Nghiên cứu và thu nhận enzym protease từ các chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Trần Thị Nhã Uyên NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG NẤM SỢI Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN THANH THỦY TP Hồ Chí Minh , tháng – năm 2010 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Enzyme chất xúc tác sinh học khơng có ý nghĩa cho trình sinh trưởng, sinh sản sinh vật mà cịn có vai trị lớn cơng nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kĩ thuật phân tích, cơng nghệ gen bảo vệ mơi trường Do có khả ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực mà ngành công nghiệp enzyme đem lại lợi nhuận to lớn cho nhiều nước Ở Việt Nam, ngành công nghệ enzyme chưa thật phát triển Mỗi năm, nước ta phải nhập ngoại lượng lớn enzyme để ứng dụng vào sản xuất công, nông nghiệp, giải ô nhiễm MT… Trong loại enzyme, protease enzyme sử dụng nhiều Năm 1995, tổng doanh thu từ enzyme nước châu Âu lên đến 187,2 triệu USD, cao loại enzyme Protease ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp…Nguồn protease chủ yếu thu từ VSV, đặc biệt chủng NS thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Mucor Việc nghiên cứu phân lập chủng NS tự nhiên để thu nguồn protease có giá trị vấn đề khoa học quan tâm nghiên cứu Để thu nguồn protease có giá trị cần phải phân lập chủng có tự nhiên Một hướng nghiên cứu mà khoa học quan tâm tìm chủng VSV có đặc tính ưu việt từ RNM Chính điều kiện sống khắc nghiệt RNM tạo nhiều hội tìm thấy nguồn gen VSV q hiếm, có NS sinh protease Ở nước ta, RNM Cần Giờ nơi HST phong phú, đa dạng Tuy nhiên, nghiên cứu đa dạng sinh thái RNM Cần Giờ chủ yếu tiến hành hệ động thực vật VSV, NS đối tượng phân bố rộng rãi có giá trị kinh tế quan tâm nghiên cứu thời gian gần NS RNM Cần Giờ có nhiều đặc tính quí báu khả chịu đựng điều kiện sống khắc nghiệt, khả sinh nhiều enzyme ngoại bào, có protease Do RNM Cần Giờ có thảm TV dày đặc, xác động thực vật bị phân hủy tạo thành nguồn chất cho chủng NS sinh enzyme ngoại bào Cho đến nay, cơng trình nghiên cứu NS RNM Cần Giờ cịn thưa thớt, chưa có cơng trình nghiên cứu khả sinh protease chủng NS Chính lí mà tơi chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ chủng NS RNM Cần Giờ” Đối tượng phạm vi nghiên cứu: chủng NS phân lập xã Long Hịa, Lí Nhơn, Tam Thơn Hiệp, An Thới Đơng, Bình Khánh RNM Cần Giờ Địa điểm nghiên cứu: PTN Vi sinh-Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh Mục tiêu đề tài: Tìm số chủng NS có khả sinh protease mạnh từ RNM Cần Giờ nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease Nhiệm vụ đề tài:  Phân lập chủng NS từ RNM Cần Giờ  Tuyển chọn chủng NS có khả sinh protease cao  Nghiên cứu đặc điểm hình thái số đặc tính sinh học chủng NS tuyển chọn  Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện MT đến ST hoạt độ protease chủng NS tuyển chọn, từ tìm MT tối ưu để ni cấy NS thu protease  Thu nhận chế phẩm enzyme bán tinh khiết CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RNM Cần Giờ 1.1.1 Đặc điểm RNM Cần Giờ 1.1.1.1 Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên Về vị trí địa lý: RNM Cần Giờ có tọa độ 10°22’ – 10°40’ vĩ độ Bắc 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đơng Tổng diện tích khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ 75.740 ha, vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 vùng chuyển tiếp 29.880 [43] Hình 1.1 RNM Cần Giờ [43] Nằm cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 70km, RNM Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai phía Bắc, giáp biển Đơng phía Nam, giáp tỉnh Tiền Giang Long An phía Tây, giáp tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu phía Đơng [43] RNM Cần Giờ phát triển đất đầm mặn mới, phù sa sông mang đến lắng đọng tạo thành đất Đất tạo tổng hợp q trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn hóa nhiễm mặn Cho đến lớp đất sâu chưa kết chặt nên khơng có khả tạo thành đất rắn chắc, hàm lượng lưu huỳnh