkshire Landrace Nội dung nghiên cứu Cấu tạo, dạng vận động tinh trùng số tiêu sinh lí tinh dịch lợn Phương pháp giải đông tinh đông lạnh Phương pháp làm tiêu quan sát cấu tạo, hình thái tinh trùng Phương pháp nghiên cứu Phương pháp đánh giá chất lượng tinh nguyên Nồng độ tinh trùng đánh giá máy so màu SDM-S hãng Minitub (Đức) Hoạt lực tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng kì hình nghiên cứu dựa sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0 Phương pháp giải đông Cọng rạ sau đông lạnh nitơ lỏng giải đông nước ấm nhiệt độ thời gian khác nhau, sau pha lỗng với mơi trường BTS 2.2 Kết thảo luận Đặc điểm vận động tinh trùng cách tiến hành thí nghiệm để quan sát * Đặc tính chuyển động tới trước Tinh trùng cịn sống ln chuyển động Sự chuyển động tinh trùng nhờ phần cổ- thân phần đuôi Trong vận động, đuôi tinh trùng uốn éo, co rút tạo áp lực cho tinh trùng tiến phía trước Ngồi phần đầu tinh trùng có hình khí động học (hình lê, hình chùy), có khả xoay tròn quanh trục thân, kết hợp với vận động xoay trịn cổ - thân tạo thành véc tơ chuyển động thẳng tới trước Tốc độ di chuyển tới trước tinh trùng phụ thuộc vào điều kiện nội (sức sống tinh trùng) ngoại cảnh (niêm dịch đường sinh dục tiết nhiều hay ít; mức độ đặc, lỗng tinh dịch; phương thức phóng tinh đực; mức độ co bóp phận bên đường sinh dục chủ yếu sừng tử cung ống dẫn trứng) Tốc độ di chuyển tinh trùng cịn phụ thuộc vào nhiệt độ mơi trường Ở nhiệt độ từ 38 - 40◦ C, tinh trùng chuyển động nhanh, nhiệt độ 5◦ C, tinh trùng gần khơng vận động Ngồi ra, tốc độ vận động tinh trùng phụ thuộc vào mức độ thành thục Tốc độ trung bình tinh trùng ngựa thành thục quan sinh dục 5mm/phút; tinh trùng bò, dê: mm/phút tinh trùng thỏ, chó: mm/phút 126 Bố trí thí nghiệm quan sát cấu tạo, hoạt động tinh trùng đánh giá số Sự vận động tinh trùng gắn liền với hoạt động enzym trao đổi chất Ở dịch hoàn phụ, tinh trùng gần khơng vận động, phóng ra, gặp tinh hoạt động hoạt hóa enzym chất có tinh Trạng thái hoạt động tinh trùng thể chất lượng tinh dịch Nếu tinh trùng hoạt động mạnh chất lượng tốt Tinh trùng có hình thức vận động [1]: + Vận động tiến thẳng: Đây tinh trùng có khả thụ thai + Vận động xoay tròn: Tinh trùng vận động di chuyển theo vòng tròn, tinh trùng có dạng vận động thường khơng có khả thụ thai + Vận động chỗ: Là dạng vận động kiểu “lắc lư” chỗ, nghĩa vị trí khơng gian tinh trùng khơng thay đổi Tinh trùng loại thường tinh trùng non bị dị tật khơng có khả thụ thai Với cơng nghệ kĩ thuật số người ta xác định dạng chuyển động, tốc độ chuyển động tinh trùng xác định khoảng cách tinh trùng chuyển động khoảng thời gian định khoảng cách, vận tốc chuyển động theo đường ziczăc, theo đường trung bình theo đường thẳng + DCL (Distance Curve Line): Độ dài đường ziczăc (µm) + DAP (Distance Average Path): Độ dài đường trung bình (µm) + DSL (Distance Straight Line): Độ dài đường thẳng (µm) Tương ứng với dạng chuyển động trên, người ta xác định tốc độ chuyển động tinh trùng dạng đường là: + VCL (Velocity Curve Line): Tốc độ chuyển động theo đường ziczăc (µm/giây) + VAP (Velocity Average Path): Tốc độ chuyển động theo đường trung bình (µm/giây) + VSL (Velocity Straight Line): Tốc độ chuyển động theo đường thẳng (µm/giây) Hình 1: Các dạng vận động tinh trùng Để quan sát đo dạng vận động tinh trùng cần sử dụng kính hiển vi kết nối với máy tính có cài sẵn phần mềm Sperm Vision 3.0 Tiến hành cách: Dùng Micropipet hút lấy 0,23 µl tinh nguyên tinh pha, bơm vào phiến kính chuyên dụng, quan sát kính hiển vi đánh giá phần mềm máy tính Nếu khơng có hệ thống máy tính cài đặt phần mềm Sperm Vision 3.0 quan sát dạng vận động tinh trùng cách: nhỏ giỏ tinh dịch lên phiến kính, đậy lamen lên giọt tinh dịch quan sát kính hiển vi thường Với cách thí nghiệm quan sát dạng vận động đường tinh trùng, không đo số đo cụ thể * Đặc tính lội ngược dịng Tinh trùng có xu lội ngược dòng niêm dịch đường sinh dục Khi vào đường sinh dục gặp dòng niêm dịch chảy ngược, vận tốc chuyển động tinh trùng tăng từ 2-2,5 127 Nguyễn Đình Dũng, Nguyễn Văn Hiền lần Nhờ có đặc tính này, gặp dịng niêm dịch chảy đường sinh dục cái, tất tinh trùng chuyển động hỗn loạn vận động hướng: tiến vào phía ống dẫn trứng Để quan sát đặc tính tinh trùng cần tiến hành cách: nhỏ giọt tinh nguyên tinh pha lên phiến kính, sau đưa lên quan sát kính hiển vi Qua kính hiển vi quan sát hướng chảy tinh dịch hướng chuyển động tinh trùng ngược với hướng chảy tinh dịch * Đặc tính tiếp xúc với vật lạ Trong vận động, gặp vật lạ (hạt bụi, bọt khí, trứng ), tinh trùng tiến đến bao vây lấy vật lạ Nhờ có đặc tính này, vào đường sinh dục cái, tinh trùng ln có xu bao vây lấy trứng, phá hủy màng tế bào trứng, vào nhân hoàn thành trình thụ tinh để tạo thành hợp tử Để quan sát đặc tính tinh trùng cần tiến hành cách: Nhỏ giọt tinh nguyên tinh pha lên phiến kính Lấy hạt bụi đặt vào giọt tinh dịnh quan sát kính hiển vi thấy tinh trùng bao vây lấy hạt bụi đồng thời tiến hành công phá hạt bụi Ngồi ra, giọt tinh dịch có bọt khí vật lạ khác quan sát thấy tượng tương tự * Đặc tính tiếp xúc với điện Trong thời gian động dục, ống dẫn trứng tử cung có điện định thân tinh trùng mang điện, có điện thiết lập tinh trùng ống dẫn trứng Đặc tính dịng điện chạy từ nơi có điện cao đến nơi có điện thấp, tinh trùng vận chuyển theo hướng định Có thể tiến hành thí nghiệm quan sát đặc tính tinh trùng cách: Lấy hai cốc đựng tinh dịch, cho dòng điện có hiệu điện 3,55 vol vào cốc, cốc cịn lại khơng cho dịng điện Kết quan sát cho thấy tinh trùng cốc có dịng điện hoạt động mạnh so với tinh trùng cốc khơng có dịng điện Chế độ giải đơng tinh dịch đông lạnh sử dụng tinh đông lạnh quan sát cấu tạo, hoạt động tinh trùng Tinh nguyên vật liệu thí nghiệm tốt cho quan sát cấu tạo, hoạt động tinh trùng Tuy nhiên, lúc có tinh nguyên để phục vụ cho thực hành Khi khơng có tinh ngun sử dung tinh đông lạnh thay Tinh dịch đơng lạnh trạng thái thủy tinh Để có tinh dịch phục vụ cho thực hành cần phải có khâu thiếu giải đông tinh dịch Trong giải đông tinh dịch, giải đông cách tăng nhiệt độ từ từ nhiệt độ đạt -10◦ C đến 0◦ C tế bào chất chuyển sang pha kết tinh hoá làm cho cấu trúc tinh trùng bị phá vỡ, tinh trùng chết nhanh chóng Để tránh xảy tượng này, giải đông tinh dịch cần ủ nóng nhanh dịch để tế bào chất tan chảy không chịu đựng pha kết tinh hóa Để giải đơng tinh dịch sử dụng nước ấm thời gian khác Thời gian nhiệt độ giải đơng