Nghiên cứu nột số loại màng trong sử dụng chế tạo kit xác định nhóm máu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - NGUYỄN ĐỨC HÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẬM - NGUYỄN ĐỨC HÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS THẨM THỊ THU NGA THÁI NGUYÊN, NĂM 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Thẩm Thị Thu Nga, phịng Cơng nghệ Gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phịng Cơng nghệ Gen động vật, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tơi tận tình suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên thầy giáo nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn ngƣời thân gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Thái Nguyên, tháng năm 2012 Học viên Nguyễn Đức Hùng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACD Axit citrate dextrose CMC Carboxyl methyl cellulose CPD Citrate, phosphat, dextrose CPDA Citrate, phosphat, dextrose, adenin Cs Cộng DEAE Diethylaminoethyl cellulose EDTA Ethylene diamine tetraacetic axit ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HIV Human immunodeficiency virus Ig Immunoglobulin Nxb Nhà xuất PA Poly acrylate PCR Polymerase chain reaction PLA Polylactic axit PVA Polyvinyl alcohol BSA Bovine serum albumin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÁU VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Khối lƣợng máu Error! Bookmark not defined 1.2 PHÂN LOẠI NHÓM MÁU 1.2.1 Hệ thống nhóm máu ABO 1.2.2 Hệ thống nhóm máuRh 1.3 KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG THỂ 1.3.1 Kháng nguyên (antigen) 1.3.2 Kháng thể (antibody) 1.4 CÔNG TÁC TRUYỀN MÁU TRÊN THẾ GIỚI 1.4.1 Lịch sử công tác truyền máu 1.4.2 Truyền máu đại 1.5 AN TOÀN TRUYỀN MÁU 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU 11 1.7 MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN GÂY BẤT THƢỜNG TRONG XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP HUYẾT THANH MẪU 12 1.7.1 Phản ứng yếu 12 1.7.2 Bệnh lý 13 1.7.3 Các nguyên nhân khác 13 1.8 NGUYÊN LIỆU TẠO MÀNG TRONG CHẾ TẠO THẺ XÉT NGHIỆM NHÓM MÁU 14 1.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 15 1.9.1.CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC 15 1.9.2.CÁC NGHIÊN CỨU CỦA NƢỚC NGOÀI 16 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 19 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3 HƢỚNG DẪN SỬ DỤNG THẺ XÉT NGHIỆM 20 2.3.1 Lấy mẫu 20 2.3.2 Qui trình xét nghiệm 20 2.3.3 Đọc kết 21 2.3.4 Ƣu điểm xét nghiệm thẻ 22 2.3.5 Hạn chế phƣơng pháp xét nghiệm thẻ 22 2.4 HƢỚNG DẪN CỤ THỂ CHO THU THẬP MÁU, CÁC THÀNH PHẦN VÀ CÁC CHẾ PHẨM MÁU 23 2.5 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ LÊN MỘT SỐ LOẠI MÀNG 26 3.1.1 Màng cellophane 26 3.1.2 Màng Cacboxymethylcellulose (CMC) 28 3.1.3 Màng Polyvinyl alcolhol (PVA) 31 3.2 NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ ANTI-A, ANTI-B LÊN MÀNG 35 3.3 NGHIÊN CỨU XÉT NGHIỆM KIỂM CHỨNG TỰ ĐỘNG LÀM SONG SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ 38 3.4 SO SÁNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA THẺ VỚI CÁC PHƢƠNG PHÁP KHÁC 39 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN THẺ, CÁC HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ KÈM THEO 41 3.6 GIÁ THÀNH SẢN PHẨM 43 3.