Đột biến gen sxt11 và stxbp2 trong hội chứng thực bào máu

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG ĐỘT BIẾN GEN SXT11 VÀ STXBP2 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU Mã số: ……… Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS.BS HOÀNG ANH VŨ Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Hoàng Anh Vũ Phan Thị Xinh Nguyễn Thị Lan Vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU 1.2 TỔNG QUAN VỀ GENE STX11 1.3 TỔNG QUAN VỀ GENE STXBP2 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CÚU Ở VIỆT NAM .6 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN STX11 VÀ STXBP2 .8 3.2 PHÁT HIỆN BIẾN THỂ TRÊN GEN SXT11 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU 10 3.3 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN SXTBP2 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU .11 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG BIỂU, DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT FHL Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis HLH Hemophagocytic Lymphohistiocytosis PCR Polymerase Chain Reaction Hình 3.1 Kết PCR gen STXBP2 Hình 3.2 Biến thể c.146G>A (p Arg49Gln) gen STX11 Hình 3.3 Đột biến dị hợp tử c.1057T>C (p.Cys353Arg) exon 13 Hình 3.4 Kết tra cứu phần mềm Polyphen2 Hình 3.5 Đột biến dị hợp tử c.1430C>T (p.Pro477Leu) exon 16 Bảng 3.1 Thông tin đoạn mồi gen STXBP2 nghiên cứu Bảng 3.2 Kết định lượng DNA sau tách chiết THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: - Tên đề tài: Đột biến gen SXT11 STXBP2 hội chứng thực bào máu - Mã số: …… - Chủ nhiệm đề tài: Hoàng Anh Vũ (Điện thoại: 077.2993537, Email: hoanganhvu@ump.edu.vn) - Đơn vị quản lý chuyên môn: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: 06/2018 – 04/2019 Mục tiêu: + Mục tiêu chung: Khảo sát đột biến gen SXT11 STXBP2 hội chứng thực bào máu + Mục tiêu cụ thể: 1) Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự gen STX11 STXBP2 2) Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen STX11 STXBP2 vào chẩn đoán lâm sàng cho bệnh nhân Nội dung chính: - Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự gen SXT11 STXBP2 - Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen SXT11 STXBP2 xây dựng để khảo sát trường hợp hội chứng thực bào máu - Tổng kết báo cáo kết Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Về đào tạo (số lượng, chun ngành: trình độ BS/DS/CN, ThS, NCS…): Khóa luận tốt nghiệp cử nhân  Công bố tạp chí nước quốc tế (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): khơng  Sách/chương sách (Tên sách/chương sách, năm xuất bản): không  Patent, Giải pháp hữu ích (tên; trình trạng nộp đơn giải pháp chưa đăng ký sở hữu trí tuệ; mã số, ngày cấp, thời gian bảo hộ patent giải pháp đăng ký sở hữu trí tuệ): không Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại:  Kết nghiên cứu chuyển giao (Tên sản phẩm, tên đơn vị nhận chuyển giao, giá trị chuyển giao): không  Phạm vi địa ứng dụng kết nghiên cứu (tên đơn vị ứng dụng kết nghiên cứu/tên giảng trích dẫn kết NC sử dụng giảng dạy đại học sau đại học): góp phần chẩn đốn phân tử bệnh lý suy giảm miễn dịch tiên phát MỞ ĐẦU Hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) rối loạn gặp, đe dọa tính mạng, đặc trưng phản ứng viêm nghiêm trọng, gây tăng sinh tế bào lympho đại thực bào hoạt hóa mức, tăng cytokine, làm tổn thương tế bào, suy đa quan Những người mắc phải HLH thường biểu triệu chứng bệnh tháng đầu năm đầu bệnh Các triệu chứng bao gồm sốt, gan to, lách to, giảm