Xây dựng mô hình toán học giúp nhận biết chất ức chế Enzym Histon Deacetylase 2 có tác dụng chống ung thư

Dựa trên công thức hóa học của một chất đã có tác dụng ức chế HDAC2 mạnh là SAHA (Suberoylanilide hydroxamic acid hay còn gọi là Vorinostat), chúng tôi tìm kiếm[r]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC

NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG MƠ HÌNH TỐN HỌC GIÚP NHẬN BIẾT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

CÓ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG MƠ HÌNH TỐN HỌC GIÚP NHẬN BIẾT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE CÓ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: TS LÊ THỊ THU HƢỜNG 2 TS PHẠM THẾ HẢI

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lê Thị Thu Hường, công tác môn Dược liệu Dược học cổ truyền - khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội người thầy tận tình bảo, động viên, hướng dẫn để tơi hồn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Thế Hải công tác Trường Đại học Dược Hà Nội bảo tận tình cho tơi từ bước ban đầu nhận đề tài

Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi làm khóa luận, học tập, nghiên cứu, rèn luyện Khoa suốt năm học qua

Sau cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em bạn bè sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tơi q tình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn

Dù cố gắng kiến thức, kỹ thời gian thực cịn hạn hẹp, tơi khó tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khóa luận tơi hồn thiện

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, Ngày tháng năm 2017 Sinh Viên

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt

CSDL Cơ sở liệu

FDA Food and Drug

Administation

Cơ quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ

HAT Enzym Histon

Acetyltransferase

HDAC Histon deacetylase

HDAC2 Histon deacetylase

IC50 The half maximal

inhibitory concentration

Nồng độ ức chế 50%

MLR Multiple Linear

Regression

Phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến

Q2 Hệ số tương quan chéo

Q2ext Hệ số xác định cho tập

kiểm tra

QSAR Quantitative Structure – Activity Relationship

Tương quan định lượng cấu trúc – tác dụng

R2 Hệ số xác định

SAHA Suberoylanilide

hydroxamic acid

Te Test set Tập kiểm tra

TSPT Tham số phân tử

UHDAC Chất ức chế histon

DANH MỤC HÌNH VẼ

STT Kí hiệu Tên hình Trang

1 Hình 1.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã (a) Sự methyl hóa deacetyl hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn nhiễm sắc thể ức chế phiên mã (b) Sự acetyl hóa demethyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể cho phép phiên mã

7

2 Hình 1.2 Cấu tạo trung tâm hoạt động HDAC nhóm I, II, IV

8

3 Hình 2.1 Cấu trúc hóa học 45 dẫn xuất acid hydroxamic thu thập

19

4 Hình 3.1 Miền ứng dụng mơ hình QSAR xác định hợp chất có khả ức chế HDAC2

28

5 Hình 3.2 Tóm tắt quy trình sàng lọc in silico chất ức chế HDAC2 từ CSDL PubChem

DANH MỤC BẢNG

STT Ký hiệu Tên bảng Trang

1 Bảng 1.1 Các nhóm thuốc chống ung thư 5 2 Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC thử nghiệm

lâm sàng

12

3 Bảng 2.1 Giá trị IC50 thực nghiệm 45 hợp chất CSDL

20

4 Bảng 3.1 Kết đánh giá nội đánh ngoại mơ hình QSAR

28

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU

Chƣơng 1- TỔNG QUAN

1.1 Thực trạng ung thư tử vong ung thư

1.1.1 Thực trạng ung thư tử vong ung thư giới

1.1.2 Thực trạng ung thư tử vong ung thư Việt Nam

1.2 Thuốc điều trị ung thư

1.3 Tổng quan histon deacetylase

1.3.1 Khái niệm histon deacetylase

1.3.2 Phân loại HDAC

1.3.3 HDAC2 vai trò ung thư

1.3.4 Các chất ức chế HDAC 11

1.3.5 Cơ chế tác dụng chất ức chế HDAC 13

1.4 Tổng quan phương pháp QSAR 13

1.4.1 Lịch sử QSAR 13

1.4.2 Đại cương QSAR 14

1.4.3 Quy trình xây dựng mơ hình QSAR 15

Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu 19

2.1.1 Cơ sở liệu 19

2.1.2 Phần mềm sử dụng 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Tính tốn tham số mơ tả phân tử 20

2.2.2 Phân chia tập huấn luyện / Tập kiểm tra 21

2.2.4 Sàng lọc dự đốn hoạt tính số dẫn xuất HDAC2 sử dụng mơ

hình QSAR xây dựng 21

Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Kết 23

3.1.1 Mơ hình tốn học thu 23

3.1.2 Đánh giá mơ hình theo tiêu chí OECD 27

3.1.3 Sàng lọc ảo đánh giá khả ức chế HDAC2 sử dụng mơ hình xây dựng 29

3.2 Bàn luận 34

3.2.1 Về mơ hình QSAR 34

3.2.2 Về quy trình sàng lọc ảo 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Theo thống kê tổ chức Y tế giới (WHO), ung thư trở thành bệnh giết người hàng đầu giới, với khoảng 14 triệu ca phát 8,2 triệu trường hợp tử vong năm (số liệu tính đến hết năm 2012) So với giới Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ mắc bệnh cao nhiều loại ung thư ớc tính năm Việt Nam có khoảng 150 - 200 nghìn người phát bị ung thư, 70.000 trường hợp tử vong

