Trong bài báo này thông báo các kết quả nghiên cứu chế tạo điện cực đĩa than thủy tinh (GC)được biến tính với L-cys và vàng nano (Au-nano) để xác định UA trong các mẫu nƣớc tiểu và huyết thanh bằng phương pháp vonampe hòa tan.
Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học - Tập 19, Số 3/2014 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN ĐIỆN CỰC ĐĨA THAN THỦY TINH ĐƢỢC BIẾN TÍNH VỚI L–CYSTEIN VÀ VÀNGNANO CHO PHƢƠNG PHÁP VON–AMPE HÒA TAN ANOT XUNG VI PHÂNXÁC ĐỊNH AXIT URIC Đến tòa soạn 21 - – 2014 Nguyễn Hải Phong, Lê Thị Lành, Hoàng Thị Lệ Hiền, Trần Thị Phƣơng Diệp, Nguyễn Văn Hợp Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Trần Thị Tố Loan Trường Trung học Phổ thông số - Bố Trạch, Tỉnh Quảng Bình SUMMARY STUDY ON DEVELOMENT OF GLASSY CARBON DISK ELECTRODE MODIFIED WITH L–CYSTEIN AND NANOPARTICLES–GOLD FOR DIFFERENTIAL PULSE ANODIC STRIPPING VOLTAMMETRIC DETERMINATION OF URIC ACID A new gold nanoparticles-modified electrode was fabricated by self-assembling gold nanoparticles to the surface of the L-cysteine-modified glassy carbon electrode (GC/L-cys/Au-nano) The modified electrode showed an excellent characteristicsfor differential pulse anodic stripping voltammetric (DP-ASV) determination of uric acid (UA) in 0.1 mol L−1 phosphate buffer solution (PBS) (pH = 4.1) The anodic currents of UA on the modified electrode were 12-fold to that of the bare GC Kinetic parameters of the UA electrode process such as electron transfer coefficient ( ) and electron transfer rate constant (Ks) were calculated Influences of the factors such as pH, concentration of L-cysteine (L-cys), deposition potential (Edep) and time (tdep) on stripping current of UA were investigated The DP-ASV with the modified electrode gained high sensitivity (1.49 A/M), low detection limit (2.7 M at Edep = +200 mV and tdep = 20 s) and good linerrange in the UA concentration of 2.0 –40M.The proposed method was successfully applied for the detection of UA in human urine and serum samples(without the samples treatment)with satisfactory results: good accuracy with recovery of 108 – 126% and good repeatability with relative standard deviation (RSD) of 1.2 – 2.7% (n = 3) Keywords: Uric acid, DP-ASV, Gold nanoparticles, L-cysteine 51 MỞ ĐẦU Axit uric (2, 6, 8,-trihydroxypurine, UA) sản phẩm cuối sản phẩm q trình chuyển hóa purin thể ngƣời Đối với ngƣời khỏe mạnh, nồng độ bình thƣờng UA 0,24–0,52 mM huyết 1,4 – 4,4 mM nƣớc tiểu Sự thay đổi bất thƣờng UA huyết nƣớc tiểu dẫn đến số bệnh nhƣ bệnh gút, viêm phổi, suy thận, bệnh tim mạch hội chứng Lesch - Nyhan [1], [2], [3] Chính vậy, việc xác định hàm lƣợng UA mẫu sinh học nhƣ nƣớc tiểu huyết cung cấp thông tin quan trọng bệnh liên quan đến UA[4] Trong nhiều năm qua, để xác định UA, ngƣời ta sử dụng nhiều phƣơng pháp khác nhƣ: phƣơng pháp phân tích trắc quang, sắc ký lỏng, enzyme, điện hóa,… Phƣơng pháp trắc quang bị ảnh hƣởng mạnh axit ascorbic[2]; Phƣơng pháp enzimecó độ chọn lọc cao, đắt tiền Phƣơng pháp phân tích điện hóa đạt đƣợc độ chọn lọc tốt, chi phí phân tích rẻ tốn thời gian nên đƣợc quan tâm nhiều [5].Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu phát triển điện cực biến tính với kim loại kích thƣớc nano để xác định thành cơng UA mẫu sinh học nhƣ vàng nano[2], [6], đồng nano [7], paladi nano [8], bạc naono [9].Một hƣớng nghiên cứu khác phát triển điện cực làm việc đƣợc biến tính với chất vơ hữu kim loại kích thƣớc nano nhƣ ruteni oxit [10], holmi florua [11], bạc 52 hecxacyano ferat(III) [3],… Mặt khác, điện cực làm việc đƣợc biến tính với polyme hữu phƣơng pháp điện hóa đƣợc phát triển để xác định UA nhƣ biến tính điện cực than thủy tinh axit poly-4aminobutyric [12], biến tính điện cực vàng L-cysteine (L-cys)[14] Trong báo này, thông báo kết nghiên cứu chế tạo điện cực đĩa than thủy tinh (GC)đƣợc biến tính với L-cys vàng nano (Au-nano) để xác định UA mẫu nƣớc tiểu huyết phƣơng pháp vonampe hòa tan THỰC NGHỆM 2.1 Thiết bị hóa chất - Máy phân tích điện hóa 693 VA Proccessor kèm hệ điện cực 694 VAStand máy 797 VA Computracecủa hãng Metrohm, Thụy Sĩ Hệ điện cực gồm: điện cực làm việc điện cực GC có đƣờng kính 2,8 0,1 mm; điện cực so sánh bạc – bạc clorua (KCl M) điện cực đối Pt; - Máy cất nƣớc hai lần Aquatron hãng Bibby Sterilin, Anh - Máy đo pH ký hiệu pH55 hãng Martini, Rumani - Dung dịch đệm photphat (PBS) đƣợc pha từ KH2PO4 K2HPO4tinh khiết Kanto, Nhật Bản - Dung dịch L–cystein đƣợc pha từ L– cystein Merck, Đức - Dung dịch chuẩn axit uric đƣợc pha hàng ngày từ hóa chất tinh khiết Merck, Đức đƣợc bảo quản –4oC - Nƣớc để pha hóa chất nƣớc cất lần 2.2.Chuẩn bị điện cực làm việc Điện cực GC đƣợc mài với bột Al2O3 kích thƣớc 0,05 m đến bóng tia rửa nƣớc sạch; Tiếp theo, ngâm diện cực GC dung dịch KOH M 10 phút; Rửa nƣớc ngâm rửa bể siêu âm chứa dung dịch H2SO4 M 15 phút Lấy điên cực tia rửa nƣớc Sau làm cách quét vonampe vòng (CV) từ mV đến 1000 mV dung dịch PBS 0,5 M, pH = 7,0 với tốc độ quét (v) 100 mV/s Sau lấy điện cực tia rửa bằngnƣớc Tiến hành biến tính điện cực GC cách phủ màng L-cys lên bề mặt điện cực cách quét von-ampe vòng (CV) khoảng từ –1500 mV đến +2500 mV dung dịch chứa PBS 0,1 M, pH = 7,0 L-cys 1,0.10-3 M với v = 100 mV/s (quét 20 vòng); Lấy điện cực ra, tia rửa nƣớc sạch, ngâm điện cực dung dịch vàng nano 12 40C Dung dịch vàng nano có kích thƣớc hạt vàng từ đến 15 nm đƣợc tác giả [15] tạo cách sử dụng chitosan chitosanoligosacarit làm chất khử chất ổn định Lấy điện cực tia rửa nƣớc Lúc bề mặt điện cực GC đƣợc phủ lớp L-cys vàng nano.