dạng khử cao với lượng muối cao khơng có lợi cho nơng nghiệp[17] Địa hình: huyện Cần Giờ có địa hình thấp trũng, khơng phẳng, phân cắt mạng lưới sơng ngịi uốn khúc Nhìn chung, địa hình huyện Cần Giờ có dạng: dạng cao 2- 10 m, dạng ngập vào tháng có nước lớn (tháng 11, 12) năm dạng lại ngập triều mức độ khác [9] Cần Giờ nằm vùng khí hậu nhiệt đới xích đạo, hướng gió Tây Nam, mùa mưa bắt đầu muộn kết thúc sớm so với địa phương khác vùng (từ tháng đến tháng 10), mùa khô từ tháng 11 đến tháng năm sau [30] Nhiệt độ trung bình khoảng 250C - 290C, nhiệt độ thấp 18,8oC, cao 35oC Biên độ dao động nhiệt ngày từ 5-7oC [30] Độ ẩm trung bình từ 73% đến 85% Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 – 1.402 mm [66] Độ mặn dao động từ 1,8%-3% [2] Độ mặn thay đổi tùy theo mùa Vào mùa khơ có độ mặn cao vào mùa mưa Độ mặn có ảnh hưởng lớn đến phân bố khu hệ SV RNM nói chung NS nói riêng Chế độ thủy triều: Cần Giờ chịu tác động chế độ bán nhật triều không biển Đông Mỗi tháng có khoảng ngày nhật triều khơng xuất 2-3 ngày trước, cuối tháng âm lịch Biên độ triều tương đối lớn từ 3- 4m Thời gian có biên độ triều lớn từ tháng 6- Mực nước trung bình cao thường xuất vào tháng 10, 11 thấp vào tháng 6, [9] Đất đai: toàn huyện Cần Giờ thuộc loại đất phèn mặn gồm hai loại: đất phèn mặn theo mùa đất phèn mặn thường xuyên Đất phèn mặn theo mùa nằm phía Bắc huyện Cần Giờ Đất thịt, giàu mùn, chứa nhiều xác hữu môi truờng yếm khí, chất dinh dưỡng khá, phản ứng đất từ chua đến chua, pH độ sâu tầng sinh phèn xuống tới 2,4-2,7 Tuy nhiên vào mùa lũ, mặn đẩy xa, nước pha loãng thời gian dài 4-5 tháng Đất phèn mặn thường xuyên chiếm phần lớn diện tích Cần Giờ Đất thịt trung bình, nhiều mùn nhão lẫn xác hữu bán phân giải, bị ngập triều thường ngày, giàu dinh dưỡng, độ pH từ 5,8-6,5 [66] 1.1.1.2 Khu hệ SV RNM Cần Giờ RNM Cần Giờ HST trung gian HST thủy vực với HST cạn, HST nước HST nước mặn Rừng Cần Giờ nhận lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, với ảnh hưởng biển kế cận đợt thủy triều nhờ hệ TV nơi phong phú với 150 loài trở thành nguồn cung cấp thức ăn, nơi trú ngụ cho nhiều loài thủy sinh, cá với ĐV có xương sống khác Hệ ĐV đa dạng gồm khu hệ chim có khoảng 120 lồi, ĐV thủy sinh khơng xương sống với 700 loài, khu hệ cá 130 loài, khu hệ ĐV có xương sống có lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, lồi có vú [44] Chính hệ động thực vật đa dạng RNM Cần Giờ trở thành nguồn thức ăn phong phú cho VSV bao gồm nấm men, NS, VK xạ khuẩn Nhờ vào khả tiết enzyme ngoại bào amylase, protease, kitinase, cellulase,…chúng phân hủy tinh bột protein, kitin,… có xác động thực vật giáp xác làm nguồn thức ăn Và thân xác động thực vật bị phân hủy trở thành nguồn mùn lượng thức ăn dồi cho hệ TV SV phù du Trung tâm MERD nghiên cứu khu hệ VSV RNM thuộc tỉnh Nam Định Thái Bình (2001) Kết phân lập 69 chủng nấm men, 55 chủng xạ khuẩn Nhiều chủng có hoạt tính enzyme ngoại bào cao, có khả sinh KS phân giải dầu mạnh [13] Riêng RNM Cần Giờ chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu nấm men xạ khuẩn Qua phân tích mẫu đất RNM Cần Giờ, nhà khoa học phát có vi khuẩn Bacillus thuringiensis sinh nhiều tinh thể hình cầu có tác dụng tiêu diệt ấu trùng muỗi cao Kết thí nghiệm nhóm nghiên cứu Mai Thị Hằng Trần Thị Mỹ Hạnh cho thấy chủng VSV có khả diệt loại ấu trùng muỗi từ 60-100% sau 36 giờ, có chủng diệt 100% ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi [61] NS RNM chiếm số lượng lớn, phong phú đa dạng Khi cịn có số lồi nấm sống đó, số chui sâu vào biểu bì, số sống mặt Khi rụng xuống, sau 24 ngập nước triều đầu tiên, bị VSV phân hủy, lúc đầu chi Phytophora thuộc lớp Nấm tảo, đến Fusarium Penicillium thuộc lớp Nấm bất toàn Sau tuần thứ thứ 3, nấm tảo nhường chỗ cho loài VSV khác Tất mô xốp phân huỷ nhanh nhất, hợp chất cellulose lignin bị phân hủy cuối Trong trình phân hủy, lượng đạm mẩu tăng – lần so với ban đầu (Kaushik Hynes, 1971) Khi phân tích, so sánh loại acid amin có tươi phân