Trước tình hình đó, việc nghiên cứu phát triển thuốc chống lại ung thư mối quan tâm hàng đầu ngành công nghiệp dược phẩm giới Việt Nam Tuy nhiên, trình nghiên cứu phát triển thuốc nói chung thuốc điều trị ung thư nói riêng chủ yếu dựa phương pháp kinh điển hay phương pháp “thử lỗi” với nhược điểm tốn thời gian, tiền bạc cho hiệu thấp [22] Ngoài ra, thuốc điều trị ung thư gặp nhiều vấn đề liên quan đến độc tính tỷ lệ kháng thuốc cao Do yêu cầu cấp bách đặt phải nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư mới, có tác dụng chọn lọc đích phân tử nhằm phát huy tối đa hiệu quả, lâu bị kháng độc

Histon deacetylase (HDAC) đích phân tử ch nay, enzym x c tác cho q trình deacetyl hố nhóm -N acetyl lysine amino acid phần đuôi histon Người ta chứng minh nhiều tế bào ung thư có huy động mức enzym HDAC, gây nên tượng giảm acetyl hoá histon Các chất ức chế HDAC ngăn chặn q trình thơng qua việc làm thay đổi biểu gen gây ung thư hay gen ức chế khối u gây cường acetyl hóa protein histone [32] Hiện người ta biết đến 18 loại HDAC khác nhau, chia thành nhóm, HDAC2 thuộc nhóm I đánh giá đích phân tử quan trọng có vai trị q trình deacetyl hố histon H3K56 H4K16 xảy hầu hết dòng tế bào ung thư người [7,10]

quan mối quan hệ cấu trúc – tác dụng dược lý xuất từ năm 1868, biết đến mơ hình tốn học định lượng mối liên quan tác dụng dược lý cấu trúc hóa học hợp chất hay cịn gọi QSAR Xây dựng mơ hình QSAR để dự đốn hoạt tính phân tử chưa kiểm tra Từ gi p tìm kiếm hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, tối ưu hóa cấu tr c hợp chất nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng tính chất dược động học thuốc Phương pháp nhìn chung nhanh có tính kinh tế hỗ trợ tốt cho nghiên cứu thực nghiệm, giúp nâng cao tỷ lệ thành công nghiên cứu

Từ vấn đề nêu trên, mục tiêu chung nghiên cứu “Xây dựng mơ hình toán học giúp nhận biết chất ức chế enzym histon deacetylase có tác dụng chống ung thư” Với mục tiêu cụ thể:

- Xây dựng mơ hình QSAR sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính nhằm dự đoán khả ức chế HDAC2

- Đánh giá mơ hình xây dựng theo tiêu chí Tổ chức kinh tế

thế giới (OECD)

Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1.1 Thực trạng ung thƣ tử vong ung thƣ

1.1.1 Thực trạng ung thư tử vong ung thư giới

Ung thư nguyên nhân hàng đầu gây tử vong tồn giới Trong năm 2012, có khoảng 14 triệu trường hợp ung thư phát có đến 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thư [40] Trong đó, số lượng ca tử vong ung thư chủ yếu là: ung thư phổi (1,59 triệu ca), ung thư gan (745000 ca), ung thư dày (723000 ca), ung thư đại trực tràng (694000 ca), ung thư v (521000 ca), ung thư thực quản (400000 ca) [40]

Số lượng ca ung thư dự đoán tăng khoảng 70% vịng hai thập kỉ tới Dự đốn số trường hợp ung thư hàng năm tăng từ 14 triệu 2012 lên 22 triệu vòng hai thập kỉ tới [2] Hơn 60% số ca ung thư hàng năm giới xảy Châu Phi, Châu Á, Trung Nam Mỹ, chiếm 70% số ca tử vong ung thư giới [40]

Đối với nam giới, ung thư phổ biến chẩn đoán năm 2012 ung thư phổi, tuyến tiền liệt, đại trực tràng, dày gan Đối với nữ giới, ung thư phổ biến chẩn đoán ung thư v , đại trực tràng, phổi, cổ tử cung, dày