tế bào máu ngoại vi có biểu triệu chứng thần kinh trung ương kèm [6] HLH chia làm hai thể gồm: hội chứng thực bào máu nguyên phát (primary HLH) hội chứng thực bào máu thứ phát (secondary HLH) HLH ngun phát hay cịn gọi HLH có tính chất gia đình (Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - FHL), bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đột biến gen PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 tương ứng với subtype FHL2, FHL3, FHL4 FHL5, tìm thấy nhiều thành viên huyết thống cha mẹ thường có biểu lâm sàng lúc tuổi nhỏ.Tỷ lệ trẻ em mắc phải FHL tuổi ước tính khoảng 1,1/100.000 [3] Gen Syntaxin 11 (STX11) nằm vị trí 6q24 NST số sở phân tử bệnh FHL4 Sản phẩm gen STX11 protein, syntaxin 11, nhóm thụ thể protein gắn nhân tố nhạy với N-ethylmaleimide hịa tan có màng tế bào đích (t-SNARES) Syntaxin 11 biểu tế bào bạch cầu đơn nhân, NK tế bào T gây độc tế bào tham gia vào trình tạo bóng màng dung hợp màng Trong đó, gen STXBP2 nằm nhiễm sắc thể số 19, có vai trị mã hóa cho protein Munc18-2 tham gia vào q trình vận chuyển tế bào, điều khiển SNARE (các thụ thể protein gắn yếu tố nhạy cảm N - ethylmaleimide hòa tan) đảm nhiệm việc lắp ráp phức hợp giải phóng hạt gây độc tế bào nhiễm, đột biến gen nguyên nhân gây FHL5 Những năm gần đây, FHL ngày ý nhiều tầm quan trọng việc định điều trị sớm với ức chế miễn dịch [9] mà việc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch tạm thời kiểm soát bệnh Hiện nay, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu coi cách có khả chữa khỏi bệnh HLH phân thành nhóm theo bất thường gen: HPLH1, perforin, UNC13D, STX11 STXBP2 Trong nghiên cứu trước đây, mô tả đột biến phát gen perforin UNC13D Trong nghiên cứu này, quy trình giải trình tự gen STX11 STXBP2 thiết lập ứng dụng vào chẩn đoán lâm sàng CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU Hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) Scott Robb-Smith mô tả vào năm 1939 [8] biết đến rối loạn gặp, đe dọa tính mạng, đặc trưng phản ứng viêm nghiêm trọng, gây tăng sinh tế bào lympho đại thực bào hoạt hóa mức, tăng cytokine, làm tổn thương tế bào, suy đa quan Những người mắc phải HLH thường biểu triệu chứng bệnh tháng đầu năm đầu bệnh Các triệu chứng bao gồm sốt, gan lách to, giảm tế bào máu ngoại vi, tăng triglyceride máu, giảm fibrinogen máu, thường có co giật có biểu triệu chứng thần kinh trung ương kèm HLH chia làm hai thể bao gồm: HLH thể nguyên phát hay HLH có tính chất gia đình (Primary or Familial HLH) chia thành subtype tương ứng với bất thường gen PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 HLH thể thứ phát (Secondary HLH) HLH nguyên phát chia thành nhóm nhỏ: (1) HLH có tính chất gia đình (FHL) HLH liên quan tới thiếu hụt bẩm sinh hệ thống miễn dịch hội chứng Griscelli type (GS2), hội chứng Chediak- Higashi (CHS) rối loạn thâm nhiễm lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type (XLP1, XLP2) [27] FHL bệnh di truyền gen lặn nằm nhiễm sắc thể thường (nhiễm sắc thể số 6, 9, 10, 17 19) nhiễm sắc thể giới tính X Có thể tự xuất khởi phát sau nhiễm trùng, thường có biểu lâm sàng từ lúc tuổi nhỏ, tỷ lệ trẻ em tuổi 1,1/100.000 ca Tuy nhiên không loại trừ trường hợp FHL trẻ lớn tỷ lệ mắc bệnh hai giới nam nữ HLH thứ phát (Secondary HLH) hay HLH mắc phải chiếm tỷ lệ cao HLH nguyên phát, thường xảy sau yếu tố khởi phát thường sau nhiễm siêu vi Thể thứ phát tìm thấy bệnh tự miễn, bệnh ác tính (bạch cầu huyết, lymphoma) bệnh rối loạn chuyển hóa [4, 7] gặp