Đột biến gen serpinc1 trong bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG ĐỘT BIẾN GEN SERPINC1 TRONG BỆNH HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU Mã số: ……… Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS.BS HOÀNG ANH VŨ Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Hoàng Anh Vũ Phan Thị Xinh Nguyễn Thị Vân Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU .3 1.2 GEN SERPINC1 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CÚU Ở VIỆT NAM .7 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .10 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SERPINC1 .10 3.2 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN SERPINC1 TRONG BỆNH HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU 12 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG BIỂU, DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HKTMS Huyết khối tĩnh mạch sâu PCR Polymerase Chain Reaction Hình 3.1 Kết PCR gen SERPINC1 Hình 3.2 Giải trình tự exon Hình 3.3 Giải trình tự exon Hình 3.4 Giải trình tự exon Bảng 3.1 Thông tin mồi dùng nghiên cứu Bảng 3.2 Kết định lượng DNA sau tách chiết THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: - Tên đề tài: Đột biến gen SERPINC1 bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu - Mã số: …… - Chủ nhiệm đề tài: Hoàng Anh Vũ (Điện thoại: 077.2993537, Email: hoanganhvu@ump.edu.vn) - Đơn vị quản lý chuyên môn: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: 06/2018 – 04/2019 Mục tiêu: + Mục tiêu chung: Khảo sát đột biến gen SERPINC1 bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu + Mục tiêu cụ thể: 1) Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự gen SERPINC1 2) Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen SERPINC1 vào chẩn đốn lâm sàng cho bệnh nhân Nội dung chính: + Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự gen SERPINC1 + Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen SERPINC1 xây dựng để khảo sát trường hợp huyết khối tĩnh mạch sâu + Tổng kết báo cáo kết Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Về đào tạo (số lượng, chuyên ngành: trình độ BS/DS/CN, ThS, NCS…): Thực tập tốt nghiệp cử nhân  Công bố tạp chí nước quốc tế (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): khơng  Sách/chương sách (Tên sách/chương sách, năm xuất bản): không  Patent, Giải pháp hữu ích (tên; trình trạng nộp đơn giải pháp chưa đăng ký sở hữu trí tuệ; mã số, ngày cấp, thời gian bảo hộ patent giải pháp đăng ký sở hữu trí tuệ): khơng Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại:  Kết nghiên cứu chuyển giao (Tên sản phẩm, tên đơn vị nhận chuyển giao, giá trị chuyển giao): không  Phạm vi địa ứng dụng kết nghiên cứu (tên đơn vị ứng dụng kết nghiên cứu/tên giảng trích dẫn kết NC sử dụng giảng dạy đại học sau đại học): góp phần chẩn đoán phân tử bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu MỞ ĐẦU Huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) định nghĩa phát triển huyết khối tĩnh mạch sâu xương chậu chi [5] Chấn thương nội mô mạch gây lưu lượng máu chậm, thúc đẩy hình