1.1.2 Thực trạng ung thư tử vong ung thư Việt Nam

Ở Việt Nam, năm 2012, số lượng ung thư gặp phổ biến nam giới gan 16.815 ca, phổi 16.082 ca, dày 9.406 ca, đại trực tràng 4.561 ca mũi họng 3.301 ca; ung thư gặp phổ biến nữ giới là: vú 11.067 ca, phổi 5.783 ca, gan 5.182 ca, cổ tử cung 5.146 ca dày 4.797 ca [39]

Ở Việt Nam, tổng số ca tử vong ung thư năm 2012 91.600 ca, đó: số nam giới tử vong ung thư 58.200 ca: ung thư gan chiếm 26,9%, phổi 24,4%, dày 14,5%, miệng - thực quản 5,8%, đại trực tràng 5,2% ung thư khác 23,2%; số nữ giới tử vong ung thư 33.400 ca: ung thư phổi chiếm 14,5%, gan 13,7%, v 12,5%, dày 12,1%, đại trực tràng 8% ung thư khác 39,3% [39]

1.2 Thuốc điều trị ung thƣ

Ngày có nhiều phương pháp điều trị ung thư, gồm có phẫu thuật, vật lí trị liệu (xạ trị liệu), hóa trị liệu (dùng thuốc điều trị ung thư), nội tiết, miễn dịch [1] Tuy nhiên áp dụng phương pháp để điều trị có hiệu cịn tuỳ thuộc vào giai đoạn, vào sức chịu đựng thể, vào khả sở điều trị phần vào kinh nghiệm thầy thuốc chuyên khoa

Có khoảng 200 loại thuốc chống ung thư lâm sàng [1] Theo chế hoạt động, thuốc chống ung thư phân loại bảng 1.1 [1]

Bảng 1.1 Các nhóm thuốc chống ung thư

Nhóm tác nhân Mục tiêu Cấu trúc hóa học

Các tác nhân ngăn chặn tổng hợp DNA alkyl hóa có nguồn gốc tổng hợp (các tác nhân alkyl hóa)

Liên kết chéo DNA Nitrogen mustard Ethyle limin

Sulfonic acid ester Epoxide

Nitrosourea

Halogenated hexitol Hợp chất platinum Kháng sinh kháng u Xen DNA làm đứt gãy

DNA

Anthracyclin, Actinomycin D, Mitomycin C, Bleomycin Các kháng chuyển

hóa

Sinh tổng hợp acid nhân Các kháng acid Folic, kháng Purin, kháng Pirimidin, ức chế tổng hợp protein acid amin

Các ức chế giai đoạn gián phân hình thoi

Ngăn cản hình thức thoi kì gián phân

Alkaloid nhóm vinca Podophylin

Colchicin

Hỗn hợp Không xác định Alkylamin (HMM, PMM)*

Dacarbazin Procarbazin Các Taxane Làm đông cứng vi quản

Các camptothecin Ức chế men topoisomerasa I Camptothecin, CPT - 11 Các hormone Androgen

Estrogen Steroid Progestin

Các thuốc tác dụng lên tuyến yên

Antiandrogen

Estrogen Antiestrogen Antisteroid

* HMM: Hexamethylmelamine PMM: Pentamethylmelamine 1.3 Tổng quan histon deacetylase

1.3.1 Khái niệm histon deacetylase

Nhiễm sắc thể phức hợp gồm thành phần: ADN, protein histon protein histon [21] Đơn vị nhiễm sắc thể nucleosom Mỗi nucleosom gồm 146 cặp base ADN gói protein histon octame [16] tạo thành phần: H2A, H2B, H3, H4 [13]

Các đầu amino protein histon thường bị biến đổi q trình methyl hóa, phosphoryl hóa acetyl hóa sau dịch mã Q trình acetyl hố chế điều hồ biểu thị gen Kiểm sốt q trình biểu thị gen phụ thuộc vào cân hoạt động enzym histon acetylase enzym histon deacetylase, nhờ vào điều hồ q trình acetyl hố lysin phần đuôi histon [6]

Histon acetyltrasferase (HAT) enzym acetyl hóa nhóm -NH2 gốc lysin (đầu N tận) histon, làm trung hịa điện tích dương lysin, giảm khả tương tác histon với ADN (tích điện âm) tạo cấu trúc mở chromatin Vì vậy, acetyl hóa histon tạo điều kiện cho trình phiên mã, dịch mã xảy (hình 1.1b) [6,21]

Hình 1.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã (a) Sự methyl hóa deacetyl hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn nhiễm sắc thể

và ức chế phiên mã (b) Sự acetyl hóa demethyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể cho phép phiên mã