huỷ, Casagrade (1970) thấy tăng tổng số acid amin bề mặt thành phần phân hủy cao hẳn tươi Một số acid amin α – aminobyturic, α, γ diaminnobutyric α, ε diamino pimonic loại acid citruline, ortrithine, cystein sản phẩm tạo trình trao đổi chất VSV [51] Các nghiên cứu VSV RNM ven biển đồng sông Hồng Cần Giờ (2001-2003) chứng minh điều: hệ sinh thái RNM có tới 83/199 chủng nấm có khả phân giải dầu mỏ mức độ khác Nghiên cứu RNM Nam Định Thái Bình trung tâm MERD phân lập 605 chủng NS [13] Ở RNM Cần Giờ, tác giả Khưu Phương Yến Anh phân lập 312 chủng NS, bao gồm loài nấm thuộc chi Penicillum, Aspergilus, Mucor, Tricoderma (2007) [1] Tác giả Võ Thị Bích Viên phân lập 476 chủng NS có 266 chủng thuộc chi Aspergillus Penicillium (2009) [32] 1.1.2 Vai trò RNM Cần Giờ RNM Cần Giờ mệnh danh "lá phổi xanh" TP.HCM với vai trò quan trọng điều hịa khí hậu Nhờ đặc trưng riêng tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt RNM đánh giá “bức tường xanh” vững chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm MT ven biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm, tích lũy cacbon, giảm khí CO2, [51] RNM có vai trị vấn đề giảm nhiễm từ chất thải rắn Trong năm qua, Trung tâm nghiên cứu hệ sinh thái RNM phát nhiều VSV có khả phân giải chất thải khó phân hủy có nước, làm nước biến thành thức ăn cho tơm cá Nhờ phát thêm khả ngăn ngừa ô nhiễm môi trường RNM Khi có rừng, tán rừng nhiệt độ thấp, rụng tạo thành mùn, vi sinh vật hoạt động tốt, trình phân giải chất hữu diễn hiệu Nhưng rừng ánh nắng chiếu thẳng vào, nhiệt độ tăng cao thiếu nước vào mùa khô, làm cho đất phèn tiềm tàng trước ém hoạt động trở lại, làm cho đất chua, nhiều acid [53] Bên cạnh đó, chất thải rắn sinh hoạt, y tế, cơng nghiệp, nơng nghiệp với hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông RNM giữ lại nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ SV làm nước biển [51] RNM Cần Giờ có vai trị định kinh tế Theo Giáo sư Phan Nguyên Hồng, người dân Việt Nam biết tận dụng phần nhỏ lợi ích từ RNM mang lại Nếu biết cách khai thác hợp lý đôi với bảo vệ rừng, thực nguồn tài nguyên quốc gia có [54] 1.2 Đặc điểm NS sinh protease 1.2.1 Đặc điểm hình thái NS VSV nhân thực, tế bào khơng có diệp lục tố, sống dị dưỡng, vách tế bào cấu tạo chủ yếu kitin, có hay khơng có cellulose số thành phần khác có hàm lượng thấp [55] Sợi nấm có ngăn vách (đa bào) hay khơng có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác tùy lồi Đường kính sợi nấm thường từ 35µm, có đến 10µm chí đến 1mm Chiều dài sợi nấm tới vài chục cm Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng Các sợi nấm phân nhánh nhánh lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì bơng Trên MT đặc số chất tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm đoạn sợi nấm phát triển thành hệ sợi nấm có hình dạng định gọi KL nấm [55] Hình 1.2 Sợi nấm có vách ngăn [55] Hình 1.3 Sợi nấm khơng có vách ngăn [55] Hệ sợi NS số ăn sâu vào chất gọi khuẩn ty chất hay khuẩn ty dinh dưỡng, số mọc bề mặt chất gọi khuẩn ty khí sinh Những khuẩn ty khí sinh lơng tơ màu trắng, mọc thành lớp sợi mềm có số sợi phát triển thành quan sinh sản đặc biệt mang bào tử Màu sắc bào tử đặc trưng cho màu sắc NS già [23] 1.2.2 Cấu tạo tế bào NS  Thành tế bào NS Thành tế bào NS có cấu tạo mỏng cấu tạo sợi [7] Thành tế bào NS dày khoảng μm, chắn [7] Thành sợi nấm gồm nhiều mỏng chồng chất lên nhờ mà vững chịu sức ép chất lỏng rắn bên mà không bị rách hay nứt vỡ [7] Mỗi mỏng gồm có phần khơng có cấu tạo đặc biệt, phần có sợi nhỏ xếp sát vào song song Điều đặc biệt sợi mỏng song song với sợi hai mỏng liên tiếp lại xếp chéo nhau, làm cho vách sợi nấm mỏng vững [7] Về thành phần hóa học, hợp chất hóa học có chủ yếu vách sợi nấm phân tử có dạng sợi Thảnh phần quan trọng vách sợi nấm kitin Một hợp chất gluxit khác phổ biến nhiều NS glucan Có thể coi kitin glucan khung vách sợi nấm [7] Vách sợi nấm khơng che chở bảo vệ, mà cịn đảm đương loạt chức khác: nhận thức ăn, chế biến thức