Đây điện cực làm việc cho nghiên cứu Sau lần làm việc điện cực đƣợc bảo quản PBS 0,1 M (pH = 7,0) 2.3 Tiến trình phân tích UA Tiến hành xác định UA theo phƣơng pháp von-ampe hòa tan anot xung vi phân (DP-ASV), điện cực làm việc điện cực chế tạo nhƣ mục 2.2.Tiến trình phân tích nhƣ sau: mẫu nƣớc tiểu mẫu huyết đƣợc đƣa vào bình điện phân với điện cực chứa PBS 0,1 M, pH = 4,1.Tiến hành làm giàu UA lên bề mặt điện cực làm việc điện phân làm giàu (Edep) +200mV thời gian điện phân làm giàu (tdep) 20 s, dung dịch đƣợc khuấy với tốc độ khơng đổi 2000 vịng/phút; Sau làm giàu ngừng quay điện cực nghỉ 10 s (t rest) Tiếp theo ghi đƣờng von-ampe hòa tan kỹ thuật von-ampe xung vi phân: Quét anot (Erange) từ +200 mV đến +800 mV, biên độ xung (E) 80 mV, thời gian sống xung (tpulse) 40 ms, bƣớc (Ustep) mV thời gian bƣớc (tstep) 0,3 s (tốc độ quét v = 20mV/s).Đƣờng von-ampe hịa tan có dạng đỉnh Định lƣợng UA phƣơng pháp thêm chuẩn với – lần thêm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc tính điện hóa UA điện cực làm việc Khảo sát đặc tính điện hóa UA loại điện cực làm việc: i) điện cực GC; ii) điện cực GC đƣợc biến tính với vàng nano (đƣợc ký hiệu làGC/Aunano); iii) điện cực GC đƣợc biến tính với L-cys vàng nano (đƣợc ký hiệu làGC/L-cys/Au-nano) phƣơng pháp DP-ASV phƣơng pháp CV, nhƣng trƣớc quét CV tiến hành làm giàu UA lên bề mặt điện cực làm việc Edep = +200 mV tdep = 60 s Kết khảo sát đƣờng CV khoảng từ –200 mV đến +800 mV 53 với v = 100 mV/s cho thấy, kiểu điện cực, xuất đỉnh anot (hay đỉnh oxy hóa UA), khơng xuất đỉnh catot Có thể cho q trình điện hóa UA bề mặt điện cực làm việc trình bất thuận nghịch Kết hình cho thấy: điện cƣc GC/Au-nano cho cƣờng độ dòng đỉnh Ip UA với nCVtrong khoảng từ 20 đến 60 vòng giảm dần Giá trị nCVbằng20 vịngđƣợc lựa chọn để biến tính điện cực GC với L-cys hòa tan (Ip) nhỏ độ lặp lại Ip với độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD)là 5,6% (n = 4); So với điện cực GC khơng biến tính, điện cực GC/Lcys/Au-nano có Iplớn gấp 12 lần Ip có độ lặp lại tốt với RSD 2,8% (n =4) Nhƣ xác định UA phƣơng pháp DP-ASV sử dụng điện cực GC/L-cys/Au-nano không đáng kể, nhƣng pH lớn 4,8 Ip giảm mạnh Giá trị pH =3,0–5,0 thích hợp; pH =4,1 đƣợc chọn cho thí nghiệm sau Về lý thuyết, giá trị đỉnh hòa tan (Ep) pH dung dịch có quan hệ theo phƣơng trình Nernst nhƣ sau [11], [14]: 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ L-cys số vòng qu t CV để tạo màng L-cys Ip UA phụ thuộc vào nồng độ L-cys số vòng quétCV (nCV) để tạo màng L-cys bề mặt điện cực GC [14], [16] Kết khảo sát khoảng nồng độ L-cys 0,5 mM –8,0 mM cho thấy, nồng độ L-cysthích hợp 1,0.10–3 mM Ở nồng độ đó, Iptrung bình (Ip, TB) UA sau phép đo lặp lại 23,5 A với RSD 2,3% 54 3.3 Ảnh hƣởng pH Trong dung dịch PBS 0,1 M (pH = 2,2), Ip UA lớn nhất, nhƣng độ lặp lại với RSD 18,6% (n = 4) (hình 2) Trong khoảng pH = 3,2 – 4,8, Ip thay đổi Ep = E0’– 0,0591 p n p (1) Trong đó, n p số điện tử số proton trao đổi UA, Eo’ oxy hóa khử tiêu chuẩn điều kiện cặp oxy hóa khử UA Nhƣ vậy, từ hệ số