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm nhóm máu hệ ABO tỉ lệ Việt Nam Bảng 1.2 Đặc điểm nhóm máu hệ Rhesus tỉ lệ Việt Nam Bảng 2.1 Kết kiểm chứng nhóm máu 21 Bảng 2.2 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu A 23 Bảng 2.3 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu B 23 Bảng 2.4 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu AB 24 Bảng 2.5 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu O 24 Bảng 3.1 Độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm đƣợc ép màng cellophane 27 Bảng 3.2 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với nồng độ CMC khác 29 Bảng 3.3 Độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm đƣợc ép màng CMC 31 Bảng 3.4 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với nồng độ PVA khác 32 Bảng 3.5 Độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm đƣợc ép màng PVA 34 Bảng 3.6 Độ nhạy thẻ sử dụng loại màng Cellophane, CMC, PVA 35 Bảng 3.7 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với lƣợng kháng thể khác 38 Bảng 3.8 So sánh độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm với phƣơng pháp xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube .40 Bảng 3.9 Thời hạn sử dụng thẻ xét nghiệm 42 Bảng 3.10 Giá thành sản xuất thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất .43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử màng CMC 14 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử PVA 14 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử cellophane 15 Hình 3.1 Phủ kháng thể lên màng cellophane 27 Hình 3.2 Xét nghiệm thẻ ép màng cellophane 27 Hình 3.3 Phủ màng CMC lên bề mặt thẻ xét nghiệm 30 Hình 3.4 Xét nghiệm thẻ ép màng CMC 2% 30 Hình 3.5 Xét nghiệm thẻ ép màng CMC 3% 30 Hình 3.6 Phủ màng PVA lên bề mặt thẻ xét nghiệm 32 Hình 3.7 Xét nghiệm thẻ ép màng PVA 3% 33 Hình 3.8 Xét nghiệm thẻ ép màng PVA 5% 33 Hình 3.10 Phủ kháng thể lên màng CMC 2% 36 Hình 3.11 Xét nghiệm màng CMC với 20µl kháng thể 37 Hình 3.12 Xét nghiệm màng CMC với 30µl kháng thể 37 Hình 3.13 Xét nghiệm màng CMC với 40µl kháng thể 37 Hình 3.14 Mẫu đối chứng khơng bị vẩn đục 39 Hình 3.15 Mẫu đối chứng bị vẩn đục 39 Hình 3.16 Xét nghiệm nhóm máu phiến 39 Hình 3.17 Xét nghiệm nhóm máu tube 39 Hình 3.18 Xét nghiệm nhóm máu thẻ EldonCard 41 Hình 3.19 Thẻ xét nghiệm nhóm máu ABO+D đề tài sản xuất 42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Theo Quy chế truyền máu Bộ Y tế ban hành ngày 19 tháng năm 2007, định nhóm máu hệ ABO giƣờng bệnh xét nghiệm bắt buộc nhằm phòng tránh tai biến tan máu cấp lòng mạch truyền nhầm nhóm máu [1] Trên bề mặt hồng cầu ngƣời có 30 kháng nguyên thƣờng gặp hàng trăm kháng ngun khác nhƣng kháng ngun có tính miễn dịch yếu Các kháng nguyên xếp thành hệ thống nhóm máu ABO, Rh, Lewis, MNSs, P, Kell Trong số có hai hệ thống nhóm máu ABO Rh đóng vai trị đặc biệt quan trọng truyền máu [6] Sự khơng tƣơng thích mặt miễn dịch hệ nhóm máu ABO nguy đe dọa nhiều y học truyền máu [49] Những biến chứng ngƣời bệnh truyền nhầm nhóm máu thƣờng lỗi xảy trình xét nghiệm máu [35] Định nhóm máu đầu giƣờng đƣợc thực trƣớc truyền máu nằm luật y tế nhiều nƣớc giới Vấn đề quan trọng định nhóm máu đầu giƣờng hệ nhóm máu ABO khả tƣơng thích, tính xác xét nghiệm [15], [20] Điều phụ thuộc vào độ xác thiết bị xét nghiệm Do vậy, định truyền nhầm nhóm máu lỗi kỹ thuật hiệu suất sử dụng thiết bị nghèo nàn [44] Để bảo đảm an toàn truyền máu mặt miễn dịch, phòng xét nghiệm phát máu định nhóm máu hệ ABO, hệ Rh hệ nhóm máu hồng cầu khác, xác định kháng thể bất thƣờng, tiến hành