tiến hành theo chế độ: - Giải đông 37◦ C 30 giây - Giải đông 37◦ C 50 giây - Giải đông 40◦ C 30 giây - Giải đông 40◦ C 50 giây Sau giải đông nước ấm, tinh dịch pha với môi trường BTS 37◦ C để kiểm tra hoạt lực Kết hoạt lực tinh trùng sau giải đơng thể Bảng 128 Bố trí thí nghiệm quan sát cấu tạo, hoạt động tinh trùng đánh giá số Bảng 1: Hoạt lực tinh trùng sau giải đông Hoạt lực tinh trùng Chế độ giải đông N X ± mx Cv % ◦ 37 C 30 giây 98 28,12 ± 1,90 12,04 ◦ 98 35,67 ± 1,14 11,27 37 C 50 giây ◦ 40 C 30 giây 98 32,10 ± 0,97 7,45 40◦ C 50 giây 98 34,98 ± 1,57 9,23 Kết cho thấy, phương pháp giải đông nhiệt độ 37◦ C 50 giây cho kết cao Khơng có sai khác hoạt lực phương pháp giải đông so với hoạt lực phương pháp giải đông nhiệt độ 40◦ C 50 giây Ngược lại, có sai khác hoạt lực với phương pháp giải đông nhiệt độ 37◦ C 30 giây 40◦ C 30 giây [6] Quan sát cấu tạo tinh trùng Cấu tạo tinh trùng quan sát thông qua phần mềm Sperm Vision 3.0 Nếu khơng có hệ thống phần mềm tiến hành làm tiêu cố định cách: Lấy hai phiến kính rửa sạch, sấy khơ, nhỏ giọt tinh dịch lên phiến kính, dùng phiến kính gạt cho tinh dịch dàn mỏng Để hong khơ ngồi khơng khí khoảng phút Sau dùng dung dịch formon citrate 2,9% (hoặc formon Salina) nhỏ lên mẫu tinh, dàn cho dung dịch formon phủ hết, để - phút cho khô (cố định tiêu bản) Sau formon khô, dùng lamen đậy lên cố định lamen Nhỏ giọt dầu soi kính lên tiêu quan sát kính hiển vi phản pha với độ phóng đại 10 x 100 lần Trong trình quan sát cần phân biệt cấu tạo phần tinh trùng, phân biệt tinh trùng bình thường, tinh trùng kì hình tính tỉ lệ phần trăm tinh trùng kì hình tinh dịch [6] Tỉ lệ phần trăm tinh trùng kì hình số tinh trùng kì hình x 100/tổng số tinh trùng quan sát Nhuộm quan sát acrosome tinh trùng Acrosome (thể đỉnh) thể nằm phần đầu tinh trùng Acrosome chứa enzim phân hủy vỏ trứng, giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng Chỉ có tinh trùng có acrosome nguyên vẹn tham gia thụ tinh Vì vậy, tỉ lệ tinh trùng có acrosome nguyên vẹn tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng tinh dịch Để quan sát acrosome cần tiến hành cách: nhỏ giọt tinh nguyên tinh pha lên phiến kính Sau nhỏ giọt dung dịch Acro - Stain hãng IMV (Pháp) bên cạnh giọt tinh Dùng đũa thuỷ tinh trộn đều, dàn mỏng tiêu phiến kính để khơ Xem qua kính hiển vi với độ phóng đại 10 × 40 (có kính hiển vi phản pha tốt) Đếm số tinh trùng khơng cịn acrosome ngun vẹn Lấy tổng số tinh trùng acrosome nguyên vẹn tổng số tinh trùng đếm (%) acrosome nguyên vẹn Theo Johnson (1981) nghiên cứu tinh dịch lợn Đại bạch Landrace cho biết tỉ lệ tinh trùng có acrosome bình thường đạt 91% [8] Theo Đào Đức Thà cs (2009) cho thấy tỉ lệ acrosome nguyên vẹn giống lợn Yorkshine Landrace đạt 93,3% [6] Kết luận Tinh dịch lợn dạng nguyên tinh dịch lợn đông lạnh sử dụng thực hành quan sát cấu tạo đánh giá số tiêu sinh lí tinh dịch 129 Nguyễn Đình Dũng, Nguyễn Văn Hiền Phương pháp đem lại hiệu cao nghiên cứu cấu tạo, hoạt động tinh trùng đánh giá tiêu sinh lí tinh dịch là: - Sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0 thực hành quan sát cấu tạo, hoạt động tinh trùng - Sử dụng phương pháp giải đông nhiệt độ 37◦ C 50 giây để giải đông tinh dịch