thành cục máu đông, làm giảm lưu lượng máu tĩnh mạch [6] Huyết khối tĩnh mạch sâu vấn đề sức khỏe đặc biệt nghiêm trọng biến chứng cấp tính mạn tính bệnh Biến chứng nguy hiểm HKTMS dễ dẫn đến tử vong thuyên tắc phổi Biến chứng mạn tính bệnh hội chứng sau viêm tĩnh mạch loét tĩnh mạch gây ảnh hưởng nghiêm trọng sức khỏe HKTMS bệnh lý có nhiều biến chứng nguy hiểm dự phịng Tỉ lệ mắc HKTMS bệnh nhân nội khoa nước phương tây cao Nhiều tác giả cho bệnh lý châu Á hiếm, tầm soát điều trị HKTMS Việt Nam chưa bác sĩ quan tâm Các nghiên cứu dịch tễ học Mỹ cho thấy thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch gây tử vong hàng năm nhiều tử vong bệnh AIDS, ung thư vú tai nạn giao thông cộng lại Ở Bắc Mỹ Châu Âu, 100.000 người có 160 trường hợp bị HKTMS 50 trường hợp thuyên tắc phổi chẩn đoán qua tử thiết, HKTMS tạo di chứng đáng kể lâu dài thiểu tĩnh mạch mạn tính hay hội chứng hậu huyết khối Bệnh nhân nằm viện đặc biệt có nguy cao bị thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch, tần suất HKTMS ghi nhận bệnh nhân khơng dự phịng huyết khối dao động từ 10% đến 26% dân số chung bệnh nhân, tần suất cao nhiều ghi nhận nhóm đặc biệt suy tim ứ huyết, suy hơ hấp, đột quị, nhiễm trùng, hội chứng thận hư, bệnh viêm đường ruột v.v… Nguy tắc mạch huyết khối bệnh nhân bị ảnh hưởng khơng tình trạng lâm sàng tại, mà yếu tố nguy tiềm ẩn xác định từ trước tuổi già, béo phì, nằm bất động, giãn tĩnh mạch, tiền sử có thuyên tắc tĩnh mạch huyết khối… Những yếu tố có tác động cộng dồn nguy tổng thể yếu tố nguy quan trọng gây huyết khối bệnh cấp mà bệnh nhân mắc Việc chẩn đoán bệnh tương đối khó khăn có khoảng 20% bệnh có triệu chứng bị sưng, nóng, đỏ, đau chân bị huyết khối, cịn khoảng 80% khơng triệu chứng HKTMS đại diện cho gánh nặng chăm sóc sức khỏe đáng kể tồn giới [6] HKTMS phổ biến người da đen gốc Tây Ban Nha so với người da trắng [4] Gen SERPINC1 mã hóa cho việc tổng hợp protein gọi antithrombin (trước gọi antithrombin III), loại chất ức chế serine protease (serpin) Serpins giúp kiểm sốt số loại phản ứng hóa học cách ngăn chặn hoạt động số protein định Antithrombin tìm thấy máu quan trọng việc kiểm sốt đơng máu Antithrombin ngăn chặn hoạt động protein thúc đẩy đông máu, đặc biệt protein gọi thrombin Antithrombin gắn (liên kết) với thrombin số protein đông máu khác, sau loại bỏ khỏi máu gan Trong phần antithrombin liên kết với thrombin protein đông máu khác, phần khác protein liên kết với chất gọi heparin Antithrombin thay đổi hình dạng nó liên kết với heparin Sự thay đổi hình dạng cho phép antithrombin làm bất hoạt protein đông máu với tốc độ nhanh nhiều [2] Việc khảo sát đột biến gen SERPINC1 bệnh HKTMS góp phần chuẩn đốn xác đưa cách điều trị hiệu CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU 1.1.1.Sơ lược bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu Huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) định nghĩa phát triển huyết khối tĩnh mạch sâu xương chậu chi Nhiều yếu tố di truyền mơi trường góp phần vào phát triển bệnh [3] Hầu hết yếu tố liên quan đến thay đổi lưu lượng máu