phản ứng hoà hợp điều kiện, nhiệt độ khác thực quy trình truyền máu Ở Việt Nam, định đƣợc nhóm máu hệ ABO, làm phản ứng chéo nhiệt độ 220C nên an toàn truyền máu mặt miễn dịch hạn chế [1] Trên giới, thẻ định nhóm máu Eldoncard A/S bắt đầu đƣợc sử dụng từ năm 1956 Việc định nhóm máu ABO, Rh đƣợc thực dễ dàng thời gian ngắn Thẻ định nhóm máu cho phép ngƣời sử dụng nhận biết đƣợc nhóm máu họ A, O, B hay AB, Rh(-) hay Rh(+) [17] Việc xác định tình trạng nhóm máu Rh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn phụ nữ mang thai quan trọng Nếu phụ nữ mang thai có Rh(-), bào thai có Rh(+), hệ miễn dịch ngƣời mẹ công tế bào hồng cầu bào thai, dẫn đến làm ngƣng kết hồng cầu thai nhi Tùy theo mức độ ngƣng kết dẫn đến sẩy thai thai chết [23] Tại Việt Nam, có số cơng ty bắt đầu cung cấp kit dạng thẻ xét nghiệm định nhóm máu nhập Tuy nhiên, phịng xét nghiệm sinh hóa chƣa thể đƣa vào sử dụng xét nghiệm cho bệnh nhân giá thành cao so với xét nghiệm phƣơng pháp truyền thống [1] Vậy yêu cầu đặt phải tạo đƣợc thẻ định máu ABO, Rh, đáp ứng nhu cầu sử dụng nƣớc Để góp phần vào việc tạo thẻ định máu ABO, Rh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo đƣợc thẻ xác định nhóm máu hệ ABO hệ Rh - Xác định độ nhạy độ xác thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất - Xác định điều kiện bảo quản thẻ định nhóm máu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xác định loại màng thích hợp để gắn kháng thể anti-A, anti-B, anti-D - Xác định hàm lƣợng kháng thể thích hợp đƣa lên màng - Nghiên cứu xét nghiệm kiểm chứng tự động làm song song với xét nghiệm thẻ để dựa vào đánh giá kết xét nghiệm - So sánh độ nhạy độ xác thẻ với phƣơng pháp khác - Nghiên cứu điều kiện bảo quản thẻ, hóa chất dụng cụ kèm theo - Hƣớng dẫn cụ thể cho thu thập máu, thành phần máu chế phẩm máu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 37 Hình 3.11 Xét nghiệm màng CMC với 20µl kháng thể Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Hình 3.12 Xét nghiệm màng CMC với 30µl kháng thể Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Hình 3.13 Xét nghiệm màng CMC với 40µl kháng thể Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Qua số liệu bảng 3.7, thẻ phủ 20µl kháng thể cho kết xét nghiệm hệ nhóm máu ABO Rh đạt 94,07% Do lƣợng kháng thể phủ lên thẻ q nên kết khơng rõ ràng, khó quan sát mắt thƣờng Thẻ phủ 40µl kháng thể cho kết quan sát mắt thƣờng cho kết 96,30%, nhiên thời gian làm khơ lâu, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 lƣợng huyết nhiều, kết thu đƣợc chậm Đồng thời, lƣợng huyết phủ lên màng nhiều lƣợng kháng thể phủ trƣớc nên cho kết khơng xác Với thẻ phủ 30µl kháng thể cho kết đạt 97,79% thời gian làm khô nhanh, dễ dàng quan sát kết mắt thƣờng, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất Bảng 3.7 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với lƣợng kháng thể khác Nhóm máu Số mẫu Lƣợng kháng thể phủ lên màng (n) 20µl 30µl 40µl Nhóm A 18 88,89 94,44 83,33 Nhóm B 13 92,31 92,31 100 Nhóm AB 18 94,44 100 94,44 Nhóm O 16 93,75 100 100 Nhóm Rh(+) 20 95,00 100 100 Nhóm Rh(-) 100 100 100 97,79 96,30 Trung bình 94,07 Để thuận tiện cho nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi sử dụng thẻ xét nghiệm CMC 2%, phủ 30µl kháng thể 3.3 NGHIÊN CỨU XÉT NGHIỆM KIỂM CHỨNG TỰ ĐỘNG LÀM SONG SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ Mẫu đối chứng âm khơng có kháng thể đƣợc sử dụng làm kiểm chứng