1.3.2 Phân loại HDAC

Hiện người ta biết đến 18 loại HDAC khác nhau, chia thành nhóm: I, II, III, IV HDAC nhóm I, II IV gọi HDAC “kinh điển” thường sử dụng để sàng lọc thiết kế chất ức chế HDAC [43]

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 Các enzym có phần nhân nhiều loại tế bào

Nhóm II: gồm nhóm IIa nhóm IIb Trong nhóm IIa có HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, nhóm IIb có HDAC6, HDAC10 Các enzym biểu thị mơ đặc trưng, có khả di chuyển bào tương nhân

Nhóm III: Các protein điều hồ chuỗi thông tin (SIRT): SIRT – 7, chúng có bào tương, ty thể nhân

Nhóm IV: HDAC11, có phần nhân nhiều loại tế bào

Trung tâm hoạt động HDAC gồm phần (Hình 1.2): ion Zn2+ coenzyme HDAC kênh enzym dạng túi hình ống Cấu trúc linh động, biến đổi phù hợp với chiều dài chất khác Trên miệng túi có vành nhỏ tạo nên từ vài vòng xoắn protein, phần vành tương tác với nhóm nhận diện bề mặt HDAC [18]

Hình 1.2 Cấu tạo trung tâm hoạt động HDAC nhóm I, II, IV

1.3.3 HDAC2 vai trò ung thư

Histon deacetylasa (HDAC2) thuộc HDAC nhóm I HDAC2 hoạt động chất ức chế phiên mã thơng qua loại bỏ nhóm lysine đầu N protein histon (H2A, H2B, H3 H4) Tuy nhiên HDAC2 không liên kết với ADN nên chúng chọn lọc yếu tố phiên mã YY1, SP1/SP3, gen ức chế khối u p53 BRCA1 HDAC2 gắn vào ADN phần phức hợp CoREST, mSin3 NuRD Những phức hợp mục tiêu với trình tự gen đặc hiệu tương tác với yếu tố phiên mã trình tự đặc hiệu Ví dụ, HDAC2/HDAC1 chứa phức hợp Sin3-SAP chọn lọc họ E2F yếu tố phiên mã để ức chế phiên mã [17]

chẳng hạn MeCp2 – protein có nhóm liên kết methyl Các enzyme vận chuyển nhóm methyl DNA DNMT1, DNMT3A DNMT3B, methyl transferases histone SUVAR39H1 G9a histon bị bỏ nhóm methyl (LSD1), cho thấy cách khác mà HDAC2 quy định biểu gen sửa chữa nhiễm sắc

HDAC2 quy định biểu gen thông qua deacetyl yếu tố phiên mã cụ thể bao gồm STAT3 SMAD7 HDAC2 chìa khóa quan trọng gen điều hòa chu kỳ tế bào, trình tế bào tự tiêu diệt, kết dính tế bào di cư Cùng với HDAC1, HDAC2 quy định việc phiên mã gen liên quan đến trình tạo máu, biệt hóa tế bào biểu mơ, phát triển tim tế bào thần kinh [34]

Các đột biến có HDAC2 xuất tế bào soma HDAC2 bị đột biến khối u lẻ tẻ khối u phát sinh người có ung thư biểu mơ đại trực tràng không polyp di truyền Đột biến cắt bỏ adenin exon1 tạo thành protein không hoạt động Sự biểu dạng đột biến HDAC2 gây kháng với tác dụng chất ức chế HDAC Việc thiếu biểu chức HDAC2 tạo nên tăng điều chỉnh gen th c đẩy tăng trưởng khối u [5,25]

HDAC2 liên quan đến nhiều bệnh ung thư khác nhau:

Việc điều hòa biểu hoạt động HDAC2 có liên quan đến phát triển ung thư HDAC2 biểu mức loại ung thư khác bao gồm đại tràng, dày, cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi không tế bào nhỏ ung thư biểu mô tế bào gan HDAC2 biểu hiên mức liên quan đến ung thư phần thông qua việc chọn lọc sai lầm im lặng gen ức chế khối u Sự ức chế gen p21WAF1 ức chế khối u vùng khởi động đảo ngược việc điều trị thuốc ức chế HDAC [31] Biểu HDAC2 tương quan với tiên lượng xấu bệnh giai đoạn tiên triển ung thư đại trực tràng, tuyến tiền liệt, dày biểu mô tế bào gan

tìm thấy mức độ protein mRNA HDAC2 mức hoạt hóa phiên mã Các nghiên cứu cho thấy loại khối u phiên mã HDAC2 điều chỉnh tín hiệu beta-catenin-TCF-myc bị xóa bỏ bệnh ung thư đại tràng HDAC2 biểu mức tương quan với tiên lượng xấu bệnh giai đoạn tiến triển ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, Ropero cộng tìm thấy đột biến bất hoạt HDAC2 ung thư đại tràng với bất ổn microsatellite [29]