ăn, thải chất bã, trao đổi khí,… Để hồn thành nhiệm vụ đó, ngồi kitin, glucan, cịn có hàng rào lipit, protit loạt enzyme Ngay vách sợi nấm cịn có sản phẩm trao đổi chất khác sợi nấm, chất thải acid oxalit, acid xitric, chất độc hại VSV khác xung quanh KS, độc tố Mặt vách sợi vi nấm cịn có phủ chất dính, chất dính sẵn sàng dính chặt vào amip, giun trịn bé tẹo, sau vi nấm ăn thịt mồi cách mọc sợi nấm đặc biệt xuyên qua vỏ mồi hút dần chất dinh dưỡng mồi [7]  Màng nguyên sinh, chất nguyên sinh Chất nguyên sinh dung dịch keo, thường suốt không màu, chuyển động từ phần sợi nấm già đến phần non, từ sợi nấm sinh dưỡng đến sợi nấm phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản [6] Chất nguyên sinh bao bọc màng nguyên sinh Màng dày trung bình 7.10-3 μm, cấu tạo chủ yếu phân tử lipit protein Thành phần lipit chiếm tới 40% protein chiếm 38% trọng lượng khô màng [6]  Các bào quan Mạng lưới nội chất Có dạng bọng đài nối liền với màng nhân tế bào Người ta tìm thấy mạng nội sinh chất có dạng mỏng đồng tâm dính vào màng chất nguyên sinh hay tự chất nguyên sinh dính vào máy Golgi [7] Bộ máy Golgi Bộ máy Golgi có dạng túi nhỏ gấp nếp với bọng nhỏ hình cầu xung quang thành túi Kiểu cấu tạo máy Golgi giống TV bậc cao[7] Ty thể Ty thể tế bào vi nấm tương tự ty thể TV ĐV Tuy nhiên, số lượng ty thể nấm hơn, ty thể dẹt gồ ghề TV [7] Không bào thể ẩn nhập Khơng bào thường có hình cầu, hình trứng Ở sợi nấm khơng có không bào, xa phần ngọn, số lượng không bào giảm kích thước lớn, ép chặt chất nguyên sinh nhân tế bào vào sát thành tế bào Dịch không bào thay đổi tùy theo tuổi trạng thái sinh lý tế bào Dịch không bào chứa chất điện giải hòa tan: Na, K…một số chất hữu trạng thái hòa tan trạng thái keo (protein, glucid,….), sắc tố số vật thể ẩn nhập [7] Nhân tế bào NS Nhân tế bào NS nói chung có kích thước nhỏ, phần lớn có đường kính 2-3 μm, hình cầu hình trứng [6] Số lượng nhân tế bào khơng ổn định Ở sợi nấm ngăn vách số lượng nhân đoạn sợi nấm vách ngăn 1,2 nhiều Số lượng nhân tế bào thay đổi tùy điều kiện sống [7] Nhân tế bào NS nhân thực Nhân có vai trị chủ yếu mang thơng tin di truyền chứa ADN, điều khiển tổng hợp protein đặc trưng loài, điều khiển tổng hợp enzyme, hoạt động enzyme nhiều hoạt động khác tế bào [7] 1.2.3 Các hình thức sinh sản NS sinh sản hình thức: vơ tính hữu tính  Sinh sản vơ tính Hình thức sinh sản vơ tính đơn giản mẩu sợi: đoạn sợi nấm rơi vào chất gặp điều kiện thuận lợi phát triển thành hệ sợi nấm [23] Ngồi sinh sản vơ tính mẩu sợi, NS sinh sản bào tử (bào tử kín, bào tử trần) Đây hình thức sinh sản vơ tính phổ biến NS [23] Có hai dạng bào tử vơ tính bào tử kín bào tử trần [23]  Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính xảy có kết hợp hai giao tử đực có trải qua giai đoạn giảm phân Q trình sinh sản hữu tính trải qua giai đoạn: • Tiếp hợp tế bào chất với hòa hợp tế bào trần giao tử • Tiếp hợp nhân với hịa hợp nhân tế bào giao tử để tạo nhân nhị bội • Giảm phân: giai đoạn hình thành bào tử đơn bội qua giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội) [55] Hình 1.4 Bào tử kín [57] Hình 1.5 Bào tử trần Hình 1.6 Quá trình tiếp hợp [57] 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến ST hoạt độ protease NS 1.2.4.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến nồng độ chất hòa tan MT nuôi cấy, MT lên men hoạt động xúc tác phản ứng sinh hóa tế bào VSV, phản ứng xảy nhiệt độ định [18] Nhiệt độ tối thiểu cần cho phát triển NS từ 2oC đến 5oC, tối ưu từ 22oC đến 27oC nhiệt độ tối đa mà chúng chịu đựng 35oC đến 40oC, cá biệt có số lồi sống sót 0oC 60oC [55] Để thu protease từ NS, nhiệt độ nuôi cấy giữ 29-31oC khoảng thời gian 10-18 giờ, sau giảm nhiệt độ xuống 24 -25oC [21] Với nhiệt độ trung bình 25,8 oC, RNM Cần Giờ có điều kiện nhiệt độ thuận lợi cho phát triển NS 1.2.4.2 Độ ẩm hai chủng NS Hàm lượng đậu nành (%) 10 Hoạt độ protease (UI/ ml) Penicillium Paecilomyces Sai số paxalli lilacinus 0.850 0.028 1.229 1.783 0.015 1.857 2.173 0.012 