tất lứa tuổi thường xuất trẻ lớn người lớn Cả hai nhóm HLH thứ phát FHL khởi phát sau q trình nhiễm khuẩn, nên khó phân biệt hai nhóm dấu hiệu lâm sàng không sử dụng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử Ở HLH di truyền hay FHL gây bất thường gen nằm nhiễm sắc thể thường 6, 9, 10, 17 19 chiếm khoảng 25% trường hợp HLH HLH thứ phát gây yếu tố gia đình gen, thường tìm thấy bệnh nhiễm trùng, bệnh tự viêm, tự miễn (được biết đến phổ biến hội chứng hoạt hóa đại thực bào - MAS), bệnh lý ác tính, ức chế miễn dịch, cấy ghép tế bào gốc tạo máu, cấy ghép nội tạng, nhiễm HIV bệnh chuyển hóa [2] Hơn hai thập kỷ qua, sinh lý bệnh học HLH xác định, người ta chưa hiểu hoàn toàn giai đoạn Giả thiết chấp nhận liên quan đến khiếm khuyết chức tế bào lympho T gây độc (CTL) tế bào giết tự nhiên (NK) Tuy vậy, chế sinh bệnh xác HLH thứ phát chưa làm sáng tỏ hồn tồn có khả đa yếu [5 Ở người bình thường, chế miễn dịch bảo vệ thể khỏi tác nhân nhiễm trùng tác nhân nội bào giải phóng hạt gây độc vào tế bào nhiễm CTL NK CTL NK trở nên hoạt hóa sau nhận diện tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen Presenting Cell - APC), hình thành khe miễn dịch (Immunological synapse - IS) hai tế bào, sau chúng giải phóng hạt gây độc tế bào chứa perforin granzyme vận chuyển vào bên tế bào nhiễm, thực chu trình chết theo chương trình Quan trọng hơn, hạt gây độc tế bào lympho không tác động trực tiếp vào tế bào bị nhiễm mà chống lại APC Việc loại bỏ APC góp phần quan trọng việc hạn chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T Đây chứng cho thấy CTL quan trọng sinh bệnh học HLH so với tế bào NK, chế miễn dịch thông qua việc giết APC mô tả cho tế bào NK [1,10] 1.2 TỔNG QUAN VỀ GENE STX11 Syntaxin 11 (STX11) nằm vị trí 6q24 NST số sở phân tử bệnh FHL4 Locus xác định dịng họ người Kurdish có người bị FHL với đột biến đoạn gen STX11 Ba đột biến khác xác định tổng số 10 bệnh nhân FHL4 từ gia đình khác nhau, tất có nguồn gốc dân tộc Kurkish Thổ Nhĩ Kỳ Sản phẩm gen STX11 protein, syntaxin 11, nhóm thụ thể protein gắn nhân tố nhạy với Nethylmaleimide hịa tan có màng tế bào đích (t-SNARES) Syntaxin 11 biểu tế bào bạch cầu đơn nhân, NK tế bào T gây độc tế bào tham gia vào q trình tạo bóng màng dung hợp màng Những đột biến gen STX11 chiếm 14% trường hợp khơng phải FHL1; số cao (21%) người dân Thổ Nhĩ Kỳ Những đột biến gen syntaxin 11 chưa xác định bệnh nhân FHL Nhật Bản nhóm dân tộc khác, cho thấy đột biến gen giới hạn nhóm dân tộc cụ thể 1.3 TỔNG QUAN VỀ GENE STXBP2 Gen STXBP2 (Syntaxin Binding Protein 2) nằm vùng cánh tay ngắn nhiễm sắc thể số 19, định vị vị trí 19p13.2 từ vị trí nuleotide 7.637.101 đến 7.647.875 Gen STXBP2 có độ dài 10.774 bp gồm 19 exon Gen STXBP2 mã hóa cho protein gắn kết với Syntaxin hay biết đến với tên gọi Munc18-2, thành viên thuộc họ protein SEC/ MUNC gồm 593 amino acid, có kích thước phân tử 66.453 Da Protein mã hóa tham gia vào việc vận chuyển bên tế bào, điều khiển việc lắp ráp phức hợp SNARE (các thụ thể protein gắn yếu tố nhạy cảm N - ethylmaleimide hòa tan - Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor Attachment protein Receptor) Phức hợp thực vai trò hòa màng tế bào đích túi tiết chứa hạt gây độc gồm perforin granzyme B, sau giải phóng hạt perforin granzyme B đến khe miễn dịch (IS) Protein STXBP2 hay Munc 18-2 tương tác với Syntaxin 11 - protein liên quan đến FHL4 STXBP2 quan trọng, cần thiết đường giải phóng hạt ly giải tế bào xâm nhập vào tế bào đích khởi phát q trình chết