Ung thư v : Các nghiên cứu khác cho thấy vai trò quan trọng HDAC2 ung thư v HDAC2 gây lão hóa tế bào ung thư v Hơn hoạt tính HDAC2 kéo theo q trình chết tế bào (apoptosis) tamoxifen estrogen/ progesterone tế bào ung thư v dương tính [27]

Bệnh ung thư tuyến tiền liệt: Theo nghiên cứu Weichert cộng thấy HDAC2 biểu mạnh mẽ 70% trường hợp phân tích ung thư tuyến tiền liệt Sự gia tăng biểu HDAC2 có liên quan với tăng cường tăng sinh tế bào khối u [5]

Ung thư biểu mô tế bào gan: HDAC2 quy định chu kỳ tế bào phân chia HDAC2 gây ngừng chuyển pha G1/S chu kỳ tế bào Trong trình chuyển đổi G1/S, phân chia đích HDAC2 có tính chọn lọc gây biểu p16 (INK4a) p21 (WAF1/Cip1), đồng thời ức chế biểu cyclin D1, CDK4 CDK2 Do đó, ức chế HDAC2 dẫn đến giảm điều chỉnh gen đích E2F/DP1 thơng qua việc giảm phosphoryl hóa protein PRB [5]

đích E2F/DP1 tế bào A549 HDAC2 trực tiếp điều chỉnh biểu hiên p21WAF/Cip1 không phụ thuộc p53 [5]

Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD): giảm hoạt động biểu HDAC2 tìm thấy bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) Việc giảm hoạt động HDAC2 làm tăng điều hòa gen liên quan đến phản ứng viêm kháng corticosteroid COPD [5]

1.3.4 Các chất ức chế HDAC

Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC thử nghiệm lâm sàng

Nhóm Hợp chất Pha Loại ung thƣ

Acid carboxylic Butyrat

AN-9 (tiền thuốc) Acid valproic Phenyl butyrate I, II I, II I, II I

Ung thư đại tràng Thể rắn, NSCLC

Thể rắn, ung thư máu, AML, MDS, CTCL, u trung biểu mô

Thể rắn, AML/MDS

Acid hydroxamic SAHA

PXD101 NVP-LAQ824 LBH-589 ITF-2357 SB-939 CRA 024781 JNJ-16241199 Đã c/m I, II II I II, III II I I I CTCL

Thể rắn, ung thư máu Ung thư máu

Thể rắn, ung thư máu Thể rắn, AML, ALL, MDS

U lympho Hodgkin Thể rắn, ung thư máu

Các benzamid SNDX-275

(MS-275) CI-994 MGCD-0103 I, II I, II II

Thể rắn, u lympho, AML, u hắc sắc tố ác tính di tiến triển

Thể rắn, NSCLC, tế bào thận, tuỵ

Thể rắn, ung thư bạch cầu, MDS

Peptid vòng Depsipeptid

(FK228)

I, II Thể rắn, CLL, AML, CTCL,

Trong đó:

NSCLC (Non-Small Cell Lung Cancer) : Ung thư phổi không tế bào nhỏ AML (Acute Myeloid Leukemia): Bệnh bạch cầu myeloid cấp tính MDS (Myelodysplastic Syndrome ): Hội chứng rối loạn sinh tủy CTCL (Cutaneous T Cell Lymphoma): U lympho tế bào T da NHL (non-Hodgkin's lymphoma): Ung thư hạch không Hodgkin RAI (Radioactive iodine): Iod phóng xạ

Tuy nhiên, nhóm nêu có hạn chế định như: acid hydroxamic bị chuyển hoá nhanh, ức chế không chọn lọc lên loại enzym HDAC; benzamid acid béo có hiệu lực kém; peptid vịng khó tạo thành mặt hố học FK-228 có phần gắn kết với ion Zn2+ chứa thiol [26]

1.3.5 Cơ chế tác dụng chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng chu trình tế bào làm điều hịa tế bào ác tính Trong đó, yếu tố then chốt định hoạt tính chống ung thư ch ng th c đẩy biệt hóa, ức chế chu trình tế bào th c đẩy chết tế bào Ngồi ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch ức chế tạo mạch vai trò quan trọng UHDA, gián tiếp ức chế phát triển khối u Ngoài chất ức chế HDAC ngăn cản histon có nhóm acetyl tiến đến vị trí xúc tác [7,9]

Vai trò sinh học HDAC nghiên cứu chất UHDA cho thấy mục tiêu quan trọng cần hướng tới điều trị ung thư Do đó, việc tìm kiếm hợp chất có tiềm ức chế HDAC hướng nhằm tìm kiếm hợp chất với khả ức chế cao hơn, độc tính hướng nhiều nhà khoa học quan tâm [21]