thay đổi thành phần máu Kết hợp với lớp nội mạc bị thương tổn, chúng tạo trạng thái tăng đông cục Khi khả tăng đông vượt ngưỡng định, hình thức huyết khối mức xảy xuất dạng huyết khối tĩnh mạch lớn chân tay [4] Chấn thương nội mô mạch gây lưu lượng máu chậm, thúc đẩy hình thành cục máu đông, làm giảm lưu lượng máu tĩnh mạch, trường hợp nặng gây thuyên tắc phổi (PE) Bệnh nhân HKTMS thường biểu đau chỗ chân bị phù sưng, biểu lâm sàng HKTMS có khác biệt đáng kể bệnh nhân có khơng có triệu chứng, triệu chứng nặng nhẹ Sự phù lên chi triệu chứng cụ thể phổ biến HKTMS Các triệu chứng gợi ý, dấu hiệu Homans (cụ thể đau bắp chân dorsiflexion bàn chân), tạo thuận lợi cho việc xác định HKTMS, nhiên nhìn thấy 50% tất bệnh nhân HKTMS Sự đổi màu chi quan sát thấy, với màu tím đỏ phổ biến nhất, có lẽ tắc tĩnh mạch Trong số trường hợp, có tắc nghẽn tĩnh mạch lớn chân trở nên tím tái Bên cạnh đó, phù nề gây tắc nghẽn tĩnh mạch Huyết khối khơng hồn tồn cản trở dịng chảy tĩnh mạch thường khơng có triệu chứng Thrombus liên quan đến tĩnh mạch vùng chậu, phân nhánh chậu thường kết hợp với phù nề chi hai bên Tình trạng tắc nghẽn không đầy đủ thường dẫn đến phù nề song phương nhẹ chi, bị nhầm lẫn với phù nề bệnh hệ thống tải chất lỏng, suy tim sưng huyết Đau dọc theo tĩnh mạch sâu phần đùi gợi ý HKTMS Đau bị giới hạn khu vực cụ thể thường không HKTMS gợi ý chẩn đoán khác [3] 1.1.2.Nguyên nhân gây bệnh Năm 1856, Virchow quy định thương tổn thành mạch, thay đổi dòng chảy khả tăng đơng máu ngun nhân hình thành huyết khối Khái niệm sinh lý bệnh hiệu lực ngày Huyết khối tĩnh mạch hình thành lúc dịng chảy thấp căng thẳng cắt thấp chủ yếu bao gồm sợi fibrin, hồng cầu vài tiểu cầu Thơng thường, thrombin hình thành túi van tĩnh mạch bắp chân kéo dài đến tĩnh mạch gần Áp lực tĩnh mạch mao mạch tăng sau hình thành huyết khối làm tăng tốc độ lọc xuyên màng, dẫn đến phù nề [1] Cho đến thời điểm tại, tỷ lệ HKTMS báo cáo khoảng 100 100.000 người năm [3], tỷ lệ tăng theo độ tuổi, tỷ lệ tái phát HKTMS cao nam giới so với phụ nữ [9] HKTMS phổ biến người da đen gốc Tây Ban Nha so với người da trắng Tỷ lệ mắc huyết khối tĩnh mạch sâu dân số châu Á thấp Dữ liệu liên quan tần suất huyết khối tĩnh mạch sâu xuất phát từ nghiên cứu lớn cộng đồng chúng chủ yếu phản ánh triệu chứng bệnh không triệu chứng Trong tổng quan hệ thống, tỷ lệ mắc huyết khối tĩnh mạch sâu dân số nói chung 0.5 1000 người/năm Rối loạn gặp trẻ 15 tuổi, tần suất tăng theo tuổi, với tỷ lệ mắc 1000 người 1,8 65-69 tuổi 3.1 tuổi 85-89 Hai phần ba số lần khảo sát huyết khối tĩnh mạch sâu yếu tố bao gồm phẫu thuật, ung thư, bất động nhập viện lý khác [1] Ở bệnh nhân bị huyết khối tĩnh mạch sâu tự phát đầu tiên, khả tái phát hàng năm 5-15%, với tỷ lệ tái phát tích lũy khoảng 25% sau năm [11] Nguy thấp bệnh nhân bị huyết khối tĩnh mạch sâu sau phẫu thuật Sự phát triển HKTMS tăng lên số yếu tố nguy di truyền từ yếu tố bên mắc phải, phổ biến sau: + Tuổi: Tỷ lệ mắc HKTMS tăng theo độ tuổi gặp trẻ nhỏ [3] + Phẫu thuật chỉnh hình: HKTMS phổ biến bệnh nhân bị gãy chi sau phẫu thuật chỉnh hình lớn