theo chương trình, giết tế bào bị nhiễm cách gắn kết với Syntaxin 11 tạo thành phức hợp SNARE Vì vậy, đột biến gen STXBP2 ảnh hưởng đến chức STXBP2, thiếu hụt protein STXBP2 dẫn đến hoạt tính gây độc tế bào NK CTL giảm khả gây độc lên tế bào đích, nguyên nhân gây FHL5 FHL5 báo cáo chiếm khoảng 10% cá thể FHL Thổ Nhĩ Kỳ Arab Saudi, 20% Đức Hơn 100 kiểu biến đổi gen STXBP2 báo cáo Clinvar ngân hàng sở liệu NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/), bao gồm 39 đột biến sai nghĩa (missense mutation), đột biến lệch khung (frameshift mutation), đột biến vùng nối (splice site mutation) Hầu hết bệnh nhân FHL5 mang hai loại đột biến khác hai alen nằm hai nhiễm sắc thể Trong đó, đột biến sai nghĩa loại đột biến phổ biến 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CÚU Ở VIỆT NAM Trong nghiên cứu trước đây, mô tả đột biến phát gen perforin UNC13D Trong nghiên cứu này, quy trình giải trình tự gen STX11 STXBP2 thiết lập ứng dụng vào chẩn đoán lâm sàng CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: Bệnh nhân chẩn đoán hội chứng thực bào máu theo tiêu chuẩn HLH-2004 Henter cs Khảo sát đột biến gen STX11 STXBP2 thực từ tháng 4/2018 đến tháng 4/2019 2.2 TÁCH CHIẾT GENOMIC DNA: Chúng dùng QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ) để tách chiết genomic DNA từ 200 µL máu ngoại vi theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3 THIẾT KẾ MỒI CHO PCR (polymerase chain reaction): Các đoạn mồi thiết kế phần mềm Oligo 4.1 dựa trình tự chuẩn STX11 STXBP2 mang accession number NG_007613 NG_016709 GenBank 2.4 THỰC HIỆN PCR: Trong tube PCR có tổng thể tích 25 µL, thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 µM cho loại), loại mồi xi ngược (0,5 µM cho loại), TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (1,25 unit) 20 ng genomic DNA Chu kỳ luân nhiệt bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 980C phút, theo sau 40 chu kỳ gồm biến tính 980C 10 giây, gắn mồi 600C 25 giây, tổng hợp chuỗi DNA 720C phút kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 720C phút Sản phẩm PCR phát điện di thạch agarose 1,2% Sản phẩm PCR tinh QIAquick Gel Extraction kit kiểm tra lại điện di thạch agarose 1,2% 2.5 THỰC HIỆN GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA: Sản phẩm PCR tinh thực phản ứng cycle sequencing với BigDye V3.1 từ Applied Biosystems, theo chiều xuôi ngược cho exon Sản phẩm sau kết tủa ethanol, hịa tan Hi-Di formamide, biến tính 950C phút trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN STX11 VÀ STXBP2 Gen STX11 có exon mã hóa cho protein, khuếch đại cặp mồi STX11-g2F (5’- TGCCCACACCGAGGAATACA-3’) STX11-g2R (CTGAGTTCCGGAAAGGGTTG) với kích thước sản phẩm PCR 1104 bp (kết đây) Các cặp mồi dùng nghiên cứu để khuếch đại 19 exon gen STXBP2 thể Bảng 3.1 Bảng 3.1: Thông tin đoạn mồi gen STXBP2 nghiên cứu Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen khuếch đại (bp) STXBP2-g1F ACCTTGGGACACACCCGGAA STXBP2-g4R CGTATACACATGCACACATG STXBP2-g5F TGTTTGCACATGGTGGCAGA STXBP2-g6R4 STXBP2-g7F CAAGTGATCCTCCTGCCCTG ATTCGGCAAAGCAGGCTTCA STXBP2-g13R AGAACCCCCCATCTCTACAG STXBP2-g14F ATCCCCTTCCCTGACACATA STXBP2-g16R AAGGGAATGCCAGCAATGAG STXBP2-g17F AGGATCTTGGCCCCTGAATA STXBP2-g19R AGAGCGACGGGAAGAGTTTA Exon – (2860) Exon – (488) Exon – 13 (1754) Exon 14 – 16 (1900) Exon 17 – 19 (801) Đánh giá cặp mồi: Có chiều dài từ 20bp, nhiệt độ nóng chảy hai mồi chênh lệch khơng q 5oC, nhiệt độ hai mồi nằm khoảng cho phép Tỷ lệ %GC nằm khoảng 40-60% Vì thơng số