Nghiên cứu chọn chủng bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn cần giờ có hoạt tính diệt sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH - - Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH - - Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THANH THỦY Thành Phố Hồ Chí Minh - 2013 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ động viên suốt trình tiến hành đề tài  Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh hết lòng dạy dỗ  Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Hữu Phúc, TS Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới), cô Tâm, chị Trang, anh Nghĩa (Công ty Vipesco) hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành đề tài  Tôi xin cảm ơn chị Trần Thị Minh Định, chị Phùng Ngọc Thùy Linh, chị Hồ Thị Mỹ Linh, bạn Phạm Thị Lịch nhiệt tình giúp đỡ động viên  Tôi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, động viên ủng hộ Nguyễn Thiện Phú LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Tác giả luận văn Nguyễn Thiện Phú MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu Nhiệm vụ Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa đề tài Thời gian địa điểm nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược RNM Cần Giờ 1.2 Tổng quan Bt 12 1.2.1 Lịch sử phát Bt 12 1.2.2 Đặc điểm phân loại 13 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa Bt 16 1.2.4 Độc tố chế gây độc 17 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng, hình thành bào tử, tinh thể độc 21 1.2.6 Đối tượng tác động Bt 22 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Bt 24 1.3.1 Các nghiên cứu nước 24 1.3.2 Các nghiên cứu nước 26 1.3.3 Các hướng phát triển thuốc trừ sâu Bt 27 1.4 Phương pháp sản xuất chế phẩm Bt 28 1.4.1 Tuyển chọn chủng 28 1.4.2 Lên men chìm 29 1.4.3 Thu hồi sản phẩm 30 1.4.4 Tạo chế phẩm 30 1.4.5 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu 32 2.1.1 Đối tượng 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 32 2.1.4 Các môi trường nghiên cứu sử dụng 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt 33 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống dầu khoáng 34 2.2.3 Định danh đến loài chủng Bacillus sinh học phân tử 34 2.2.4 Phương pháp nhân giống 35 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt 36 2.2.6 Phương pháp xác định số lượng BT, tinh thể độc 37 2.2.7 Định lượng mật độ TB phương pháp đo mật độ quang 37 2.2.8 Phương pháp nuôi nhân giống sâu tơ 38 2.2.9 Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu 39 2.2.10 Khảo sát ảnh hưởng Mg2+ Mn2+ đến khả sinh trưởng hình thành tinh thể độc 40 2.2.11 Phương pháp kiểm tra diện gen sinh nội độc tố Bt 41 2.2.12 Phương pháp tạo chế phẩm Bt 43 2.2.13 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ 44 3.2 Khảo sát hoạt tính diệt sâu chủng VK có tinh thể độc 49 3.2.1 Kết xác định số lượng BT, tinh thể 50 3.2.2 Kết hoạt lực diệt sâu 51 3.3 Định danh sinh học phân tử chủng P14 54 3.4 Đặc điểm sinh học chủng tuyển chọn 54 3.5 Khảo sát ảnh hưởng Mg2+ Mn2+ đến khả sinh trưởng hình thành bào tử, tinh thể độc 56 3.5.1 Kết khảo sát ảnh hưởng Mg2+ đến khả sinh trưởng hình thành bào tử, tinh thể độc 56 3.5.2 Kết khảo sát ảnh hưởng Mn2+ đến khả sinh trưởng hình thành BT, tinh thể độc 58 3.6 Bước đầu khảo sát so sánh khả sinh trưởng sinh tinh thể độc chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ từ chế phẩm trừ sâu Đài Loan 60 3.6.1 