1.954 0.023 1.922 2.191 1.434 0.005 1.232 1.356 0.021 1.129 Sai số 0.005 0.015 0.012 0.006 0.004 0.011 Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng hàm lượng ĐN đến hoạt độ protease hai chủng NS Từ kết cho thấy MT khơng có ĐN, hai chủng NS có khả tổng hợp protease hoạt độ yếu Hoạt độ protease tăng tỉ lệ thuận với tăng tỉ lệ bột ĐN giá trị cực đại bắt đầu giảm xuống Đối với chủng Penicillium paxalli hàm lượng ĐN 3-5% hoạt tính protease mạnh, cực đại 5% Chủng Paecilomyces lilacinus hoạt tính protease cao tỉ lệ ĐN 1-5%, cực đại 3% 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 3.3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến ST Cấy chủng NS vào MT1, nuôi điều kiện nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC Đo đường kính vịng ST sau ngày ni cấy Kết trình bày bảng 3.13 biểu đồ 3.8 Nhiệt độ tốt cho ST hai chủng NS 30oC Nhiều nghiên cứu chứng minh nhiệt độ thích hợp cho đa số NS 28-32oC[ 19] Ở 20oC 40oC, hai chủng NS ST yếu nhiệt độ thấp hay cao làm ảnh hưởng đến nồng độ chất hịa tan MT ni cấy phản ứng xúc tác tế bào NS, từ ức chế ST chúng Khoảng nhiệt độ thích hợp cho ST hai chủng NS 25oC-30oC Khoảng nhiệt độ phù hợp với nhiệt độ trung bình RNM 25,8oC Ở 40oC, hai chủng NS ST yếu, điều cho thấy khơng phải hai chủng ưa nhiệt chúng thích nghi với điều kiện nhiệt độ RNM Cần Giờ Bảng 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến ST hai chủng NS Nhiệt độ (oC) Khả sinh trưởng (mm) Penicillium paxalli Paecylomyces lilacinus 20 2.5 3.8 25 10.7 10.2 30 12.0 12.3 35 2.2 4.0 40 1.0 1.0 Nhiệt độ (oC) Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến ST hai chủng NS 3.3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease Để xác định nhiệt độ nuôi cấy cho hoạt độ protease cao nhất, tiến hành nuôi cấy chủng NS vào MT9, độ mặn 3%, hàm lượng bột ĐN 3% chủng Paecilomyces lilacinus, 5% Penicillium paxilli Khảo sát nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC Sau ngày, ly trích dịch enzyme thơ tiến hành xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson Kết thu trình bày bảng 3.14 minh họa đồ thị 3.3 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease hai chủng NS Hoạt độ protease (UI/ml) Nhiệt độ (oC) Penicillium paxalli Sai số Paecilomyces lilacinus Sai số 20 0.014 0.000 0.581 0.020 25 1.903 0.002 1.195 0.007 30 2.206 0.005 1.963 0.004 35 0.195 0.016 1.508 0.015 40 0.062 0.007 0.129 0.007 Nhiệt độ (oC) Nhiệt độ (oC) Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease hai chủng NS Từ kết cho thấy, hoạt độ protease hai chủng NS tăng nhanh từ 20oC đến 30oC, đạt cực đại 30oC giảm nhanh từ 30oC đến 40oC Khoảng nhiệt độ để hai chủng NS có hoạt độ protease cao 25-30oC, phù hợp với nhiệt độ thích hợp cho ST hai chủng NS Ở nhiệt độ thấp hay cao, khả sinh protease hai chủng NS giảm phản ứng sinh hóa tế bào bị ức chế Theo Nguyễn Đức Lượng, nhiệt độ MT thích hợp nuôi cấy NS thu protease khoảng từ 29oC-31oC [21] Như vậy, kết nghiên cứu cho thấy chủng NS ST tốt hoạt độ protease cao khoảng nhiệt độ từ 25oC -30oC, khoảng nhiệt độ trung bình RNM Cần Giờ Điều chứng tỏ chủng NS thích nghi với điều kiện nhiệt độ RNM Cần Giờ 3.3.4 Ảnh hưởng độ ẩm Chúng tiến hành nuôi cấy chủng NS vào MT9, độ mặn 3%, hàm lượng bột ĐN 3% chủng Paecilomyces lilacinus, 5% Penicillium paxilli Nuôi cấy 30oC Điều chỉnh giá trị độ ẩm khác nhau: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% Sau ba ngày nuôi cấy, thu dịch enzyme thô xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson Kêt thu bảng 3.15 minh họa đồ thị 3.4 Từ kết cho thấy tác động độ ẩm lên hoạt độ protease hai chủng NS khác Chủng Penicillium paxalli có hoạt độ protease cao khoảng độ ẩm dao động từ 50% đến 60%, cao ở 55% (2,337UI/ml) Ở độ ẩm 60-75%, hoạt độ protease chủng giảm Trong đó, chủng Paecilomyces lilacinus cho hoạt độ protease tốt khoảng độ ẩm từ 60%-65%, độ ẩm tối ưu 65% (2,053UI/ml) Ở điều kiện độ ẩm khác, chủng có hoạt độ protease Độ ẩm yếu tố ảnh hưởng lớn đến trình