vật lý cặp mồi đạt yêu cầu dùng để khuếch đại vùng gen mục tiêu Từ thông số vật lý xác định bảng cho thấy cặp mồi khuyếch đại trình tự mục tiêu STX11 STXBP2 đạt yêu câu mặt vật lý Kết tách chiết DNA: Mẫu máu thu nhận từ bệnh viện Đại học Y Dược bảo quản sau tiến hành tách chiết DNA theo QIA amp DNA Blood Minikit Kết tách chiết, tinh DNA đo mật độ quang bước sóng 260, 280nm Kết sau: Bảng 3.2: Kết định lượng DNA sau tách chiết Kí hiệu A260nm A280nm A260/280 C(μg/ml) HLH-1 0,68 0,31 1,87 39,5 Dựa vào kết đo OD phía nhận thấy tỉ lệ A260/280 1,87: thông số ghi nhận đạt tiêu chuẩn nằm khoảng từ 1,8 – 2,0 kết luận mẫu không bị nhiễm protein hay RNA, nồng độ DNA tương đối cao 9.5 đủ điều kiện để thực bước Sau thực PCR, kết khuếch đại gen STXBP2 sau Hình 3.1: Kết PCR gen STXBP2 Các giếng từ 1-5: sản phẩm PCR khuếch đại exon 1-4, exon 5-6, exon 7-13, exon 14-16 exon 1719 Giếng 6: chứng âm Giếng Ladder: thang chuẩn kb plus Giếng 1: Sản phẩm PCR có kích thước vạch 2000 Kích thước cho thấy phù hợp với lí thuyết đoạn chứa exon - 2860 bp Giếng 2: Sản phẩm PCR có kích thước gần vạch 500 Kích thước cho thấy phù hợp với lí thuyết cuả đoạn chứa exon 488 bp Giếng 3: Sản phẩm PCR có kích thước vạch 2000 Kích thước cho thấy phù hợp với lí thuyết cuả đoạn chứa exon – 13 1754 bp Giếng 4: Sản phẩm PCR có kích thước gần sát vạch 2000 Kích thước cho thấy phù hợp với lí thuyết cuả đoạn chứa exon 14 – 16 1900 bp Giếng 5: Sản phẩm PCR có kích thước gần vạch 700 Kích thước cho thấy phù hợp với lí thuyết cuả đoạn chứa exon 17 – 19 801 bp Tất sản phẩm PCR có băng rõ nét, đậm khơng xuất băng ký sinh Giếng (mẫu chứng âm): không nhiễm (khơng xuất vạch), cho thấy sinh phẩm hóa chất sử dụng cho phản ứng thao tác thực không bị tạp nhiễm Như vậy, phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế dùng để khuếch đại 19 exon gen STXBP2 đặc hiệu, phù hợp để khuếch đại thành công vùng exon mục tiêu gen STXBP2 3.2 PHÁT HIỆN BIẾN THỂ TRÊN GEN SXT11 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU Các sản phẩm PCR giải trình tự hệ thống Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer để tìm đột biến Trên gen STX11 khơng tìm thấy đột biến có ghi nhận biến thể lành tính c.146G>A (p Arg49Gln) Hình 3.2 Hình 3.2 Biến thể c.146G>A (p Arg49Gln) gen STX11 10 3.3 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN SXTBP2 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU  Exon 13: Tại vị trí nucleotide 1057 phát điểm thay đổi nucleotide từ T chuyển thành C (kí hiệu c.1057T>C) dẫn đến thay đổi codon 353 chuyển từ amino acid Cysteine thành Arginine (kí hiệu p.Cys353Arg) (Hình 3.3) Tiến hành tra cứu ngân hàng sở liệu NCBI kết tìm kiếm khơng tìm thấy cơng bố biến thể vị trí này, biến thể chưa công bố Để xác định đột biến SNP cách sử dụng phần mềm trực tuyến Polyphen2 (Hình 3.4) Kết tra cứu cho thấy đột biến gây bệnh dựa vào điểm tính dựa xác suất mà việc thay amino acid gây hại (Sore = 1) hay việc so sánh trình tự amino acid cho kết Cysteine codon 353 amino acid bảo tồn, việc chuyển từ Cysteine thành Arginine đột biến Hình 3.3 Đột biến dị hợp tử c.1057T>C (p.Cys353Arg) exon 13 11 Hình 3.4 Kết tra cứu biến thể c.1057T>C (p.Cys353Arg) phần mềm Polyphen2  Exon 16: Tại vị trí nucleotide 1430 phát điểm thay đổi nucleotide từ C chuyển thành T dẫn đến thay đổi codon 477 chuyển từ amino acid Proline thành amino acid Leucine (kí hiệu p.Pro477Leu) (Hình 3.5) Tiến hành tra cứu ngân hàng sở liệu NCBI với mã số truy cập rs121918540 kết luận biến thể