Ở bệnh nhân này, HKTMS đề xuất có liên quan đến chấn thương thành mạch máu, bất động, đường đơng máu kích hoạt [5-7] Trong nghiên cứu kết lâm sàng bệnh nhân trải qua phẫu thuật chỉnh hình lớn, tỷ lệ mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch có triệu chứng 3,2% tắc mạch phổi gây tử vong, 0,1% [1-3] + Chấn thương: Tỷ lệ mắc HKTMS cao bệnh nhân bị gãy xương mức thấp so với người bị chấn thương vị trí khác (như vùng bụng, mặt ngực) HKTMS bệnh nhân bị chấn thương phức tạp, ví dụ diện bệnh đông máu sớm làm rối loạn điều trị chống đơng máu Những bệnh nhân bị chấn thương nặng có nguy mắc HKTMS cao gấp sáu lần so với người bị chấn thương nhẹ [7-9] Ở bệnh nhân chấn thương cột sống (62%), gãy xương chậu (61%) gãy chân (80%), thấp (19%) người có phơi thạch cao chi [1] + Ung thư: Tỷ lệ mắc HKTMS cao bệnh nhân ung thư, tỷ lệ mắc HKTMS xác thay đổi tùy theo đặc điểm sinh học khối u Hơn nữa, bệnh nhân trải qua điều trị tích cực cho ung thư, chẳng hạn hóa trị, có liên quan với tăng nguy HKTMS, có lẽ ức chế hoạt động protein C S [9-11] + Nguyên nhân khác: Bất động, phẫu thuật, nhập viện, mang thai, liệu pháp hormon, béo phì, thừa hưởng mắc phải trạng thái tăng đông, gây mê, nhồi máu tim, tiền sử HKTMS, giãn tĩnh mạch, nhiễm trùng, viêm ruột suy thận yếu tố nguy thường gặp HKTMS [2-3] Tuy nhiên, đường trung tâm, bệnh hồng cầu hình liềm, nhiễm trùng nặng trạng thái tăng đông máu cho yếu tố nguy tiềm tàng HKTMS trẻ em 1.2 GEN SERPINC1 SERPINC1 nằm nhiễm sắc thể 1q23-25, chứa exon intron, kéo dài 13578 bp genomic DNA Cho đến nay, 250 đột biến gen SERPINC1 báo cáo có liên quan đến thiếu hụt antithrombin Phổ đột biến gen SERPINC1 không đồng nhất, thường bao gồm đột biến điểm, biến thể vị trí mối nối đột biến chèn / xóa nhỏ, xếp lại tổng thể chiếm tỷ lệ nhỏ Gen SERPINC gen mã hóa cho việc tổng hợp protein gọi antithrombin (trước gọi antithrombin III), loại chất ức chế serine protease (serpin) Serpins giúp kiểm sốt số loại phản ứng hóa học cách ngăn chặn hoạt động số protein định Antithrombin tìm thấy máu quan trọng việc kiểm sốt đơng máu Antithrombin ngăn chặn hoạt động protein thúc đẩy đông máu, đặc biệt protein gọi thrombin Antithrombin gắn (liên kết) với thrombin số protein đông máu khác, sau loại bỏ khỏi máu gan Trong phần antithrombin liên kết với thrombin protein đông máu khác, phần khác protein liên kết với chất gọi heparin Antithrombin thay đổi hình dạng nó liên kết với heparin Sự thay đổi hình dạng cho phép antithrombin làm bất hoạt protein đông máu với tốc độ nhanh nhiều [2] Theo nghiên cứu cho thấy hầu hết trường hợp, thiếu hụt antithrombin giải thích đột biến gen SERPINC1 Hoạt tính antithrombin mức kháng nguyên đo Xét nghiệm tỷ lệ gắn kết heparinantithrombin sử dụng để phân biệt phân nhóm khác thiếu hụt antithrombin loại II Đột biến SERPINC1 phát cách giải trình tự trực tiếp exon vùng quy định khuếch đại đầu dò phụ thuộc vào hệ thống ghép kênh [2] Thiếu hụt antithrombin phân loại thành loại I (khiếm khuyết định lượng) loại II (khiếm khuyết định tính) Loại I đặc trưng giảm song song mức kháng nguyên hoạt