lên men bề mặt Khi độ ẩm thấp kéo dài thời gian ST từ kéo dài thời gian tạo enzyme NS Ngược lại, độ ẩm cao làm cho MT bị kết dính làm cho nấm sợi ST tạo enzyme yếu RNM Cần Giờ có độ ẩm trung bình tương đối cao, dao động từ 73%-85% Tuy nhiên, độ ẩm thay đổi phụ thuộc vào mùa địa điểm Vào mùa mưa độ ẩm cao mùa khô Mẫu thu vào giao điểm mùa khô mùa mưa (tháng 11), địa điểm tương đối khô ráo, nên độ ẩm thấp so với độ ẩm tương đối năm Do nói hai chủng NS nghiên cứu thích nghi với điều kiện sống RNM Bảng 3.15 Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ protease hai chủng NS Hoạt độ protease (UI/ml) Độ ẩm (%) Penicillium paxalli Sai số Paecilomyces lilacinus Sai số 50 2.039 0.005 0.463 0.000 55 2.337 0.005 1.676 0.001 60 2.255 0.019 1.937 0.008 65 1.424 0.001 2.053 0.014 70 1.420 0.005 1.095 0.007 75 1.325 0.027 0.957 0.010 Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ protease hai chủng NS 3.3.5 Ảnh hưởng pH 3.3.5.1 Ảnh hưởng pH đến ST pH ảnh hưởng lớn đến phát triển NS Mục đích thí nghiệm xác định điều kiện pH tối ưu cho ST hai chủng NS Dùng MT1 làm đối chứng (pH 6,5) Điều chỉnh NaOH 10% HCl 10% để tạo MT có pH 3,4,5,6,7, Kết thu trình bày bảng 3.16 biểu đồ 3.9 Bảng 3.16 Ảnh hưởng pH đến ST hai chủng NS Khả sinh trưởng (mm) pH Penicillium paxalli Paecilomyces lilacinus Đối chứng 10 12 2.5 3.0 10.0 12.7 13.2 15.0 9.3 14.7 8.8 12.3 5.0 10.2 Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng pH đến ST hai chủng NS Kết cho thấy pH acid (3-4) kiềm (pH=8) khơng thích hợp cho ST hai chủng NS Ở giá trị này, hai chủng NS sinh trưởng nhiều MT đối chứng (pH 6.5) Nhiều nghiên cứu xác định pH thấp cao khơng thích hợp cho ST đa số NS [6] Hai chủng NS ST tốt khoảng pH rộng dao động từ 4-7 Ở giá trị pH này, chúng ST không chênh lệch nhiều so với MT đối chứng pH tối ưu cho ST hai chủng NS Đặc biệt, chủng Paecilomyces lilacinus có mức ST tương đương khoảng pH từ 4-8 Kết phù hợp với nghiên cứu Ingold (1967) xác định pH tối ưu cho NS sinh trưởng dao động khoảng 5-6.5 Mặt khác chứng tỏ hai chủng NS thích hợp với mơi trường sống RNM Cần Giờ, pH trung bình dao động khoảng 5.8-6.5 [61] 3.3.5.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease Nuôi cấy chủng NS vào MT9, nhiệt độ 30oC, độ mặn 3% Hàm lượng ĐN 5%, độ ẩm 55% Penicillium paxalli; hàm lượng ĐN 3%, độ ẩm 65% Paecilomyces lilacinus Thay đổi pH MT từ 3-8 Kết thu trình bày bảng 3.17 đồ thị 3.5 Bảng 3.17 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease hai chủng NS Hoạt độ protease (UI/ml) pH Penicillium paxalli Sai số Paecilomyces lilacinus Sai số 0.305 0.022 0.192 0.009 1.423 0.003 2.026 0.043 2.377 0.011 2.101 0.018 2.250 0.003 1.986 0.020 2.250 0.005 1.941 0.006 0.151 0.023 1.703 0.007 Điểm khác biệt hai chủng pH =8, chủng Paecilomyces lilacinus có khả tổng hợp protease cao, đó, chủng Penicillium paxilli tổng hợp protease yếu Nguyên nhân điểm pH này, chủng Paecilomyces lilacinus phát triển tốt, đó, chủng Penicillium paxilli phát triển Khoảng pH mà hai chủng NS có hoạt độ protease mạnh dao động từ 5-7, phù hợp với điều kiện pH RNM Nhiều nghiên cứu cho thấy pH thích hợp để nuôi cấy NS thu protease 5.66.2 [19] pH tối ưu hai chủng 5, phù hợp với pH tối ưu cho sinh trưởng hai chủng NS Khi pH cao thấp làm ức chế trình trao đổi chất khả hoạt hóa NS, ST hoạt độ protease giảm Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease hai chủng NS 3.3.6 Ảnh hưởng thời gian 3.3.6.1 Ảnh hưởng thời gian đến ST Cấy chủng NS vào MT1, ngày đo đường kính KL, đo ngày liên tiếp Kết trình bày bảng 3.18 biểu đồ 3.10 Kết nghiên cứu cho thấy hai chủng NS có tốc độ ST tương đối Thời gian ST mạnh chủng Penicillium paxalli từ ngày thứ đến ngày thứ 5, đường kính vịng ST từ ngày đến ngày tăng 6,7mm, đó, từ ngày đến ngày 4, tăng trưởng tương đối đồng đều, ngày đường kính vịng tăng trưởng tăng khoảng 4mm Từ ngày thứ đến ngày thứ 7, tốc độ tăng trưởng giảm rõ rệt Chủng Paecilomyces lilacinus có thời gian tăng trưởng mạnh từ ngày đến ngày 