Vì khơng cần cung cấp kháng thể nên thẻ dành vị trí để làm kiểm chứng nhỏ huyết không chứa kháng thể lên vị trí kiểm chứng màng Khi xét nghiệm, nhỏ giọt nƣớc muối đẳng trƣơng vào vị trí này, sau thêm 30µl huyết mẫu Mẫu đối chứng cho kết âm tính xét nghiệm mẫu máu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 39 thẻ có giá trị Nếu mẫu đối chứng có tƣợng ngƣng kết hay máu bị vẩn đục loại bỏ mẫu máu Hình 3.14 Mẫu đối chứng không bị vẩn đục Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Hình 3.15 Mẫu đối chứng bị vẩn đục Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D 3.4 SO SÁNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA THẺ VỚI CÁC PHƢƠNG PHÁP KHÁC Hình 3.16 Xét nghiệm nhóm máu phiến Hình 3.17 Xét nghiệm nhóm máu tube Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40 Để kiểm tra độ nhạy thẻ, làm song song xét nghiệm thẻ xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube theo phƣơng pháp huyết mẫu Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.8 So sánh độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm với phƣơng pháp xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube Độ nhạy (%) Nhóm máu Số mẫu Thẻ Phiến (n) xét kính Độ đặc hiệu (%) Tube nghiệm Thẻ Phiến xét kính Tube nghiệm Nhóm A 28 100 100 100 100 100 100 Nhóm B 38 97,37 94,7 100 100 100 100 Nhóm AB 20 100 100 100 100 100 100 Nhóm O 11 100 90,91 100 100 100 100 Rh(+) 20 95,00 100 95,5 100 100 100 Rh(-) 100 100 100 100 100 100 98,73 97,60 99,25 100 100 100 Trung bình Khi tiến hành so sánh độ nhạy thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất với phƣơng pháp xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube, kết khơng có khác biệt lớn Độ nhạy trung bình thẻ xét nghiệm, xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube lần lƣợt 98,73%, 97,60%, 99,25% Độ đặc hiệu đạt 100% Kết xét nghiệm sử dụng thẻ đề tài sản xuất có độ nhạy 98,73%, độ đặc hiệu 100% Mặc dù độ nhạy chƣa đạt đƣợc yêu cầu đặt ban đầu 100%, nhiên, kết tƣơng đối cao so sánh với phƣơng pháp thƣờng quy phịng thí nghiệm Thơng thƣờng đọc kết dƣơng tính sau khuấy trộn mẫu thời gian 60 giây Phản ứng âm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 tính đọc kết sau phút Nếu không chắn kết phải lặp lại xét nghiệm Trên giới, thẻ xét nghiệm EldonCard (Đan Mạch) xuất từ năm 1950 cho độ xác gần nhƣ tuyệt đối, xuất 0,3‰ lỗi xét nghiệm nhóm ABO [17] Thẻ HealthTEST Rh card cho kết Rh(-) có độ nhạy 99,70% đặc hiệu 98,90% [28] Độ nhạy mức độ đặc hiệu nhóm máu hệ ABO 92,80% 95,90% nghiên cứu Ingrand cộng [29] Sai số xét nghiệm kể sử dụng kit hay sử dụng phƣơng pháp thƣờng qui nhiều nguyên nhân khác điều tránh khỏi Một điều tra Pháp cho thấy xét nghiệm định nhóm máu bệnh viện cho kết độ nhạy 93,9% ± 3% [10] Hai lỗi thƣờng gặp xét nghiệm nhóm máu thực khơng xác quy trình xét nghiệm viên thiếu kinh nghiệm Việc đƣa kết luận với mẫu cho kết không rõ ràng, trƣớc hết cần lặp lại xét nghiệm sau kết hợp với xét nghiệm khác Hình 3.18 Xét nghiệm nhóm máu thẻ EldonCard Có kết tủa; Khơng có kết tủa; Có kết tủa; Khơng có kết tủa 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN THẺ, CÁC HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ KÈM THEO Sử dụng chất bảo quản NaN3 nồng độ 0,1% Đây chất bảo quản phổ biến thƣờng đƣợc dùng để bảo quản protein Kháng thể dạng dung dịch đƣợc bảo quản NaN3 điều kiện 2-80C giữ đƣợc hoạt tính sau năm Kháng thể khơ bảo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 42 quản chân khơng có độ bền tƣơng đối cao Thẻ xét nghiệm định nhóm máu đƣợc nghiên cứu bảo quản điều kiện nhiệt độ phòng (20- 280C), ngăn mát tủ lạnh (2-80C) trạng thái đóng gói nguyên bao nilon hút chân không dạng không bao gói Kiểm tra định kỳ với loại thẻ Kết nhƣ sau: Bảng 3.9 Thời hạn sử dụng thẻ xét nghiệm Thẻ khơng bao gói Thẻ có bao gói Nhiệt độ phòng 2-80C Nhiệt độ phòng 2-80C ngày 10 ngày tháng tháng Thời gian hoạt tính Thẻ đƣợc coi khơng cịn hoạt tính kháng thể không đọc đƣợc kết với bốn nhóm máu xét nghiệm cho kết sai sau lặp lại xét nghiệm lần thứ hai Hình 3.19 Thẻ xét nghiệm nhóm máu ABO+D đề tài sản xuất Thời hạn bảo quản thẻ bắt đầu đƣợc nghiên cứu sau sản xuất lô mẫu ngày 17/10/2011 Thẻ mở bao gói để nhiệt độ phịng sau tuần, có tƣợng kháng thể hút ẩm, lan rộng bám dính vào bao gói Vì vậy, kết xét nghiệm bị ảnh hƣởng nhƣ khó đọc kết hay kết sai Với thẻ bảo quản bao nilon hút chân không để ngăn mát tủ lạnh giữ nguyên hoạt tính sau tháng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 Đến thời điểm nay, mẫu bảo quản nhiệt độ 2-80C cịn hoạt tính So sánh với số thẻ định nhóm máu có thị trƣờng nhƣ Eldon có thời hạn bảo quản năm, thẻ Sifin có thời hạn bảo quản năm, thẻ xét nghiệm máu đề tài sản xuất đƣợc chấp nhận giá thành thời hạn sử dụng 3.6 GIÁ THÀNH SẢN PHẨM Để sản xuất kit cạnh tranh thị trƣờng giá thành vấn đề quan trọng thứ sau chất lƣợng Giá thành sản xuất thẻ xét nghiệm nhóm máu đƣợc thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Giá thành sản xuất thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất Nguyên liệu Đơn vị Số lƣợng Giá thành (VNĐ) CMC µl 400 Giá thể Chiếc 300 Kháng thể µl 2400 Que khuấy 1000 Giá thẻ xét nghiệm phụ thuộc giá kháng thể Giá thành kit đơn 4.100 VNĐ Một cách giảm giá thành sản phẩm giảm lƣợng huyết mẫu đƣa lên màng Trƣớc đây, sử dụng 50μl huyết mẫu cho vị trí phản ứng Điều phù hợp cho xét nghiệm nhà sử dụng pipet pasteur nhỏ giọt, lƣợng mẫu đem xét nghiệm không đƣợc định lƣợng xác Tuy nhiên, có dụng cụ thích hợp nhƣ pipetman cần với 30μl huyết mẫu đƣa lên thẻ đọc đƣợc kết rõ ràng 3.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI Xác định nhóm máu phƣơng pháp huyết mẫu phƣơng pháp thƣờng quy labo sinh hoá Việc xác định nhóm máu phƣơng pháp đƣợc chuẩn hố cho hố chất quy trình Tuy nhiên, để tăng tính chun nghiệp, tiện dụng, an tồn cho ngƣời xét nghiệm phổ biến cho ngƣời sử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 dụng sử dụng nhà số trƣờng hợp khẩn cấp, xét nghiệm dạng thẻ sử dụng lần đƣợc nghiên cứu chế tạo giới từ năm 50 Hiện giới, số lƣợng thẻ xét nghiệm định nhóm máu đƣợc chế tạo ngày nhiều (Serafol ABO bedside card [59], Olympus(R) PKTM [28], thẻ định nhóm máu Eldon Card [23]); thẻ xét nghiệm dạng ống (gel card PaLMS Australia, Ortho Gelcard Mỹ ) Tại Việt Nam, nay, việc chế tạo loại kit xét nghiệm nói chung thẻ xét nghiệm nói riêng nƣớc ta cịn tƣơng đối mẻ, kit dạng thẻ đƣợc chế tạo chƣa có nghiên cứu tạo thẻ xét nghiệm nhóm máu hệ ABO, Rh Nguyên nhân là xét nghiệm đơn giản, giá thành cho xét nhiệm thấp, muốn chế tạo kit dạng thẻ phải đáp ứng yêu cầu giá thành phải thấp nhiều so với giá xét nghiệm thƣờng quy thấp giá xét nghiệm theo qui định Bộ Y tế Theo xu hƣớng đó, phạm vi đề tài này, chúng tơi nghiên cứu quy trình chế tạo thẻ định nhóm máu hệ ABO, Rh để sản xuất nƣớc, hạ giá thành sản phẩm, đáp ứng mục tiêu chung đặt