góc phƣơng trình nêu hình (chấp nhận n = [9], [11], [14]) phƣơng trình (1) dễ dàng suy số proton trao đổi UA điện cực GC/L-cys/Au-naono Điều phù hợp với kết đƣợc thông báo [16] Ep = (0,860 ± 0,053) + (-0,068 ± 0,009) pH; 0,800 r = 0,9920 C) 30 0,700 40 A E p (V) A 0,2 A 500 700 Ip (A) Ep (V) 0,500 0,400 20 15 10 0,300 A) 400 25 0,600 B) 35 I p (A) I / A 0,200 10 pH 600 800 U / mV Hình 1.Các đường DP-ASV UA 30 M PBS 0,1 M (pH = 4,1) loại điện cực: A) GC/Au-nano;B) GC C) GC/Lcys/Au-nano ĐKTN: mục 2.3 (thay mẫu thật dung dịch UA) Hình 2.Sự phụ thuộc Ep Ip(n = 4) UA vào pH PBS 0,1 M điện cực GC/L-cys/Au-nano(điều chỉnh pH dung dịch NaOH 0,1 M) ĐKTN: CUA = 30 M, ĐKTN khác hình 3.4 Ảnh hƣởng tốc độ quét Giữa Ip bậc hai tốc độ quét (v1/2) có tƣơng quan tuyến tính tốt với r = 0,9993 khoảng v= 20–120 mV/s (hình 3)theo phƣơng trình Ip = (–3,67 1,35) + (3,33 0,16) v1/2 (2) Mặt khác, Ep ln(v)cũng có tƣơng quan tuyến tính tốt với r = 0,9814 theo phƣơng trình Ep= (0,587±0,020) +(0,020±0,005)ln(v) (3) Theo Laviron E [17], hệ bất thuận nghịch, Ep ln(v) có tƣơng quan tuyến tính với hệ số góc RT/(1 – α)nF nhƣ phƣơng trình UA trao đổi (n = 2), suy hệ số chuyển điện tử () 0,358 Cũng thấy rằng, Ep v có tƣơng quan tuyến tính tốt (r = 0,9806) theo phƣơng trình Ep = (0,643 ± 0,007) + (0,0004 ± 0,0001)v (5) Theo Yang S [18], giá trị Eo phƣơng trình (4) đoạn cắt trục tung phƣơng trình (5) 0,643 V So sánh (3) (4), suy ra: Ep =E 120 mV/s 100 mV/s 80 mV/s 60 mV/s RT RTKs RT ln (1-α)nF + (1-α)nF lnv (1-α)nF (4) Trong đó, E oxy hóa khử tiêu chuẩn cặp oxy hóa khử liên hợp, R = 8,314 J/molK, T = 298K (25 oC), F = 96500 C.mol-1, n số điện tử trao đổi hệ số chuyển điện tử Từ (3) (4), có RT/(1 – α)nF = 0,020 Nhƣ đề cập trên, số điện tử mà phân tử 40 mV/s 20 mV/s o Hình Các đường DP-ASV UA tốc độ quét từ 20 – 120 mV/s ĐKTN hình 2; pH = 4,1 0,587= 0,643 RT RTKs ln (1-α)nF (1-α)nF (6) 55 Trong đó, Ks số tốc độ chuyển điện tử Từ phƣơng trình (6) với giá trị R, T, F, n và biết, tính đƣợc Ks = 861 s-1 3.5 Ảnh hƣởng yếu tố khác Thếvàthờigianđiệnphânlàm giàu (Edep tdep): Ip UA tăng tăng Edep= –800 – +200mV, sau giảm dần từ +200 đến +800 mV.Mặt khác, Ip UA tăng tuyến tính với tdep khoảng tdep từ đến 20 s (r = 0,9983) sau hầu nhƣ khơng thay đổi Edep = +200 mV tdep = 20 s thích hợp Biên độ xung (E) tốc độ quay điên cực (): Ip UA tăng tuyến tính với E = 10– 100 mV (r = 0,9991).Mặt khác, Ip UA thay đổi không nhiều = 400– 3000 vòng/phút Giá trị E đƣợc chọn tƣơng ứng 80 mV 2000 vòng/phút 3.6 Độ tin cậy phƣơng pháp DP-ASV 3.6.1 Độ lặp lại dòng đỉnh hòa tan Độ lặp lại Ipđƣợc đánh giá qua RSD Ip nồng độ khác UA Kết bảng cho thấy,đối với nồng độ, Ip UA đạt đƣợc độ lặp lại tốt với RSD nhỏ 4% (n = 9) 3.6.2 Khoảng tuyến tính, độ nhạy giới hạn phát Kết từ thí nghiệm song song cho thấy, Ip nồng độ UA có tƣơng quan tuyến tính tốt khoảng nồng độ từ 