đông lạnh - Sử dụng dung dịch formon citrate 2,9% (hoặc formon Salina) - phút để cố định tiêu quan sát cấu tạo hình thái tinh trùng, thống kê tỉ lệ tinh trùng kì hình - Sử dụng dung dịch Acro - Stain hãng IMV (Pháp) để nhuộm quan sát acrosome tinh trùng, thống kê tỉ lệ tinh trùng bị hư hỏng acrosome TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Tấn Anh, 1985 Một vài đặc điểm sinh vật học tinh trùng Tạp chí KHKT NN số 278, 376 - 377 [2] Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Văn Hoan, 2000 Giáo trình Sinh lí sinh sản gia súc Nxb Nơng nghiệp Hà Nội [3] Đinh Quang Báo, Nguyễn Đức Thành, 1996 Lí luận Dạy học Sinh học Nxb Giáo dục [4] Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Cơng Huỳnh, 2007 Sinh lí học người động vật, tập Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội [5] Lương Tất Nhợ cộng Khảo sát đánh giá chất lượng tinh dịch giống lợn Yorkshire, Duroc, Landrace [6] Đào Đức Thà, Đỗ Hữu Hoan, Nguyễn Đình Dũng, Văn Lệ Hằng, 2009 Ảnh hưởng tốc độ ly tâm, chế độ cân bằng, môi trường, thời gian đông lạnh chế độ giải đông đến chất lượng tinh dịch lợn dạng cọng rạ Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn ni Số 18 = 2009 [7] Đặng Thị Dạ Thủy, 2012 Bài tập thí nghiệm nghiên cứu tài liệu dạy học mơn Sinh học trường phổ thơng Tạp chí Giáo dục số đặc biệt 11/2012, Tr 107 = 109 [8] L A Johnson, J G Aalbers, C.M.T Willems and W Sybesma, 1981 Use of Boar Spermatozoa for Artificial Insemination I Fertilizing Capacity of Fresh and Frozen Spermatozoa in Sows on 36 Farms J ANIM SCI 1981, 52:1130-1136 ABSTRACT Arrange experiments to research of structure characteristics and activity of sperm, and the physiological features of semen use for practical reproductive physiology, human and animals physiology Sperm structure characteristics, sperm activity and physiological characteristics of semen are the important contents in studying and teaching human and animals physiology This article refers to experiments to research of structure characteristics and activity of sperm, and the physiological features of semen as well The sperm characteristics mentioned in this article are morphology, general structure, acrosome, anormality rate, and movement form The physiological parameters of semen include sperm motility, sperm unusual rate In order to thrawing frozen semen, it is suggested that semen should be warmed up in water at 37◦ C for 50 seconds; then formol citrate solution 2.9% (or formol Salina) is used to fixe specimen in 5-7 minutes Acro -stain is use to make the slice to see sperm acrosome morphology 130 ... cách bố trí thí nghiệm nghiên cứu cấu tạo, hoạt động tinh trùng đánh giá số tiêu sinh lí tinh dịch nhằm nâng cao hiệu dạy học nội dung Sinh lí sinh sản, học phần Sinh lí người Động vật 2.1 Nội dung. .. cấu tạo, hoạt động tinh trùng Tinh nguyên vật liệu thí nghiệm tốt cho quan sát cấu tạo, hoạt động tinh trùng Tuy nhiên, lúc có tinh nguyên để phục vụ cho thực hành Khi khơng có tinh ngun sử dung. .. sinh dục 5mm/phút; tinh trùng bò, dê: mm/phút tinh trùng thỏ, chó: mm/phút 126 Bố trí thí nghiệm quan sát cấu tạo, hoạt động tinh trùng đánh giá số Sự vận động tinh trùng gắn liền với hoạt động