So sánh khả sinh trưởng, sinh tinh thể độc 60 3.6.2 So sánh hoạt tính diệt sâu 62 3.7 Kết kiểm tra diện gen sinh nội độc tố Btk14 64 3.8 Tạo chế phẩm thử nghiệm hoạt tính chế phẩm 66 3.9 Kiểm tra khả sống sót chủng Btk14 chế phẩm 68 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 Kết luận 70 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 78 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BT Bào tử Bt Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis var kurstaki CFU Colony forming unit (Số đơn vị khuẩn lạc) kDa kiloDalton KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc NXB Nhà xuất OD Mật độ quang PBS Dung dịch đệm RNM Rừng ngập mặn TB Tế bào VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Sinh vật hại trồng nguyên nhân lớn làm giảm suất, gây thiệt hại nặng nề cho ngành nông nghiệp Trung bình năm lượng nông sản bị mát sinh vật hại khoảng 22% (Khan, 2008) Vì vậy, việc tiêu diệt chúng trở nên vô cấp thiết Trong giai đoạn đầu, thuốc hóa học bảo vệ thực vật sử dụng rộng rãi có nhiều ưu điểm trội Tuy nhiên, thuốc hóa học có nhiều nhược điểm gây tác dụng không nhỏ với môi trường sức khỏe người, gây cân sinh thái tạo nên tượng kháng thuốc sinh vật hại Vì vậy, việc tạo thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học (từ VSV), khắc phục nhược điểm thuốc hóa học, tạo nên bước tiến công tác bảo vệ thực vật Các sinh vật như: virus, VK, nấm, tuyến trùng… ứng dụng rộng rãi để hạn chế tác hại sinh vật hại trồng Trong số hàng loạt VK có khả tiêu diệt sâu hại, Bt tác nhân sinh học nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh giới, đồng thời sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học tiếng RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, độ đa dạng sinh học đánh giá cao khu vực Đông Nam Á Ngoài hệ động thực vật, rừng ngập mặn Cần Giờ chứa đựng tài nguyên sinh vật khác – thành phần khu hệ VSV nơi Các chủng VSV phân lập từ RNM ứng dụng nhiều lĩnh vực, đặc biệt nông nghiệp, nhờ khả sinh chất có hoạt tính sinh học cao Trong năm gần đây, nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu hệ sinh thái RNM phát đất nơi có Bt có khả diệt sâu Từ lí trên, định chọn đề tài: “Nghiên cứu chọn chủng Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu” Mục tiêu - Thu nhận chủng Bt có hoạt lực mạnh diệt sâu hại trồng làm sở khoa học việc tạo chế phẩm Nhiệm vụ Phân lập chủng Bacillus từ RNM Cần Giờ Tuyển chọn chủng VK có hoạt tính diệt sâu tơ hại bắp cải Phân loại chủng VK tuyển chọn đến loài sinh học phân tử Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng Bt tuyển chọn Khảo sát khả sinh trưởng, sinh tinh thể độc chủng Bt nghiên cứu so sánh với chủng phân lập từ chế phẩm nước Kiểm tra diện gen sinh độc tố chủng Bt nghiên cứu Bước đầu tạo chế phẩm diệt sâu thử nghiệm hoạt tính chế phẩm Đối tượng nghiên cứu - Các chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ - Chủng Bt phân lập từ chế phẩm trừ sâu Đài Loan - Sâu tơ hại bắp cải nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt Nam - Vipesco Ý nghĩa đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học Góp phần tìm hiểu khả diệt sâu tơ gây hại bắp cải Bt RNM Cần Giờ 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Dựa vào kết thu đề tài ứng dụng tạo chế phẩm để phòng trừ sâu tơ hại bắp cải Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013 - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược RNM Cần Giờ Theo Phan Nguyên Hồng (1999) RNM Việt Nam chia thành khu vực với 12 tiểu khu Khu vực I: Ven biển Đông Bắc, từ Mũi Ngọc đến mũi Đồ Sơn Khu vực II: Ven biển đồng Bắc Bộ, từ mũi Đồ Sơn đến mũi Lạch Trường Khu vực III: Ven biển Trung Bộ, từ mũi Lạch Trường đến mũi Vùng Tàu Khu vực IV: Ven biển Nam Bộ, từ mũi Vùng Tàu đến mũi Nai - Hà Tiên.