c.1430C>T exon 16 gen STXBP2 đột biến gây bệnh 12 Đây đột biến nhầm nghĩa (missense mutation) dạng dị hợp tử (2 sóng), đột biến thường gặp bệnh nhân mắc FHL5 báo cáo trước vào năm 2009 [11] dạng đồng hợp tử Phát đột biến c.1430C>T mẫu bệnh nghiên cứu lại cho kết dị hợp tử (2 sóng gần trùng lên nhau), có nghĩa mẫu bệnh nghiên cứu mang alen bình thường alen bệnh (có thể từ bố mẹ) Hình 3.5 Đột biến dị hợp tử c.1430C>T (p.Pro477Leu) exon 16 13 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Quy trình giải trình tự gen STX11 STXBP2 kỹ thuật Sanger thiết lập phát đột biến thay nucleotid hội chứng thực bào máu Cùng với gen Perforin UNC13D, quy trình xét nghiệm gen STX11 STXBP2 kỹ thuật Sanger chuẩn hóa nên ứng dụng vào lâm sàng cho khoa có điều trị bệnh nhân hội chứng thực bào máu 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Behrens E.M., Canna S.W., Slade K., Rao S., Kreiger P.A., Paessler M., Kambayashi T., Koretzky G.A (2011), Repeated TLR9 stimulation results in macrophage activation syndrome-like disease in mice, J Clin Invest, 121, pp 2264-2277 Beutel K., Gross-Wieltsch U., Wiesel T et al (2009), “Infection of T lymphocytes in Epstein-Barr virus associated hemophagocytic lymphohistiocytosis in children of non-Asian origin”, Pediatr Blood Cancer, 53, pp 184-190 Gholam C., Grigoriadou S., Gilmour K.C., Gaspar H.B (2011), “Familial haemophagocytic lymphohistiocytosis: advances in the genetic basis, diagnosis and management”, Clin Exp Immunol, 163(3), pp 271-83 Henter JI, Horne A, Arico M et al HLH‐2004 (2007), “Diagnostic and therapeutic guidelines for hemophagocytic lymphohistiocytosis”, Pediatr Blood Cancer, 48(2), pp 124‐131 Janka GE, Lehmberg K (2013), Hemophagocytic lymphohistiocytosis: pathogenesis and treatment, Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2013, pp 605-611 Janka GE.(2007), “Familial and acquired hemophagocytic lymphohistiocytosis”, Eur J Pediatr, 166, pp 95-109 Nguyễn Đặng Thuận An, Lê Minh Hiển, Trần Quý Phương Linh, Nguyễn Trường Sơn, Nguyễn Thị Tuyền, Nguyễn Văn Thạo (2014), “Chuẩn đoán điều trị hội chứng thực bào máu khoa huyết học bệnh viện Chợ Rẫy (20112012)”, Y Học TP Hồ Chí Minh, tập 18(2), 132-135 Scott R B., Robb-Smith A H T (1939), “Histiocytic medullary reticulosis”, Lancet, pp ii194-198 Trần Thị Mộng Hiệp (2013), “Nguyên nhân hội chứng thực bào máu trẻ em kết ứng dụng phác đồ Hemophagocytic Lymphohistiocytosis”, Y Học TP Hồ Chí Minh, tập 17(2), 132 10 Van Dommelen S.L., Sumaria N., Schreiber R.D., Scalzo A.A., Smyth M.J (2011), “DegliEsposti MA: Perforin and granzymes have distinct roles in defensive immunity and immunopathology”, Immunity 2006, 25, pp 835-848 11 Zur Stadt U., Rohr J, Seifert W., Koch F., Grieve S., et al (2009), “Familialhemophagocytic lymphohistiocytosis type (FHL-5) is caused by mutations in Munc18-2 and impaired binding to syntaxin 11”, Am J Hum Genet, 85, pp 482-492  ... III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN STX11 VÀ STXBP2 .8 3.2 PHÁT HIỆN BIẾN THỂ TRÊN GEN SXT11 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU ... gian thực hiện: 06/2018 – 04/2019 Mục tiêu: + Mục tiêu chung: Khảo sát đột biến gen SXT11 STXBP2 hội chứng thực bào máu + Mục tiêu cụ thể: 1) Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự gen STX11 STXBP2. .. UNC13D Trong nghiên cứu này, quy trình giải trình tự gen STX11 STXBP2 thiết lập ứng dụng vào chẩn đoán lâm sàng CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU Hội chứng thực bào