3, đường kính vịng tăng trưởng tăng 5,7mm Từ ngày trở đi, tăng trưởng giảm lại, ngày tăng từ 2-3mm Bảng 3.18 Ảnh hưởng thời gian đến ST hai chủng NS Khả sinh trưởng (mm) Thời gian (ngày) Penicillium paxalli Paecilomyces lilacinus 2.0 6.2 10.0 14.0 20.7 22.3 22.8 1.7 6.3 12.0 15.2 18.7 22.8 25.0 Biểu đồ 3.10 Ảnh hưởng thời gian đến ST Theo nghiên cứu S S Tzean S C Chiu (1988) xác định chủng Penicillium paxilli sau ngày ni cấy đường kính ST đạt 52mm [67], gấp đôi so với kết nghiên cứu Như vậy, so với chủng NS đất liền, khả ST NS RNM chậm Đây điểm đặc trưng sinh trưởng NS RNM Kết phù hợp với kết nghiên cứu Khưu Phương Yến Anh (2007) Nguyễn Thị Lan Hương (2009) 3.3.6.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease Nuôi cấy chủng NS vào MT9 độ mặn 3%, pH 5, hàm lượng ĐN 5%, độ ẩm 55% Penicillium paxalli; hàm lượng ĐN 3%, độ ẩm 65% Paecilomyces lilacinus Thời gian nuôi cấy khác nhau: 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h Sau ni cấy, ly trích enzyme xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson Kết thu sau trình bày bảng 3.19 minh họa đồ thị 3.6 Bảng 3.19 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ protease hai chủng NS Hoạt độ protease (UI/ml) Thời gian Penicillium (h) paxalli 24 0.099 0.002 0.198 0.001 36 0.421 0.007 0.454 0.004 48 0.639 0.011 0.972 0.012 60 1.555 0.004 2.310 0.004 72 2.342 0.013 2.024 0.009 84 2.432 0.008 1.242 0.003 96 1.261 0.010 0.697 0.001 Sai số Paecilomyces lilacinus Sai số Thời gian ni cấy có ảnh hưởng lớn khả sinh enzyme ngoại bào Khả tổng hợp enzyme ngoại bào NS tăng dần đạt tối lúc bắt đầu sinh bào tử sau bắt đầu giảm dần Từ kết cho thấy thời để hai chủng Penicillium paxalli Paecilomyces lilacinus cho hoạt độ protease cao 84h 60h Thời gian phù hợp với khoảng thời gian có tốc độ ST mạnh hai chủng NS Có thể thấy thời gian ni cấy NS thu protease hai chủng NS RNM (60-84h) dài chủng NS từ đất liền (32-42h) Kết nghiên cứu G.L Maria, K.R Sridhar N.S Raviraja cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu để thu protease chủng NS RNM Tây Nam Ấn Độ lên đến 144h [34] Sở dĩ thời gian tối ưu để thu protease hai chủng NS RNM dài so với chủng NS đất liền ST chủng NS RNM chậm ST chủng NS đất liền Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ protease hai chủng NS - Như vậy, từ kết nghiên cứu trên, ta rút số điều kiện MT thích hợp cho sinh tổng hợp protease hai chủng NS sau: + Chủng Penicillium paxilli: chất cảm ứng bột ĐN, hàm lượng 5%, nhiệt độ 30oC, độ mặn 3%, độ ẩm 55%, pH 5, thời gian 84h + Chủng Paecilomyces lilacinus: chất cảm ứng bột ĐN, hàm lượng 3%, nhiệt độ 30oC, độ mặn 3%, độ ẩm 65%, pH 5, thời gian 60h - Hoạt độ protease Penicillium paxalli sau tối ưu hóa là 2.432 UI/ml, trước tối ưu hóa 2.054 UI/ml (tăng 18%), Paecilomyces lilacinus sau tối ưu hóa 2.310 UI/ml, trước tối ưu hóa 1.918UI/ml (tăng 20%) (a) ( b) Hình 3.6 Vòng phân giải casein Penicillium paxalli trước (a) sau tối ưu (b) 3.4 Nghiên cứu tách chiết protease bán tinh khiết từ dịch MT Để tìm tác nhân kết tủa để thu protease bán tinh khiết có hoạt tính cao nhất, chúng tơi tiến hành nuôi cấy chủng NS vào MT9với điều kiện tối ưu trình bày Sau ly trích dịch enzyme tiến hành tủa enzyme tác nhân khác nhau: cồn 90o, axeton (NH4)2SO4 Sau sấy khô, ta thu enzyme bán tinh khiết Tiến hành đo OD để xác định hoạt độ protease enzyme thu được, kết trình bày bảng 3.20, biểu đồ 3.11 hình 3.6 Bảng 3.20 Hoạt độ protease theo tác nhân kết tủa khác Tác nhân kết tủa Axêton Cồn (NH4)2SO4 Hoạt độ protease (UI/ml) Penicillium Sai số Paecilomyces Sai số paxalli lilacinus 0.208 0.269 58.462 52.782 53.503 0.219 41.078 0.243 43.152 0.079 37.459 0.016 Tác nhân kết tủa Biểu đồ 3.11 Hoạt độ protease theo tác nhân kết tủa khác Axeton Cồn (NH4)2SO4 Paecilomyces lilacinus Axeton Cồn (NH4)2SO4 Penicillium paxalli Hình 3.6 Vòng phân giải casein hai chủng NS với tác nhân kết tủa khác Từ kết cho thấy ba tác nhân kết tủa trên, axeton tác nhân kết tủa cho hoạt độ protease