ban đầu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tạo đƣợc loại màng cellophane, màng CMC màng PVA cho thẻ xét nghiệm nhóm máu Trong đó, xét nghiệm nhóm máu thẻ phủ màng CMC nồng độ 2% cho độ nhạy trung bình cao (98,06%), thời gian làm khô nhanh, thao tác dễ dàng không bị biến tính dƣới nhiệt độ cao Xác định đƣợc hàm lƣợng kháng thể đƣa lên màng 30µl loại Thẻ đơn xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất có giá thành 4100VNĐ/thẻ đơn Thẻ bảo quản bao nilon hút chân không, bảo quản nhiệt độ 2-80C giữ nguyên hoạt tính sau tháng KIẾN NGHỊ Để thẻ xét nghiệm cạnh tranh tốt với loại thẻ nhập ngoại khác, cần tiếp tục thu thập mẫu máu Rh(-) để khảo sát thêm độ xác Nghiên cứu bổ sung số dụng cụ kèm theo nhƣ dao, que khuấy, màng phủ lên thẻ sau xét nghiệm dung dịch muối sinh lý để tăng tính tiện dụng cho ngƣời sử dụng Việc chế tạo thẻ chƣa có dây chuyền sản xuất mà đƣợc làm thủ công, chƣa thƣơng mại hóa đƣợc Hiện nay, nhu cầu xét nghiệm nhóm máu nƣớc ta lớn Số ca truyền máu khoảng đến triệu ca năm Trên giới, thẻ xét nghiệm định nhóm máu xuất từ năm 50 Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng xét nghiệm định nhóm máu bắt đầu xuất thực thị trƣờng tiềm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2008), Tài liệu tập huấn an toàn truyền máu, Hà Nội Lê Quang Long (1996), Bài giảng sinh lý người động vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Đỗ Trung Phấn (2000), An toàn truyền máu, Nxb Khoa học kỹ thuật Đỗ Trung Phấn (2006), “Huyết học - Truyền máu”, Bài giảng sau đại học, Nxb Y học Thái Quý (1999), “Lịch sử truyền máu”, Bài giảng sau đại học, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Lê Đình Sáng (2010), Huyết học - Truyền máu, Nxb Đại học Y khoa Hà Nội Lê Đình Sáng (2010), Miễn dịch học lâm sàng, Nxb Đại học Y khoa Hà Nội Nguyễn Anh Trí (2004), “An toàn truyền máu biện pháp để đảm bảo truyền máu đƣợc an toàn”, Một số chuyên đề Huyết học – Truyền máu, Nxb Y học, tr 46-60 TIẾNG ANH Al-Tamimi M et al., (2012), “Validation of paper-based assay for rapid blood typing”, Analytical chemistry, 84(3): 1661-8 10 Ammaranond P et al., (2011), “Enhanced agglutination reaction of ABO subgroups by gold nanoparticle solution: implication for identification of ABO subgroups”, Journal of biomedical nanotechnology, 7(6): 840-5 11 Anderson DR, et al (2000), “Evaluation of polyethylene terephthalate for ABO and Rh typing and alloantibody screening”, Transfusion, 40(6): 669-72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 12 Ballerini DR et al., (2011), “An inexpensive thread-based system for simple and rapid blood grouping”, Analytical and bioanalytical chemistry, 399(5): 1869-75 13 Bienek DR, Charlton DG (2011), “Accuracy of user-friendly blood typing kits tested under simulated military field conditions”, Military medicine, 176(4): 454-60 14 Brewer J (1961), Serological test card with color solid as visualizing agent, U.S Pat Nos 3,074,853 15 Caspari G et al., (2002), “The risk of transfusion to the wrong patient in Germany”, Transfusion, 42(9): 1238–1239 16 Cheng D, Hao Y (2011), “Comparative evaluation of the microcolumn gel card test and the conventional tube test for measurement of titres of immunoglobulin G antibodies to blood group A and blood group B”, The Journal of international medical research, 39(3): 934-43 17 Daurat G et al., (2002), “Validity of pretransfusion bedside agglutination