1.4 Tổng quan phƣơng pháp QSAR

1.4.1. Lịch sử QSAR

rằng khác tác dụng sinh học thay đổi tính chất lí hóa Đến năm 1935, phương trình quan trọng Hammett coi mơ hình biểu diễn mối quan hệt hoạt tính cấu trúc:

Log 

Với K, Ko số acid,  số Hammett, thơng số hóa l đặc trưng cho khả h t điện tử nhóm

QSAR thực nghiên cứu C.L Corwin Hansch từ năm 60 kỉ 20 Mơ hình QSAR Hansch thường sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến để biểu thị mối tương quan tham số hóa lí hoạt tính sinh học, ví dụ phương trình ông sau:

Log (1/C) = k1+ k22+ k3

Trong đó: C nộng độ mol mà hoạt chất thể hoạt tính sinh học, : số kỵ nước, : số Hammett, k1,k2,k3 hệ số hồi quy

Kể từ đây, có nhiều phương trình QSAR với phương pháp xây dựng đa dạng đời chiếm vai trò quan trọng nghiên cứu phát triển dược phẩm

1.4.2 Đại cương QSAR

Về mặt tốn học, mơ hình QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) biểu diễn mối tương quan định lượng cấu trúc phân tử hoạt tính thơng qua phương trình:

Y = f(x1) + f(x2) + + f(xn) (1.4.2)

Trong đó, Y là biến phụ thuộc, phản ánh hoạt tính sinh học hợp chất Giá trị Y được xác định thông qua nghiên cứu thực nghiệm, ví dụ nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym (IC50), MIC (Minimum

tác dụng tối đa Y cũng nhận giá trị rời rạc, ví dụ có hay khơng có hoạt tính, hoạt tính mạnh hay yếu Các biến x trong mơ hình QSAR gọi tham số phân tử (TSPT), mô tả đặc điểm cấu tr c phân tử hóa học.Hàm f là hàm mơ tả mối tương quan Y và biến x Để xây dựng hàm f, cần áp dụng thuật toán thống kê (statistical) học máy (machine learning) Một số kỹ thuật thống kê thường sử dụng xây dựng mơ hình QSAR kể đến bình phương tối thiểu phần (Partial Least Squares), hồi quy đa biến tuyến tính (Multiple Linear Regression), phân tích thành phần (Principal Component Analysis)

1.4.3 Quy trình xây dựng mơ hình QSAR

Các bước để xây dựng mơ hình QSAR [19] gồm:

1) Xây dựng sở liệu (CSDL); 2) Tính tốn tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc; 3) Xây dựng mơ hình QSAR: Sử dụng phương pháp xác suất thống kê kỹ thuật trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ tham số phân tử (TSPT) giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính; 4) Đánh giá mơ hình; 5) Giải thích kết sử dụng mơ hình q trình sàng lọc ảo (nếu có thể)

Xây dựng sở liệu: CSDL thường cấu trúc hợp chất hoá học chứng minh hoạt tính sinh học in vitro Để hạn chế yếu tố gây sai số cho mô hình, CSDL thường làm dựa tương đồng cấu trúc, protocol,

Tính tốn tham số mơ tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc:

Tham số mô tả phân tử số thu từ q trình tốn học lơgic chuyển đổi thơng tin mã hóa cấu trúc hóa học [37] Trong nghiên cứu này, tham số tính tốn sử dụng phần mềm Dragon [37]

Đánh giá mơ hình: Đánh giá mơ hình giai đoạn quan trọng liên quan đến khả ứng dụng mơ hình Đánh giá mơ hình thường sử dụng ngun tắc OECD [28]

- Ngun tắc 1: Có đích xác định (defined end-points)

Đích giá trị thực nghiệm hoạt tính sinh học thu từ CSDL Nếu toàn CSDL sử dụng protocol để xác định giá trị đích, mơ hình xây dựng có độ tin cậy cao, dùng để dự đốn hoạt tính hợp chất (nếu thực nghiệm dùng theo quy trình này) Cịn CSDL sử dụng nhiều protocol khác mơ hình khơng có độ tin cậy cao

- Ngun tắc 2: Các thuật tốn sử dụng mơ tả rõ ràng

Các thuật toán sử dụng để xây dựng mơ hình cần mơ tả rõ ràng, có khả ứng dụng để xây dựng mơ hình khác