động chức Loại II đặc trưng mức độ hoạt động thấp mức độ kháng nguyên antithrombin bình thường Tùy thuộc vào vị trí đột biến gen antithrombin, SERPINC1, thiếu loại II phân chia thêm loại II RS (vị trí phản ứng), HBS loại II (vị trí gắn heparin) PE loại II (hiệu ứng pleiotropic) [2] Mặc dù nằm vịng lặp trung tâm phản ứng, khơng thể gọi đột biến RS Thay vào đó, đột biến tạo thành lớp số đột biến loại II Thiếu hụt Antihrombin hiếm: tỷ lệ lưu hành người hiến máu khỏe mạnh tìm thấy khoảng 1: 500 đến 1: 645 , bệnh nhân bị huyết khối tĩnh mạch tỷ lệ mắc 1-5% 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CÚU Ở VIỆT NAM Trong nghiên cứu trước đây, lần mô tả đột biến p.G389S gen PROC bệnh nhân bị HKTMS tái phát Đột biến kèm với đột biến p.R189W, vốn đột biến phổ biến giới Đột biến dị hợp tử đôi di truyền từ bố mẹ, làm giảm đáng kể hoạt tính proten C bệnh nhân nguyên nhân gây HKTMS Trong nghiên cứu này, quy trình giải trình tự gen SERPINC1 mã hố cho antithrombin III thiết lập ứng dụng vào chẩn đoán lâm sàng cho bệnh nhân bị HKTMS CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU  Tiêu chuẩn chọn mẫu: Mẫu chẩn đoán lâm sàng bị huyết khối tĩnh mạch sâu thu nhận từ Bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM lưu trữ Trung tâm Y Sinh học phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM  Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu 2.2 CỠ MẪU Toàn thời gian nghiên cứu 2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực tại Trung Tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP.HCM 2.4 THỜI GIAN THU THẬP MẪU Từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 04 năm 2019 2.5 VẬT LIỆU Thiết bị: Máy li tâm, pipet, bồn ủ nhiệt, máy NanoDrop2000, máy Eppendorf, Mastercycler pro PCR System, máy điện di (Takara, Nhật Bản), hệ thống phân tích lưu kết điện di GelDoc-It® Imager hãng UVP, hệ thống giải trình tự Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer, số thiết bị khác + Hóa chất cần thiết cho quy trình tách chiết DNA (gDNA) gene: QIA amp DNA Blood Minikit gồm proteinase K, dung dịch ly giải (Lysis Buffer), dung dịch rửa (BL Buffer, Wash Buffer), dung dịch thu nhận DNA (Elution Buffer), ethanol 100% + Hóa chất PCR: Takara TaqTM Hot Start Polymerase (Takara Bio) Primer forward 10X, Primer reverse 10X, dd H2O dùng riêng cho phản ứng PCR + Hóa chất cần thiết cho trình điện di: Agarose dạng bột (Promega), dung dịch TBE 0,5X, Gelred (Thermo Scientific), thang DNA 1kb plus (0,1 µg/µl) (Thermo Scientific) + Hố chất cần cho q trình tinh giải trình tự gen: Enzyme Exo-SAP II, nước cất khử ion, NH4OAC, Ethanol 100%, Ethanol 70%, Sequencing buffer, Bigdye, Hidi 2.