tests for pretransfusional control”, Transfusion clinique et biologique, 9(4): 258-64 18 Denise M (1999), Modern blood banking and transfusion practise, book promotion & service, fourth edition, pp.90-213 19 Divya Talwar, Amit Arora (2010), “Blood group testing in developing countries: an ignored concern”, Journal of infection in developing countries, 4(12): 852-853 20 Du Chesne A et al., (1992), “Possibilities for using bedside cards as secondary comparison in trace element studies with the PCR technique”, Archiv für Kriminologie, 190(3-4): 103-8 21 Dujardin PP et al., (2000), “Errors in interpreting the pretransfusion bedside compatibility test: an experimental study”, Vox sanguinis, 78(1): 37-43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 22 Eldon Knud (1956), “Experience with ABO and Rh blood-grouping cards”, British Medical Journal, 1218-1220 23 Eldon Knud (1966), Instrument for blood grouping on blood grouping cards, U.S Pat Nos 3,424,558 24 Ensign BG et al., (1995), “ABO and Rh blood type errors on Air Force identification cards”, Military medicine, 160(6): 288-90 25 Euan R Tovey, Brian A Baldo (1989), “Protein binding to nitrocellulose, nylon and PVDF membranes in immunoassays and electroblotting”, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 19(2-3): 169-183 26 Felix Giebel et al., (2008), “Evaluation of four bedside test systems for card performance, handling and safety”, Original Article Originalarbeit 27 Fujii Y (2011), “Prevention of ABO-incompatible transfusion”, Japanese journal of anesthesiology, 60(1): 47-54 28 Gamma Biologicals, Inc (2003), Olympus(R) PKTM Blood grouping reagents 29 Ginestra E et al., (2004), “DNA extraction from blood determination membrane card test”, Forensic science international, 146 Suppl: S145-6 30 Harvey G Klein, David J Anstee (2005), Mollison’s Blood Transfusion in Clinical Medicine, Blackwell Publishing, pp 1-252 31 Hermut Schenkel - Brunner (2000), Human blood groups - Chemical and Biochemical - Basis of Antigen specificifi, Springer Wien NewYork, pp 54-622 32 Herold TJ et al., (2005), “Determining the accuracy of a rapid pointof-care test for determining Rh phenotype”, Academic emergency medicine, 12(5): 474-6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 33 Ingrand P et al., (1998), “Reliability of the pretransfusion bedside compatibility test: association with transfusion practice and training”, Transfusion, 38(11-12): 1030-6 34 Jarujamrus P et al., (2012), “Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper”, The Analyst, 137(9): 2205-10 35 Jean C.E (2001), “WHO strategies for safe blood transfusion”, Chinese journal of blood transfusion (14), pp 39-42 36 Khan MS et al., (2010), “Paper diagnostic for instantaneous blood typing”, Analytical chemistry, 82(10): 4158-64 37 Krombach J et al., (2002), “Human error The persisting risk of blood transfusion A report of life cases”, Anesthesia and analgesia, 94(1): 154-6 38 Langston MM et al., (1999), “Evaluation of the gel system for ABO grouping and D typing”, Transfusion, 39(3): 300-5 39 Lapierre Y et al., (1990), “The gel test: A new way to detect red cell antigen-antibody reactions”, Transfusion, 30: 109-113 40 Lee HY et al., (2011), “Rapid direct PCR for ABO blood typing”, Journal of forensic sciences, 56 Suppl 1: S179-82 41 Leitch K et al., (1993), “A preliminary trial of the gel test for blood group serology”, British