[12] Địa điểm thu mẫu Hình 1.1 Bản đồ RNM Cần Giờ ( http://www.diaoconline.vn/tin-tuc/ban-do-thanh-pho-c20) Trong số RNM Việt Nam, RNM Cần Giờ có độ đa dạng sinh học đánh giá cao khu vực Đông Nam Á RNM Cần Giờ phát triển dựa lắng đọng bồi tụ phù sa từ sông Sài Gòn, hạ lưu sông Lòng Tàu, Ngã Bảy, sông Đồng Tranh Soài Rạp, nằm cửa ngõ Đông Nam thành phố Hồ Chí Minh RNM Cần Giờ có diện tích rừng đất rừng 38.664 với đặc điểm tự nhiên sau: • Khí hậu: có hai mùa, mùa mưa từ tháng đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng năm sau Nhiệt độ trung bình 25,8oC Lượng mưa thấp từ 1,300 – 1,400mm/năm • Địa hình: tương đối phẳng, cao trung bình 1,5m • Thổ nhưỡng: gồm loại đất mặn, đất mặn phèn, đất mặn phèn nhiều, đất cát mịn có pha bùn ven biển • Chế độ thủy triều: có chế độ bán nhật triều không đều, mực triều trung bình 2m, triều cao dâng đến 4m • Độ mặn: độ mặn lớn triều cường nhỏ triều Vào khoảng tháng 4, nước mặn chiếm ưu mối tương tác sông – biển, nước mặn xâm nhập sâu vào vùng đất liền [56] RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú Tuy nhiên, nghiên cứu RNM Cần Giờ chủ yếu tập trung vào hệ động, thực vật VSV đối tượng phân bố rộng rãi xem “kho báu” hệ sinh thái RNM Cần Giờ quan tâm gần Những nghiên cứu vi sinh vật RNM cho thấy chúng có tính thích nghi cao với điều kiện khí hậu khắc nghiệt chúng có khả tạo sản phẩm trao đổi chất đặc biệt so với điều kiện môi trường khác Nhiều công trình nghiên cứu nước cho thấy RNM nơi lưu giữ phân huỷ chất thải từ nội địa chuyển Nhờ VSV mà chất trở thành chất dinh dưỡng cho nhiều sinh vật khác môi trường [60] VSV đất RNM bao gồm VK, nấm sợi, nấm men xạ khuẩn có khả khả sinh enzym ngoại bào mạnh cellulase, amylase, protease, chitinase giúp phân huỷ hợp chất lớp đất mặt tinh bột, cenlulose, pectin, gelatin, casein, chitin có xác động vật thực vật số hợp chất phức tạp carboxyl methyl cellulose (CMC), chất lignocellulose mức độ khác Một số nấm sợi phân giải hợp chất phospho khó tan Chúng phân huỷ mùn bã ngập mặn chỗ, cung cấp nguồn thức ăn cho khu hệ động thực vật RNM phong phú kênh rạch vùng biển nông [59] 10 Theo Aksornkoae (1993), VK với nấm sinh vật quan trọng tham gia vào trình phân hủy thực vật rụng ngập mặn Trong thời gian phân hủy lá, sinh khối nấm giảm sinh khối VK ổn định tăng suốt giai đoạn phân hủy Hieber & Gessner (2002) cho thời gian tạo hệ VK ngắn so với nấm nên sinh khối VK tạo lớn, VK có vai trò vô quan trọng tham gia vào trình phân hủy xác thực vật VK dị dưỡng nhóm có số lượng nhiều nhóm vi sinh vật có vai trò chủ chốt trình phân hủy vật chất hữu cơ, khép kín chu trình sinh địa hóa hệ sinh thái RNM Chúng tham gia phân hủy xác động thực vật chất rơi rụng RNM tạo nguồn thức ăn phế liệu phong phú cung cấp cho loài động vật ăn phế liệu Chúng tham gia phân hủy hợp chất hữu tạo nguồn thức ăn khoáng cho ngập mặn hệ sinh thái Bản thân VK nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ ấu trùng số loài Khả phân hủy hợp chất hữu thường gặp hệ sinh thái RNM chủng VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM phục hồi RNM tự nhiên tương đối cao [60] Trong số VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM, có nhiều chủng VK hiếu khí không bắt buộc, chúng sinh trưởng phát triển tốt điều kiện môi trường có oxy thiếu oxy Chúng có vai trò không nhỏ trình phân hủy xác động thực vật RNM, bên cạnh nấm sinh vật phân hủy khác, sinh vật phát triển tốt điều kiện môi trường có sẵn oxy tự Đại đa số VK dị dưỡng đất RNM phân hủy có hình que, có khả di động số VK Gram âm (-) chiếm tỷ lệ tương đối lớn Phần lớn chúng VK chịu mặn ưa ấm Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 22-37oC, độ mặn môi trường nuôi cấy lên đến 5% đa số chủng bị ức chế sinh trưởng [60] Sự phân bố số lượng thành phần loài VSV thủy vực khác khác nhau, yếu tố có tính chất định hàm lượng muối, chất hữu cơ, pH, độ đục, nhiệt độ Trong vùng ven biển nước lợ với nồng độ muối thường 3% VK biển thật VK nước chịu mặn, tìm thấy VK nước lợ ưa mặn Nồng độ muối tối ưu chúng thường nằm khoảng 0,5% đến 2% Các VK nước lợ thường phát triển yếu hoàn toàn không phát triển môi trường nước hay bị ức chế sinh trưởng nồng độ muối 3% [56] 11 Khả sinh kháng sinh nhiều loài VK, nấm men, đặc biệt nấm sợi Các chủng VSV có hoạt tính kháng sinh mạnh thuộc chi Trichoderma, Penicillium, Cephaloporium, Paecilomyces Các VSV sinh kháng sinh có tác dụng ức chế VSV gây bệnh cho động, thực vật, làm môi trường bị ô nhiễm ven biển.[59] Các nghiên cứu VSV RNM vùng ven biển cho thấy có tới 83/199 chủng nấm sợi có khả phân giải dầu mỏ mức độ khác loài nấm sợi thuộc số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela (Trang cs, 2003) làm cho môi trường nước biển sạch, tạo điều kiện thuận lợi cho tảo phù du quang hợp, cung cấp O2 cho nhiều loài hải sản Sự phát triển chúng làm tăng nguồn thức ăn cho động vật vùng biển [59] Qua phân tích mẫu đất RNM Cần Giờ (TP.HCM), nhà khoa học phát chủng Bt sinh nhiều tinh thể có khả diệt trừ đặc hiệu số loài côn trùng gây hại cho người động, thực vật loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi… Nhiều nghiên cứu chứng minh độc lực chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ cao với ấu trùng sâu muỗi [59] Như vậy, việc nghiên cứu chủng VSV có VK từ RNM hướng đắn 1.2 Tổng quan Bt 1.2.1 Lịch sử phát Bt Việc nghiên cứu ứng dụng Bt đời phát triển với phát triển khoa học kỹ thuật nhân loại Bt nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực khác [7], [53] Năm 1870, Louis Pasteur, nghiên cứu bệnh dâu tằm, phát loại VK gây bệnh cho tằm đặt tên Bacillus bombycos Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học người Nhật, thực điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto làm chết đột ngột nhiều quần thể tằm, phân lập loại VK đặt tên Bacillus sotto Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức, phân lập VK giết hại mối Mediterranean flour Ông phát loài VK mà Ishiwatari Shigetane 12 công bố, đặt tên lại cho loài VK Bacillus thuringiensis Tên gọi xuất phát từ địa danh Thuringia, thị trấn nhỏ Đức, nơi phát mối Năm 1915, Matter phân lập từ ấu trùng bướm – mọt bột (Anagasta keuehmella) tái phát VK gây bệnh thức đặt tên Bacillus thuringiensis Cũng thời gian này, Ernst Berliner tiếp tục đưa báo cáo loại độc tố có chất protein Bt sản sinh thể, theo ông nguyên nhân khiến mối bị giết hại Tuy nhiên, tác dụng chế hoạt động loại protein chưa khám phá Năm 1920, người nông dân trang trại lớn nước phát triển bắt đầu sử dụng sinh khối Bt phun cho trồng loại thuốc phòng trừ sâu bệnh Pháp nước sử dụng Bt sớm (1938), đồng thời chế tạo loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử xác sâu nhiễm Bt, gọi Sporine dùng để diệt mọt bột Năm 1956, Hannay, Fitz - James Angus nghiên cứu phát tác nhân định khả tiêu diệt mối sâu bọ Bt phân tử protein, sản sinh thể Bt Những kết nghiên cứu mở cho nhà khoa học hướng nghiên cứu tác nhân, chế diệt sâu di truyền Bt Từ năm 1958, chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu sử dụng rộng rãi Mỹ, Anh, Đức… Đến năm 1961, Bt đánh giá loại thuốc trừ sâu thân thiện với người môi trường chiến lược phát triển nông nghiệp tổ chức bảo vệ môi trường EPA (Environmental Protection Agency) Mỹ Năm 1977, có 13 loài Bt phát công bố Các nghiên cứu phổ kháng cho thấy Bt không gây độc với giai đoạn định ấu trùng cánh vảy, mà gây độc với ấu trùng cánh cứng Từ năm 1980 trở đi, khả kháng độc sâu bệnh với loại thuốc hoá học kể loại cực độc DDT 666,… ngày gia tăng Để giải vấn đề đó, chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày sử dụng rộng rãi tinh thể độc Bt tiết có chất loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanh chóng môi trường, không ảnh hưởng đến sức khoẻ người, vật nuôi [8], [18], [23], [27] 1.2.2 Đặc điểm phân loại Vị trí phân loại Bt 13 - Lớp Shyzomycetes - Bộ Eubacteriales - Họ Bacillaceae - Giống Bacillus - Loài Bacillus thuringiensis [5] Bt chia làm nhiều loài phụ dựa đặc điểm sau: - Khả hình thành enzyme leucitinase - Cấu trúc tinh thể khả gây bệnh cho côn trùng - Đặc tính huyết học - Phản ứng ngưng kết tế bào sinh dưỡng với huyết tương ứng [6] Đến nay, phương pháp phân loại Bt sử dụng phổ biến dựa đặc tính huyết học Đặc tính huyết học chủng Bt xác định chủ yếu dựa kháng nguyên tiên mao H tiến hành phản ứng ngưng kết tế bào sinh dưỡng với kháng huyết tương ứng Tuy nhiên, việc phân loại dựa type huyết chưa phản ánh mối liên hệ chủng giống hoạt lực diệt côn trùng Việc phân lập tuyển chọn chủng Bt có giá trị gặp khó khăn Vì vậy, gần số nhà khoa học đề nghị đưa phương pháp phân loại Phương pháp dựa kết xác định type huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry thành phần protein tinh thể [3] Bảng 1.1 Một số type huyết chủng đại diện tương ứng Type huyết Chủng đại diện Viết tắt Người nghiên cứu Bt var thuringiensis THU Bliner (1915), Heimpel & Angus (1958) 3a, 3b Bt var kurstki KUR De Barjac & Lemill (1970) 4a, 4b Bt var sotto SOT Ishiwata (1905), Heimpel & Angus (1958) 5a, 5b Bt var candensis CAN De Barjac & Bonnefoi (1972) 8b, 8d Bt var nigeriensis NIG Weiser & Prasertphon (1954) 14 Bt var israelensis ISR De Barjac & cộng (1992) 30 Bt var medellin MED Orduz & cộng (1992) 33 Bt var leesis LEE Lee &cộng (1944) 14 46 Bt var chanpansis CHA Chainpaisang (1994) 48 Bt var balearica BAL Iriate Garcia (1995) 49 Bt var muju MUJ Park (1995) 50 Bt var navarrersis NAV Iriate Garcia 15 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa Bt Bt trực khuẩn Gram (+) sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, kích thước - 1,2 x - µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, chứa tinh thể độc có khả diệt sâu Tinh thể protein hình thành giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – µm Bt phát triển điều kiện nhiệt độ 15 - 450C thích hợp 290C – 300C Bào tử dạng hình oval, hình trứng dài 1,6 – µm Hình 1.2 Hình thái tế bào Bt ( http://www.komunich.de/vincent-sanchis/france/bacillus-thuringiensis.html) Phản ứng sinh lý, sinh hóa Bt bao gồm:  Làm ngưng kết sữa, làm đường glucose, fructose, glycerol, tinh bột, maltose…, hình thành acid  Không hình thành indol, có phản ứng dương tính với methyl đỏ, phản ứng VP dương (ethiryl methyl methanol)  Có tác dụng hòa tan môi trường huyết ngựa agar, mọc môi trường cianate, khử muối nitrate thành nitrite, không khử muối sulphate, sản sinh enzyme phospholipase.[1], [26], [27] 16 Hình 1.3 Tinh thể protein Bt (http://www.learner.org/courses/biology/archive/images/1006.html) 1.2.4 Độc tố chế gây độc 1.2.4.1 Các độc tố Bt Bt có khả tạo loại độc tố:  Ngoại độc tố α (α - exotoxin): phát năm 1950 từ VK Bacillus thuringiensis vanenlesti C.Toumaroff Ngoại độc tố α gọi enzyme leucintinase, có hoạt tính phospholipase, tác động chủ yếu lên gốc phospholipid màng tế bào sâu, giúp cho VK gây bệnh dễ xâm nhập vào xoang thể côn trùng Do vậy, enzyme leucintinase trực tiếp tham gia vào việc công, gây tổn thương tế bào thành ruột sâu [5], [28]  Ngoại độc tố β (β - exotoxin): Hall Arkavc phát vào năm 1959 nuôi ấu trùng muỗi thức ăn chứa Bt Đây độc tố bền nhiệt có chất nucleotide Khi độc tố xử lý 120oC 15 phút giữ hoạt tính Cơ chế tác động ngoại độc tố β cạnh tranh ATP với enzyme RNA polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt động enzyme, ngừng tổng hợp RNA, gây rối loạn sinh tổng hợp protein Mặt khác, ngoại độc tố β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ khiến côn trùng chết nhanh chóng Ngoại độc tố δ làm dập vỡ, phá huỷ vùng biểu mô ruột côn trùng, ngoại độc tố β xâm nhập vào huyết tương máu gây biến đổi sinh lý ấu trùng Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc cánh cứng, hai cánh, đặc biệt côn trùng giai đoạn ấu trùng, sâu non 17 Ngoại độc tố β gây cản trở lột xác côn trùng Nếu sử dụng nồng độ cao, độc tố β tiêu diệt trứng côn trùng [28]  Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin): phospholipase, có chất mạch peptide ngắn số amino acid tự Độc tố tan tốt nước, mẫn cảm với không khí, ánh sáng, nhiệt độ oxy nên hữu dụng thực tế đồng ruộng Cơ chế tác dụng ngoại độc tố γ tương tự ngoại độc tố α [30], [39]  Nội độc tố δ (δ - endotoxin) gọi tinh thể Cry hay ICPs So với nhóm ngoại độc tố trên, tinh thể độc Cry tạo với lượng lớn nhiều có hiệu gây độc cho côn trùng Tinh thể Cry tạo thành giai đoạn tạo BT, tác dụng độc đặc hiệu với loài côn trùng Lượng tinh thể độc phổ tác dụng thay đổi theo chủng Tinh thể ổn định dung dịch có phạm vi pH rộng (4 – 12), bị biến tính acid trichloacetic, chlorua thủy ngân Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính chịu nhiệt định (ở 65oC giữ h, 80oC giữ 20 phút) Những nghiên cứu gần cấu trúc nội độc tố δ cho thấy protein có vùng chức năng:  Vùng I bó gồm chuỗi xoắn α Một vài chuỗi tất chuỗi cài vào màng tế bào ruột, tạo lỗ, từ ion qua lại tự  Vùng II chứa dải β không song song tương tự vùng gắn kháng nguyên globulin miễn dịch Vùng có vai trò gắn với thụ thể bề mặt tế bào biểu mô ruột  Vùng III có nhiệm vụ bảo vệ độc tố hoạt hóa không bị phân hủy protease ruột Với cấu trúc phúc tạp vậy, nội độc tố δ liên kết đặc hiệu với thụ thể màng tế bào biểu mô ruột sâu, gây tác động dây chuyền Chính điều làm nên tính đặc hiệu cao hiệu tác động Bt lên sâu hại Đã có 50 gen mã hóa cho protein tinh thể độc giải mã cho phép phân loại chất độc thành 15 nhóm dựa giống trình tự gen [26], [31], [34] 18