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU + Khảo sát in silico: Khai thác thông tin dựa vào ngân hàng sở liệu NCBI, sử dụng công cụ Pubmed để tìm kiếm báo liên quan cách sử dụng từ khóa như: DVT, PE, Protein S,C gene SERPINC1 Dựa vào thông tin cung cấp báo tiến hành thu thập tình hình lâm sàng bệnh giới Việt Nam Thu nhận trình tự tiến hành đánh giá cặp mồi phần mềm IDT analyzer, tiêu chuẩn đánh giá mồi: chiều dài , %GC, Tm, ∆G (kcal/mole) + Quy trình thực nghiệm: Tách chiết DNA theo QIAamp DNA Blood Mini kit, kiểm tra độ tinh DNA tách chiết, khuếch đại trình tự gen mục tiêu, quy trình cycle sequencing, quy trình tủa sản phẩm cycle sequencing, giải trình tự hệ thống giải trình tự Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SERPINC1 Các cặp mồi dùng nghiên cứu thể bảng sau Bảng 3.1 Thông tin mồi dùng nghiên cứu Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen khuếch đại (bp) SERPINC1-1F ACCAGTTTTCAGGCGGATTG SERPINC1-1R TTCCTGTGAGTCCTTTGGAG SERPINC1-2F TGGAATCCTCTGCTTTACTG SERPINC1-2R TTGAGGAATCATTGGACTTG SERPINC1-3F TCACCACCCATGTTAACTAG SERPINC1-3R CTCAATCTCTGAGTGGAGAG SERPINC1-4F GAAAATGGAGAAGCCAATTG SERPINC1-4R AGCTGAAGAGCAAGAGGAAG SERPINC1-5F TCAATAACTATCCTCCTATG SERPINC1-5R ACTCTTCCACTTTTGGTCAG SERPINC1-6F TTCCCATCTGTGGGTTGAAG SERPINC1-6R ACGTGTTCCTGCTGTTCATG SERPINC1-7F TTACCTGCCAAAAATGAACG SERPINC1-7R ACCAAAAATAGGAAGAGGTG Exon (181) Exon (542) Exon (337) Exon (251) Exon (763) Exon (195) Exon (276) Đánh giá cặp mồi: có chiều dài từ 19-20bp Nhiệt độ nóng chảy hai mồi chênh lệch không 5oC, nhiệt độ hai mồi nằm khoảng cho phép %GC nằm khoảng 40-60% Vì thơng số vật lý cặp mồi ngồi đạt yêu cầu dùng để khuếch đại vùng gene mục tiêu Từ thông số vật lý xác định bảng cho thấy cặp mồi khuyếch đại trình tự mục tiêu SERPINC1 đạt yêu câu mặt vật lý Kết tách chiết DNA: Mẫu máu thu nhận từ bệnh viện Đại học Y dược bảo quản sau tiến hành tách chiết DNA theo QIA amp DNA Blood Minikit 10 Kết tách chiết, tinh DNA đo mật độ quang bước sóng 260, 280nm Kết sau: Bảng 3.2: Kết định lượng DNA sau tách chiết Kí hiệu A260nm A280nm A260/280 C(μg/ml) SERPINC 0,67 0,3 1,90 33,5 Dựa vào kết đo OD phía nhận thấy tỉ lệ A260/280 1.9 thông số ghi nhận đạt tiêu chuẩn nằm khoảng từ 1.8-2.0 kết luận mẫu không bị nhiễm protein hay RNA, nồng độ DNA tương đối cao 33.5 đủ điều kiện để thực bước Sau thực PCR, kết khuếch đại gen SERPINC1 sau Hình 3.1: Kết PCR gen SERPINC1 Kết điện di cho thấy, băng 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 có kích thước là181bp, 542bp, 337bp, 251bp, 763bp, 195bp 276bp phù hợp với kích thước đoạn gen mục tiêu cần khuếch đại, khơng có băng kí sinh Giếng chứng âm khơng bị nhiễm 11 3.2 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN SERPINC1 TRONG BỆNH HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU Các sản phẩm PCR giải trình tự hệ thống Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer để tìm đột biến Kết mơ tả hình sau đây: Hình 3.2: Giải trình tự exon 12 Kết giải trình tự exon cho thấy khơng có bất thường ghi nhận so với trình tự quy chiếu Hình 3.3: Giải trình tự exon Kết giải trình tự exon cho thấy có đột biến dị hợp tử c.283T>C (p.Tyr95His) gen SERPINC1 bệnh nhân đột biến dị hợp tử c.314_317del 13 (p.N105fsX112) bệnh nhân khác Các kết giúp tư vấn di truyền cho thành viên gia đình bệnh nhân Hình 3.4: Giải trình tự exon Ngồi ra, exon phát biến thể khơng làm thay đổi amino acid, biến thể c.981A>G c.1011A>G 14 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Quy