bán tinh khiết cao hai chủng NS Đối với chủng Penicillium paxalli, cồn tác nhân kết tủa tốt Riêng ( NH4)2SO4 cho kết yếu hẳn hai tác nhân kết tủa lại Như vậy, axeton tác nhân kết tủa cho hoạt độ protease bán tinh khiết cao chủng NS 3.5 Một số đặc điểm sinh học khác hai chủng NS Để hiểu rõ đặc điểm vai trị hai chủng NS, chúng tơi tiếp tục khảo sát khả sinh KS số enzyme ngoại bào amylase, cellulase, kitinase chúng Kết trình bày bảng 3.21 Bảng 3.21 Một số đặc điểm sinh học hai chủng NS Đặc điểm sinh học Đặc điểm sinh học (D-d) ( mm) Penicillium paxalli Paecilomyces lilacinus Hoạt tính kháng E coli Hoạt tính kháng B Subtilis 13 Hoạt tính amylase 2.5 Hoạt tính cellulase Hoạt tính kitinase 10 12 Chúng tơi nhận thấy hai chủng NS có khả đối kháng với loại VK kiểm định mức trung bình yếu Ngoài khả sinh protease mạnh, hai chủng NS có khả sinh ba loại enzyme amylase, cellulase, kitinase, hoạt tính kitinase cao Chính enzyme ngoại bào giữ vai trị quan trọng q trình phân giải nguồn chất tự nhiên RNM Cần Giờ Vì mà NS giữ vai trò quan trọng HST RNM, chúng góp phần khép kín chu trình sinh địa hóa chất HST Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus Hình 3.7 Hoạt tính kháng E coli hai chủng NS Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus Hình 3.8 Hoạt tính kháng B subtilis hai chủng NS Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus Hình 3.9 Hoạt tính amylase hai chủng NS Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus Hình 3.10.Hoạt tính kitinase hai chủng NS Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus Hình 3.11.Hoạt tính cellulase hai chủng NS CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Như qua q trình nghiên cứu, chúng tơi thu số kết sau: Từ xã RNM Cần Giờ, phân lập 409 chủng NS có 64 chủng từ đất mặt (15,64%), 53 chủng từ đất sâu (12,96%), 59 chủng từ cành khô (14,43%), 81 chủng từ cành mục (19.8%), 71 chủng từ vàng (17,36%), 81 chủng từ mục (19,8%) Đã xác định 257/409 chủng NS có hoạt tính protease (62,84%) Trong số chủng NS có hoạt tính protease thay đổi theo thứ tự: cành mục > mục > đất mặt > cành khô > vàng > đất sâu Căn vào hoạt độ protease khả chịu mặn chủng NS chọn chủng 12CM3.4 551LM3 để sâu nghiên cứu Tiến hành định danh đến loài phương pháp sinh học phân tử xác định chủng 12CM3.4 Penicillium paxilli, độ trùng khớp 99%, chủng 551LM3 Paecilomyces lilacinus, độ trùng khớp 100% Xác định điều kiện tối ưu cho ST hoạt độ protease chủng NS sau: - Chủng Penicillium paxilli: + Điều kiện ST: nguồn N casein, độ mặn 3%, nhiệt độ 30oC, pH + Điều kiện cho hoạt độ protease: chất cảm ứng bột ĐN, hàm lượng 5%, nhiệt độ 30oC, độ mặn 3%, độ ẩm 55%, pH 5, thời gian 84h - Chủng Paecilomyces lilacinus: + Điều kiện sinh trưởng: nguồn N casein, độ mặn 1%, nhiệt độ 30oC, pH + Điều kiện cho hoạt độ protease: chất cảm ứng bột ĐN, hàm lượng 3%, nhiệt độ 30oC, độ mặn 3%, độ ẩm 65%, pH 5, thời gian 60h Cả chủng NS có khả đối kháng với loại VK kiểm định (B subtilis E coli), khả sinh ba loại enzyme amylase, cellulase, kitinase, hoạt tính kitinase cao Để thu nhận protease bán tinh khiết từ chủng NS có hoạt độ cao sử dụng tác nhân kết tủa axeton thích hợp 4.2 Đề nghị Trên kết nghiên cứu bước đầu để sớm đưa chủng NS vào ứng dụng Chúng đề nghị tiếp tục nghiên cứu số tiêu sau: - Nghiên cứu số tính chất chế phẩm protease thu - Thử nghiệm tác dụng protease thực tiễn chăn nuôi ... tài: Tìm số chủng NS có khả sinh protease mạnh từ RNM Cần Giờ nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease Nhiệm vụ đề tài:  Phân lập chủng NS từ RNM Cần Giờ  Tuyển chọn chủng NS... thu nhận enzyme protease từ chủng NS RNM Cần Giờ? ?? Đối tượng phạm vi nghiên cứu: chủng NS phân lập xã Long Hịa, Lí Nhơn, Tam Thơn Hiệp, An Thới Đơng, Bình Khánh RNM Cần Giờ Địa điểm nghiên cứu: ... cho chủng NS sinh enzyme ngoại bào Cho đến nay, cơng trình nghiên cứu NS RNM Cần Giờ thưa thớt, chưa có cơng trình nghiên cứu khả sinh protease chủng NS Chính lí mà tơi chọn đề tài ? ?Nghiên cứu thu