- Ngun tắc 3: Có miền cấu trúc ứng dụng xác định

Miền cấu trúc ứng dụng khoảng không gian cấu tr c xác định hợp chất tập huấn luyện để xây dựng mơ hình Những hợp chất thuộc tập huấn luyện có cấu trúc nằm ngồi miền cấu trúc ứng dụng ảnh hưởng đến độ xác mơ hình Những hợp chất thuộc tập dự đốn, có cấu trúc nằm ngồi miền cho kết dự đốn khơng xác Các phương pháp xác định miền ứng dụng thường gặp như: phương pháp đòn bẩy, phương pháp ba lân cận gần nhất,

- Nguyên tắc 4: Có độ khớp, độ ổn định, khả dự đoán tốt

 Độ khớp hay độ tuyến tính đánh giá thông qua giá hệ số xác định R2, R2 cao mức độ khớp (tuyến tính) mơ hình với giá trị thực nghiệm tốt R2> 0,6 mơ hình có nghĩa Cơng thức tính hệ số xác định sau:

R2 = 1-

∑ yiy^i

Trong n số quan sát tập huấn luyện; yi,yi

^

, giá trị thực tế, giá trị dự đoán biến phụ thuộc quan sát thứ i; ylà giá trị thực tế trung bình biến phụ thuộc

 Độ ổn định đánh giá thông qua hệ số tương quan chéo Q2

, Q2 đánh giá dựa phương pháp tham số chéo (cross validation leave one out) cách loại quan sát khỏi tập huấn luyện, giữ nguyên biến lựa chọn tính tốn lại thơng số mơ hình Q2 gần 1, tính tổng qt hóa mơ hình cao, mơ hình ổn định Thơng thường, u cầu Q2

> 0,5 mơ hình bền vững Cơng thức hệ số tương quan chéo tính sau:

Q2 =

-∑ yiy^i/i

∑ (yiy)

Trong n số quan sát tập huấn luyện; yi, giá trị thực tế

quan sát thứ i; y^i/i giá trị dự đoán biến phụ thuộc quan sát thứ i sử dụng

mơ hình loại biến i; ylà giá trị thực tế trung bình biến phụ thuộc

 Khả dự đoán ngoại

Khả dự đốn ngoại đánh giá thơng qua giá trị Q2ext, Q

ext

càng lớn mơ hình cho thấy độ tuyến tính tập kiểm tra chứng tỏ khả dự đốn mơ hình cao

2

ext

Q =

-∑ yiy^i

∑ (yiy) Trong n số quan sát tập kiểm tra; yi,

^

y, giá trị thực tế, giá trị dự đoán biến phụ thuộc quan sát thứ i; ylà giá trị thực tế trung bình biến phụ thuộc

- Nguyên tắc 5: Giải thích chế (nếu có thể)

Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Cơ sở liệu

Cơ sở liệu (CSDL): gồm 45 hợp chất ức chế HDAC2 lựa chọn từ liệu xây dựng báo khoa học công bố trước với giá trị IC50

được xác định phương pháp giống (sử dụng Kit định lượng Bioscence®) [8,14,15,24,36,38] Cơng thức hóa học mơ tả hình 2.1 giá trị IC50 tương ứng nêu bảng 2.1

N O O O NHOH O X X=H X=Cl X=F X=Br X=H3C X=H3CO N O O O NHOH O Cl (7) (1-6) O H N N O N OH OH X X=H9 X=F

10 X=Cl 11 X=Br 12 X=H3C 13 X=H3CO O H N OH N O N OH Cl (8-13) (14) O H N N O N O CH3 OH X 15 X=H 16 X=F 17 X=Cl 18 X=Br 19 X=H3C 20 X=H3CO O H N OH N O N O CH3 Cl (15-20) (21) HOHN N O

O2S

X

HOHN

N O

O2S

OCH3 OCH3 22 X=H3CO 24 X=F 25 X=NO2 (22,24,25) (23) HOHN N O (26) N O H N OH O O N O H N OH O O F N O H N OH O O N HN O H N OH O O (27) (29) (30) (28) N O O O NHOH O X 31 X=H 32 X=F 33 X=Cl 34 X=Br 35 X=NO2 36 X=H3C 37 X=H3CO N O O O NHOH O Cl (31-37) (38) N S S O NHOH O N S S O NHOH O H3C

N H N NHOH O O O H N NHOH O O H N H N NHOH O O H N NHOH O O H N NHOH O O (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45)

Bảng 2.1 Giá trị IC50 thực nghiệm 45 hợp chất CSDL. STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM) 1 0,308 10 0.116 19 0.175 28 0.310 37 0.120 2 0,284 11 0.152 20 0.254 29 0.190 38 0.150 3 0,891 12 0.086 21 1,399 30 0.192 39 0.320 4 0,460 13 0.120 22 0.3618 31 0.160 40 0.260 5 0,358 14 0.179 23 0.002 32 0.060 41 2,457 6 0,870 15 0.117 24 0.199 33 0.030 42 1,987 7 1,779 16 0.447 25 0.189 34 0.030 43 2,015 8 0.116 17 0.472 26 0.381 35 0.080 44 0.105 9 0.152 18 0.267 27 0.270 36 0.160 45 5.784