2,0 đến 40 M (r = 0,9983) 56 với độ nhạy 1,49 0,10 A/M giới hạn phát 2,7 0,3 M 3.7 Áp dụng thực tế Phƣơng pháp DP-ASV dùng điện cực GC/L-Cys/Au-nano đƣợc áp dụng để xác định trực tiếp UA (tức không qua giai đoạn xử lý mẫu) 03 mẫu nƣớc tiểu 03 mẫu huyết (thu đƣợc cách ly tâm mẫu máu) đƣợc lấy ngẫu nhiên từ3 ngƣời có sức khỏe bình thƣờng Thành phố Huế Định lƣợng UA phƣơng pháp thêm chuẩn Kết bảng hình cho thấy: - Phƣơng pháp đạt đƣợc độ tốt với độ thu hồi (Rev) dao động khoảng 108% đến 126% độ lặp lại tốt với RSD nhỏ 2,7% (n = 3) - Nồng độ UA mẫu nƣớc tiểu huyết mức bình thƣờng Riêng nồng độ UA 01 mẫu (mẫu HT1) mức cảnh báo [1], [2], [3] Bảng Các giá trị Ip,TB RSD nồng độ UA khác Thông số Nồng độ UA (μM) 20 40 Ip, TB (n = 9) 4,97 19,0 40,9 RSDTN (%) 3,6 2,1 0,9 ĐKTN: PBS 0,1 M (pH = 4,1); phƣơng pháp DP-ASV dùng GC/L-Cys/Aunano; Edep = +200 mV; tdep = 20 s; E = 80 mV; = 2000 vòng/phút; v = 20 mV/s 18 M 18 M 12 M M (A) 12 M (B) M Mẫu Mẫu Hình Các đường DP-ASV mẫu thực tế lần thêm chuẩn (mỗi lần thêm M UA): (A) –mẫu nước tiểu (NT1); (B)–mẫu huyết (HT1) ĐKTN: bảng Bảng Kết xác định nồng độ UA mẫu nước tiểu(NT) mẫu huyết (HT) (n = 3) Mẫu Nồng độUA mẫu (mM)(a) Nồng độ UA thêm vào mẫu (mM) Nồng độ UA tìm thấy (mM) Rev (%) RSD (%) NT1 1,51 ± 0,07 1,20 2,81 108 1,9 NT2 2,43 ± 0,08 1,20 3,94 126 2,7 NT3 2,96±0,06 1,20 4,31 113 2,0 HT1 0,61 ±0,02 0,60 1,34 121 2,4 HT2 0,40±0,03 0,60 1,11 119 1,2 HT3 0,51±0,02 0,60 1,22 118,0 2,03 (a) : Các giá trị cột giá trị trung bình độ lêch chuẩn (n = 3).ĐKTN: bảng KẾT LUẬN Điện cực GC/L-Cys/Au-nano dùng cho phƣơng pháp DP-ASV để xác định nhạy trực tiếp UA nƣớc tiểu huyết mà không cần phân hủy mẫu trƣớc phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế, Các xét nghiệm thƣờng quy áp dụng thực hành lâm sàng,Nhà XB Y học, Hà Nội (2012) Kannan P., John S A., Analytical Biochemistry, Vol 386, pp 65– 72(2009) Noroozifar M., Motlagh M.K., Taheri A., Talanta, Vol 80, pp 1657– 1664(2010) Wang M Y., Xu X Y., Yang , Zhang S Y., Yang X J., Journal of Applied Electrochemistry, Vol 38, pp 1269 – 1274(2008) Tang H., Hu G., Jiang S.,Liu X., Journal of Applied Electrochemistry, Vol 39 pp 2323 - 2328(2009) Wang C., Yuan R., Chai Y., Chen (xem tiếp tr.85) 57 ... nhƣ biến tính điện cực than thủy tinh axit poly-4aminobutyric [12], biến tính điện cực vàng L-cysteine (L-cys)[14] Trong báo này, thông báo kết nghiên cứu chế tạo điện cực đĩa than thủy tinh. .. chuẩn với – lần thêm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc tính điện hóa UA điện cực làm vi? ??c Khảo sát đặc tính điện hóa UA loại điện cực làm vi? ??c: i) điện cực GC; ii) điện cực GC đƣợc biến tính với vàng nano. .. thƣớc nano để xác định thành công UA mẫu sinh học nhƣ vàng nano[ 2], [6], đồng nano [7], paladi nano [8], bạc naono [9].Một hƣớng nghiên cứu khác phát triển điện cực làm vi? ??c đƣợc biến tính với