trình giải trình tự gen SERPINC1 kỹ thuật Sanger thiết lập phát đột biến thay nucleotid bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu Quy trình xét nghiệm gen SERPINC1 kỹ thuật Sanger chuẩn hóa nên ứng dụng vào lâm sàng cho khoa có điều trị bệnh nhân bệnh huyết khối tĩnh mạch 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Paul A Kyrle, Sabine Eichinger, “Deep vein thrombosis”, Lancet 2005; 365: 1163-74 Rene Mulder, F Nanne Croles, Andre B Mulder, James A Huntington, Karina Meijer and Michael V Lukens, “SERPINC1 gene mutations in antithrombin deficiency” Abdulrahman Abas Osman, “Weina Ju, Dahui Sun, Baochng Qi, Deep venous thrombosis: a literature review”, Int J Clin Exp Med 2018;11(3):1551-1561 Rogier M Bertina, “Elevated Clotting Factor Levels and Venous Thrombosis”, Pathophysiology Haemost Thromb 2003/2004; 33: 399-400 Caldeira D, Rodrigues FB, Barra M, Santos AT, de Abreu D, Gonỗalves N, Pinto FJ, Ferreira JJ, Costa J Non-vitamin K antagonist oral anticoagulants and major bleeding-related fatality in patients with atrial fibrillation and venous thromboembolism: a systematic review and meta-analysis Heart 2015; 101: 12041211 Yang SD, Ding WY, Yang DL, Shen Y, Zhang ZY, Feng SQ, Zhao FD Prevalenceand risk factors of deep vein thrombosis in patients undergroing lumbar interbody fusion surgery: a single center cross sectional study Medicine 2015; 94: e2205 Musil D, Kaletová M, Herman J Venous thromboembolism prevalence and risk factors in chronic venous disease patients Phlebology 2017; 32: 135-140 Jill J.Belch, G.D O.Lowe, AgnesG.Ward, C.D.Forbes and C.R.M Prentice (1981), “Prevention of deep vein thrombosisin medical patients bylowdoseheparin”, Scott Med J 1981; 26: 115-117 Kyrle PA, Minar E, Bialonczyk C, Hirschl M, Wel- termann A, Eichinger S The risk of recurrent venous thromboembolism in men and women N Engl J Med 2004; 350: 2558-2563 10 DINO W, RAMZI, M.D., C.M., and KENNETH V.LEEPER, M.D., Emory University School of Medicine, Atlanta, Georgia, “DVT and Pulmonary Emobolism: Part I Diagnosis”, Practical Therapeutics 11 Murayama Y, Sano I, Doi Y, Iwasaki R, Chatani T, Horiki M, Kitada M, Okuno M, Kondo S, Fu- kuda H, Kashihara T A case of type gastric cancer with peritoneal dissemination compli- cating venous thromboembolism treated ef- fectively by combination of S-1 and warfarin Gan To Kagaku Ryoho 2010; 37: 311-314  ... chẩn đốn phân tử bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu MỞ ĐẦU Huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) định nghĩa phát triển huyết khối tĩnh mạch sâu xương chậu chi [5] Chấn thương nội mô mạch gây lưu lượng... đột biến gen SERPINC1 bệnh HKTMS góp phần chuẩn đốn xác đưa cách điều trị hiệu CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU 1.1.1.Sơ lược bệnh huyết khối tĩnh mạch. .. chung: Khảo sát đột biến gen SERPINC1 bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu + Mục tiêu cụ thể: 1) Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự gen SERPINC1 2) Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen SERPINC1 vào