journal of biomedical science, 50(1): 64-6 42 Mass M (1970), Identification card, U.S Pat Nos 3,502,437 43 Mc Gowan A et al., (1989), “Stability of murine monoclonal anti-A anti-B and anti-AB, grouping reagents and a multi-centre evaluation of their performance in routine use”, Vox sanguinis, 56(2): 122-130 44 Meinshausen E, Wendt M (1989), “Introduction of a new card for the bedside test'”, Der Anaesthesist, 38: 555–557 45 Migeot V et al., (2002), “Reliability of bedside ABO testing before transfusion”, Transfusion, 42(10): 1348-1355 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 46 Nathalang O et al., (2001), “A preliminary study of the distribution of blood group systems in Thai blood donors determined by the gel test”, The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 32(1): 204-7 47 Novaretti MC et al., (2004), “Comparison of conventional tube test technique and gel microcolumn assay for direct antiglobulin test: a large study”, Journal of clinical laboratory analysis, 18(5): 255-8 48 Ortho-Clinical Diagnostics (2006), “Immunohematology”, Evaluation report 49 Perrotta PL, Snyder EL (2001), “Non-infectious complications of transfusion therapy”, Blood reviews, 15: 69–83 50 Plapp FV (1989), “New techniques for compatibility testing”, Archives of pathology and laboratory medicine, 113(3): 262-9 51 Proverbio D et al., (2011), “Comparison of gel column agglutination with monoclonal antibodies and card agglutination methods for assessing the feline AB group system and a frequency study of feline blood types in northern Italy”, Veterinary clinical pathology, 40(1): 32-9 52 Raache R et al., (1998), “Production of monoclonal antibodies specific for the ABO blood group and rhesus D antigens”, Archives de l'Institut Pasteur d'Algérie, 62:118-137 53 Rachel JM, Plapp FV (1990), “Bedside blood grouping”, Medical laboratory sciences, 47(4): 330-6 54 Rouger P et al., (1997), “Advances in the use of monoclonal antibodies for blood testing”, Transfusion clinique et biologique, 4(4): 345-349 55 Rouger P et al., (2000), “Immunologic risk analysis of blood transfusion 1991–1998 (in France)”, Transfusion clinique et biologique, 7(1): 9-14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 56 Seth M et al., (2011), “Comparison of five blood-typing methods for the feline AB blood group system”, American journal of veterinary research, 72(2): 203-9 57 Taylor J et al., (2011), “Multi-centre evaluation of pretransfusional routine tests using 8-column format gel cards”, Transfusion medicine, 21(2): 90-8 58 Uthemann H, Weber M (1982), “Securing the ABO-identity by serafol before blood transfusions”, Der Anaesthesist, 31(4): 204-5 59 Voak D (1989), “Monoclonal blood group antibodies”, Contributions to infusion therapy, 24: 200-13 60 Yves Lapierre et al., (1996), Method detecting antigens and/or antibodies, U.S Pat Nos 5,512,432 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... phải tạo đƣợc thẻ định máu ABO, Rh, đáp ứng nhu cầu sử dụng nƣớc Để góp phần vào việc tạo thẻ định máu ABO, Rh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT. .. KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo đƣợc thẻ xác định nhóm máu hệ ABO hệ Rh - Xác định độ nhạy độ xác thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất - Xác định điều kiện bảo quản thẻ định. .. HỌC SƢ PHẬM - NGUYỄN ĐỨC HÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời