Khảo sát đặc điểm sinh học một số chủng nấm sợi thuộc chi aspergillus và penicillium tại rừng ngập mặn cần giờ tp hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Võ Thị Bích Viên KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC CHI ASPERGILLUS VÀ PENICILLIUM TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Chuyên ngành : Vi Sinh Vật Mã số: 60 42 40 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THUỶ Thành phố Hồ Chí Minh - 2009 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thanh Thủy hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Sở Giáo dục đào tạo tỉnh Khánh Hồ, Trường THPT Ngơ Gia Tự - Khánh Hồ giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian học Tôi xin chân thành cám ơn Thầy Cô môn Vi sinh, quý Thầy Cô khoa Sinh học, tồn thể q Thầy Cơ tận tình giảng dạy suốt khố học Tơi xin chân thành cám ơn phòng KHCN – SĐH Trường ĐH Sư phạm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt khóa học Tơi xin chân thành cám ơn người thân gia đình, bạn bè động viên tạo điều kiện thuân lợi cho suốt thời gian qua Cuối cùng, xin gởi lời cám ơn đến bạn khố, học viên SĐH Khóa 18 chun ngành Vi sinh vật tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2009 Võ Thị Bích Viên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BT Bào tử BTT Bào tử trần CMC Carboxyl methyl cellulose CN Công nghiệp ĐK Đối kháng ĐV Động vật HST Hệ sinh thái KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MT Môi trường NXB Nhà xuất RNM Rừng ngập mặn SV Sinh vật TV Thực vật VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định MỞ ĐẦU Nấm sợi hay gọi nấm mốc, phát triển nhanh nhiều nguồn chất hữu gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm Trong tự nhiên, nấm sợi phân bố rộng rải tham gia tích cực vào vịng tuần hồn vật chất, q trình phân giải chất hữu hình thành chất mùn Ngồi ra, có nhiều loài nấm sợi sử dụng rộng rải CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), CN enzim (sản xuất amilaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối nấm sợi để phục vụ chăn nuôi dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng nấm sợi để xử lý nhiễm MT [4] Bên cạnh cịn có nhiều loài nấm sợi ký sinh người, ĐV, TV gây nhiều bệnh nguy hiểm Nhiều nấm sợi sinh độc tố nấm gây bệnh ung thư nhiều bệnh khác Nấm mốc phát triển, sinh axít làm mờ vật liệu vơ (thấu kính ống nhịm, kính hiển vi số dụng cụ quang học khác) Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ nấm sợi đồng thời hạn chế tác hại nấm sợi gây ra, người tập trung nghiên cứu vấn đề liên quan đến nấm sợi Trước đây, nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu nấm sợi phân bố đất liền Những năm gần đây, người nhận thấy hết tầm quan trọng hệ sinh thái RNM - HST có suất sinh học cao HST Với điều kiện sinh thái RNM người nghiên cứu khả chịu đựng phục hồi tổ hợp gen Có thể tìm chủng nấm sợi có hệ gen bền vững mang nhiều đặc tính có lợi cho người Nhiều lồi thuộc chi Aspergillus Penicillium phân bố rộng rải nhiều loại chất tự nhiên, phổ biến khắp nơi trái đất Theo E Kister, M Morelet (2000) ước tính số lượng lồi biết chi Penicillium khoảng 233 loài, chi Aspergillus khoảng 185 loài.[52] Sự phong phú đa dạng thành phần loài chúng mang lại lợi ích sinh thái kinh tế vơ to lớn Bên cạnh tác hại khơng nhỏ, với khó khăn công tác phân loại, hệ thống hai chi nấm Trong hệ sinh thái RNM Cần Giờ hai chi Aspergillus Penicillium có vai trị quan trọng, tham gia vào phân huỷ nhanh xác TV, ĐV, góp phần khép kín chu trình vật chất nhờ có khả sinh enzim cellulaza, proteaza, amilaza, kitinaza để phân giải hợp chất hữu MT Ngoài ra, nấm sợi cịn có khả phân giải hợp chất hydrocacbon giúp bảo vệ MT, nấm sợi cịn có khả sinh KS Trên giới, cơng trình nghiên cứu phân loại, ứng dụng chi Aspergillus Penicillium nhiều tập trung đất liền Rất có nghiên cứu hai chi biển hay RNM Cho đến nay, chưa có cơng trình khoa học thức có hệ thống VSV, đặc biệt khu hệ nấm sợi RNM Việt Nam nói chung, RNM Cần Giờ nói riêng Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt khu hệ nấm sợi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh” Mục tiêu đề tài nhằm tìm hiểu tính đa dạng vai trò số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium RNM Cần Giờ Tp Hồ Chí Minh Nhiệm vụ đề tài + Phân lập chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium RNM Cần Giờ + Khảo sát số đặc điểm sinh học chủng nấm sợi phân lập + Từ chủng phân lập tuyển chọn chủng có đặc điểm bật Bước đầu nhận xét sơ đặc điểm sinh học chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium Đề tài tiến hành từ tháng năm 2008 đến tháng năm 2009 phịng thí nghiệm Sinh hố – Vi sinh, khoa Sinh, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng ngập mặn (RNM) HST quan trọng hệ thống đất ngập nước RNM HST đặc biệt với điều kiện sinh thái đặc trưng khí hậu nóng, đất mặn ngập nước quanh năm, có thuỷ triều lên xuống, thường xuyên thiếu khí oxy ngập nước, đất chưa ổn định Với MT đó, quần hợp TV khơng họ hàng với có đặc tính sinh lý giống nhau, thích nghi sinh thái giống tạo nên kiểu rừng gọi RNM Ở miền Nam, Việt Nam RNM gọi Rừng sát, tiếng Anh gọi Mangrove Danh từ Mangrove thông dụng giới Trên giới, RNM thường gặp vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở Việt Nam, RNM bao phủ diện tích khoảng 400,000 vào năm 1943 (Maurand, 1943) Tuy nhiên, nhiều nguyên nhân khác chiến tranh, chuyển đổi mục đích sử dụng, đốn củi, làm cho diện tích RNM ngày thu hẹp Hơn 60 năm qua, 80% diện tích RNM bị tàn phá suy giảm chất lượng (worldbank, 2003) Đặc biệt năm 1995 trở lại đây, RNM bị thu hẹp cách nhanh chóng nguyên nhân người phá RNM để nuôi tôm.[10] Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ hình thành hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gịn nằm cửa ngõ Đơng Nam Thành phố Hồ Chí Minh: RNM Cần Giờ giới hạn đoạn sơng, rạch, tắc: sơng Sồi Rạp, sông Vàm Sát- rạch Đôn- tắc An Nghĩa- sông Lịng tàu, tắc Rổi- sơng Đồng Tranh- tắc Nước Hội- sơng Thị Vải- sơng Gị Gia- sơng Cái Mép biển Đông, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đông sang Tây dài 30km Thổ nhưỡng phát triển đầm mặn mới, phù sa sơng Sài Gịn sông Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành đất Đất Cần Giờ cấu tạo trình trầm tích sét, q trình phèn hố q trình nhiễm mặn Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm chịu chi phối qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt Lượng mưa: thấp TP Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường tháng kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng tháng [35] - Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt ngày từ – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35] - Độ ẩm khơng khí: cao nơi khác TP Hồ Chí Minh, mùa mưa độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khô độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm vào tháng 9, khô vào tháng [36] - Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn hai lần nước rịng ngày Các tháng có đỉnh triều cực đại tháng 10 tháng 11, đỉnh triều thấp tháng tháng [36] - Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực lên đến 18% [13], lớn triều cường nhỏ triều kém, nước mặn xâm nhập sâu vào tháng bị đẩy xa vào tháng tháng 10 * Khu hệ thực vật Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ có 150 lồi TV, lồi chủ yếu bần trắng, mấm trắng, quần hợp đước đôi - bần trắng sú, ổi, trang, đưng v.v… loại nước lợ bần chua, quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ biển với loài ưu Halophyla sp., Halodule sp., Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, loại đậu, dừa v.v…; vườn ăn trái [34] * Khu hệ động vật Theo khảo sát sơ dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999, kết quả: + Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống cạn có lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, lồi hữu nhũ Trong có 11 lồi bị sát có tên sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)… [34] + Khu hệ chim có khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 Trong có 51 lồi chim nước 79 lồi khơng phải chim nước sống nhiều sinh cảnh khác [35] Phân vùng khu dự trữ sinh Cần Giờ: Tổng diện tích Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ 75.740 ha, đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, vùng chuyển tiếp 29.880 [35] * Khu hệ VSV - Vi khuẩn VK với nấm tạo nên thành phần quan trọng hệ sinh thái RNM Là SV phân huỷ, chúng đóng vai trị trung tâm mặt chức HST Số lượng VK RNM chiếm tỉ lệ cao, đặc biệt trầm tích quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước mặt, quần thể bùn lớn gấp vài lần cát [34] Nhiều loài sống giá thể bề mặt rắn chất nhầy dính bám Do đó, VK tạo nên bề mặt mỏng mặt bùn tạo điều kiện cho loài tảo, cỏ biển ngập mặn phát triển - Nấm Khu hệ nấm RNM nhiều đa dạng Phần lớn vi nấm, có số lồi có kích thước lớn Nấm đóng vai trị quan trọng RNM, với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác TV (Fell cộng 1975) Người ta phân loại nấm dựa môi trường RNM: tán cây, thân, rễ hô hấp đất, có số lồi sống từ hai MT trở lên [33] Ở Ấn Độ, muời loài nấm phân lập từ RNM Pichavaram Aspergillus flavus, A ochraceus, Alternaria alternata, A tenuissima, Rhizopus nigricans, Penicillum funiculosum, P expansum, Humicola fuscoatra, Mucor racemosa Fusarium oxysporum Aspergillus Penicillium chiếm số lượng nhiều tất RNM lọai Alternaria alternata Rhizopus nigricans (Sivakumar and Kathiresan, 1990) Số nấm đếm mục RNM nhiều tươi [41] Người ta tìm thấy ngập mặn có lồi nấm ký sinh hoại sinh như: Ascomycetes, Bacidiomycetes Deuteromycetes Người ta tìm thấy chi nấm có mặt Đước đỏ (R mangle): Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium Aureobacidium [34] Các chi nấm ký sinh hoại sinh sống ngập mặn thường gây bệnh cho chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium, Nigrospora Cercospora Hầu hết lồi nấm đất liền có ngập mặn, cịn lồi nấm biển có rễ phần gỗ ngâm nước mặn Khi chết gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho loại nấm phân huỷ phát triển Các mẫu gỗ để ngâm nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao vùng ngập triều cao [34] Nấm đất RNM phân loại nấm đất loại nấm sống mảnh vụn mặt đất Cả hai loại phụ thuộc vào lượng chất hữu có bề mặt đất Một vài loài, đặc biệt Aspergillus candidus cho thấy khả tạo hợp chất phosphate tan từ chất phosphorus khơng tan cho SV khác sử dụng Vì vậy, nấm đóng vai trị tạo chất dinh dưỡng HST (Prabhakaran et al., 1987) [41] Đối với ngập mặn nấm SV phân huỷ đầu tiên, nhờ khả phân giải cellulose lignin Đa số loại nấm phân lập lá, gỗ thường nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác TV Chúng góp phần phân huỷ cỏ biển, bùn đầm lầy mặn [46] Nấm đóng vai trị quan trọng HST Cùng với VK, nấm SV phân hủy hầu hết HST Bởi vậy, nấm sợi có vai trị quan trọng chu trình sinh địa hóa nhiều lưới thức ăn Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy vật chất hữu thành phân tử vơ cơ, sau chất đồng hóa TV hay SV khác [46] Bản thân nấm sợi RNM trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ ấu trùng số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989) Tuy nhiên, hoạt động sống nấm sợi RNM lại làm giảm lượng oxi đất, bùn RNM q trình hơ hấp, gây bệnh cho động thực vật thải vào MT số chất độc amoniac, sunfuahidrơ…[13] VSV RNM ngồi VK nấm sợi cịn có nấm men, xạ khuẩn… chúng đóng vai trị quan trọng chu trình tuần hồn vật chất hệ sinh thái RNM Có vai trị bảo vệ MT sinh thái RNM nói riêng MT sinh thái nói chung, vai trị to lớn mối quan hệ sinh học loài SV Từ đó, đóng góp vào việc giữ cân cho HST đặc biệt  Vai trò RNM kinh tế Một số lồi TV RNM xếp vào nhóm cơng dụng chủ yếu: 30 lồi cho gỗ, than, củi, 14 loài cho tannin, 24 loài làm phân xanh, 21 loài dùng làm thuốc, loài chủ thả kiến cánh đỏ, 21 lồi cho mật ni ong, lồi cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2] Ngoài ra, RNM cịn có nguồn tài ngun ĐV phong phú lồi lưỡng cư, 22 lồi bị sát, 67 loài chim, 21 loài thú… SV nước phong phú gồm 64 lồi cá thuộc 35 họ, 25 lồi tơm, 66 loài TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh 22 loài ĐV đáy [2] Trong hệ sinh thái RNM, loài động thực vật, VSV đất MT tự nhiên liên kết với thông qua q trình trao đổi đồng hóa lượng Các q trình nội cố định lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu chu trình dinh dưỡng chịu ảnh hưởng mạnh mẽ nhân tố bên gồm nước, thủy triều, nhiệt độ lượng mưa RNM phát triển tốt nước có nồng độ muối 15 - 25‰ [2]  Vai trò RNM MT Bên cạnh giá trị lâm sản than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM cịn đóng vai trị quan trọng việc điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở q trình xâm thực bờ biển RNM cung cấp chất hữu để tăng Phụ lục Cấu tạo đại thể vi thể chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus phân lập đợt a b c d 1- Khuẩn lạc giá bào tử trần chủng L36A Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- khuẩn ty, d- Bọng đỉnh giá bào tử trần b a c 2- Cấu tạo đại thể vi thể chủng L42A Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- khuẩn ty, d- bọng đỉnh giá bào tử trần d a b c d 3- Cấu tạo đại thể vi thể chủng LM64A Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- khuẩn ty, d- Bọng đỉnh giá bào tử b a c d 4- Cấu tạo đại thể vi thể chủng L52A Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- khuẩn ty, d- Bọng đỉnh giá bào tử a b c d 5- Cấu tạo đại thể vi thể chủng CK31A Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- khuẩn ty bọng đỉnh giá, d- Bào tử a b a b c d 6- Cấu tạo đại thể vi thể chủng Đ83A Ký hiệu: a- Mặt trước KL, b- Mặt sau KL , c- Khuẩn ty, d- Bọng đỉnh giá bào tử trần a b c 7- Cấu tạo đại thể vi thể chủng ĐS45A Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Bọng đỉnh giá bào tử Phụ lục Cấu tạo đại thể vi thể chủng nấm sợi thuộc chi Penicillium phân lập đợt a b c b d 1-Khuẩn lạc giá bào tử trần chủng L37P Ký hiệu: a- Mặt trước KL, b- Mặt sau KL , c- Khuẩn ty, d- Giá bào tử trần bào tử trần a b 2- Cấu tạo đại thể vi thể chủng LM68P Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Giá bào tử trần bào tử trần d a b c 3- Khuẩn lạc giá bào tử trần chủng LM69P Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Giá bào tử trần bào tử trần a b c 4- Khuẩn lạc giá bào tử trần chủng L43P Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Giá bào tử trần bào tử trần a b c 5- Cấu tạo đại thể vi thể chủng LM73P Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Giá bào tử trần bào tử trần 6- Cấu tạo đại thể vi thể chủng CM66P Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Khuẩn ty, d- Giá bào tử trần bào tử trần a b 7- Cấu tạo đại thể vi thể chủng LM74P Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Giá bào tử trần bào tử trần c Phụ lục Hình số chủng nấm sợi có khả sinh enzim amylaza L10A L18A CK17P CM45A L16A LM26A CK16P Đ40P L17A LM35A CM48A ĐS 31P Phụ lục Hình số chủng nấm sợi có khả sinh enzim proteaza L1P L4A L7A L12A L30P L31P L32P LM5A LM10A LM15A LM9A LM22P LM23P CK6P CK23P CM30P LM51P CK16P CM5P CM44P CK2P CK20P CM26P Đ16P Đ18P Đ22P Đ40P Đ62A Đ73P Đ78P ĐS5P ĐS29P ĐS6P ĐS35P ĐS9P ĐS38P Phụ lục 10 Hình số chủng nấm sợi có khả sinh enzim cellulaza L17A L45P L24P LM1P LM8A LM10A LM14P LM15A L35P LM5A LM11P LM18P LM21P LM23P LM68P LM75P CM5P CM6P CM21A CM22P CM29A CM41P CM26A CM41P Phụ lục 11 Hình số chủng nấm sợi có khả sinh hoạt chất đối kháng với vi khuẩn B.subtillis E.coli LM39P CK5P CK55P CM6P LM48P CK5E CM4P CM6E LM49P CK8P CM4E CM22P CM22E CM30P Đ19P ĐS9P CM29P CM30E Đ61P ĐS9E CM29E CM48P Đ78P ĐS12E Phụ lục 12: Sơ đồ phân loại FUNGI phần Eumycota[17] [47] Giới Ngành Ngành phụ Lớp Bộ Họ Chi EUMYCOTA (Eumycetes) Zygomycotina Mastogomycotina Ascomycotina Zygomycetes Mucorales MYXOMYCOTA Basidomycotina Blastomycetes Entomophihorales Moniliales Moniliaceae Aspergillus 2.Penicillium Trichothecium Geotrichum Monilia* 6.Sporotrichum Botritis Cephalosporium Tricoderma 10 Scopulariopsis* Deu C Hyphomycetes Melanconiales Dematiaceae Cladosporium 2.Helminthosporium Alternaria Stemphylium * Loài có mặt Ascomycetes Hình : Sơ đồ phân loai phần Eumycota Sphae Tube ... nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt khu hệ nấm sợi tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí. .. Aspergillus Penicillium RNM Cần Giờ + Khảo sát số đặc điểm sinh học chủng nấm sợi phân lập + Từ chủng phân lập tuyển chọn chủng có đặc điểm bật Bước đầu nhận xét sơ đặc điểm sinh học chủng nấm sợi thuộc. .. hai chi Aspergillus Penicillium Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại tương ứng để xác định chủng vi nấm đến chi Aspergillus chi Penicillium [6] Một số đặc điểm chi Aspergillus Một số đặc điểm chi Penicillium