2.1.2 Phần mềm sử dụng

Danh sách phần mềm sử dụng bao gồm:

1 ChemDraw phiên 10.0 Dragon 6.0 Mobydigs 1.0 Microsoft Excell 2007 STATISTICA 10.0

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Tính tốn tham số mơ tả phân tử

Entry System) việc sử dụng phần mềm ChemDraw phiên 10.0 [33] Căn vào mã code, 2000 mô tả phân tử thuộc họ 0D, 1D 2D tính tốn phần mềm Dragon phiên 6.0 [3]

2.2.2 Phân chia tập huấn luyện / Tập kiểm tra

Sau tính tốn mơ tả phân tử, CSDL chia ngẫu nhiên thành tập huấn luyện (Tr - training set) tập kiểm tra (Te – test set) Tập huấn luyện (chiếm 75% CSDL) sử dụng cho việc xây dựng (huấn luyện) mơ hình Tập huấn luyện cho phép phát mối quan hệ có khả dự đốn Cịn tập kiểm tra bao gồm phân tử mà mơ hình chưa gặp sử dụng để đánh giá độ mạnh khả ngoại suy mơ hình xây dựng

2.2.3 Xây dựng mơ hình QSAR

Tập huấn luyện gồm 75% số hợp chất CSDL lựa chọn ngẫu nhiên để xây dựng mơ hình QSAR Các hợp chất lại xếp vào tập kiểm nghiệm để đánh giá mơ hình Các mơ hình xây dựng phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính (MLR) sử dụng phần mềm STATISTICA 10.0, lựa chọn TSPT phương pháp thuật giải di truyền (Genetic algorithm) sử dụng phần mềm Mobydigs 1.0, sau đánh giá để lựa chọn mơ hình tốt

2.2.4 Sàng lọc dự đốn hoạt tính số dẫn xuất HDAC2 sử dụng mơ hình QSAR xây dựng

quả thu dãy dẫn xuất hydroxamic, lựa chọn hợp chất chưa nghiên cứu tác dụng ức chế HDAC2

Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết

3.1.1 Mơ hình tốn học thu

Mơ hình QSAR mơ hình biểu thị mối liên hệ định lượng cấu trúc hoạt tính hợp chất Mơ hình QSAR biểu diễn dạng phương trình tốn học (1.4.2) QSAR sử dụng TSPT, kỹ thuật xác suất thống kê trí tuệ nhân tạo để xây dựng mơ hình QSAR xây dựng dựa giả thuyết cấu trúc phân tử phải chứa đặc điểm cấu trúc liên quan tới tính chất hóa học, vật lý, sinh học dựa khả mô tả phân tử Bởi mô hình QSAR, hoạt tính sinh học phân tử chưa kiểm nghiệm suy từ cấu trúc hợp chất tương tự tính chất ch ng kiểm nghiệm [37]

Phương pháp QSAR xây dựng mô hình tốn học nhằm dự đốn hoạt tính hợp chất dựa cấu trúc hóa học chúng, kỹ thuật nhằm dự đoán kết trước thử nghiệm tiến hành phòng thí nghiệm QSAR cung cấp thơng tin dự đốn kết có thử nghiệm khả cung cấp yếu tố liên quan để thiết lập thứ tự ưu tiên cho chất cho thử nghiệm [35]

Như vậy, để xây dựng mơ hình cấu trúc hoạt tính phải định lượng hóa Trong nghiên cứu này, cấu trúc định lượng thông qua TSPT (biến x), biến Y giá trị logIC50 với

IC50 nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym HDAC2, đánh giá

các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm sử dụng Kit định lượng Bioscence®) Giá trị logIC50 thu cách xử lí liệu IC50 phần

mềm Microsoft Excell 2007 IC50 nhỏ hoạt tính ức chế enzym HDAC2

của chất mạnh

mềm Dragon [37] Dragon phần mềm phát triển công ty Talete Italia vào năm 1993, sử dụng rộng rãi nghiên cứu hóa tin thiết kế thuốc Dragon tính tốn 5000 TSPT khác Các mô tả phân tử thường phân loại dựa vào chiều thông tin mô tả cấu trúc (i) Tham số 0D mô tả thành phần cấu tạo nên cấu trúc, gọi tham số đếm nguyên tử, số lượng C, N (ii) Tham số 1D mô tả cấu tr c dạng chuỗi, vân tay cấu trúc (fingerprint), hay số lượng mảnh cấu tr c, số lượng nhân thơm, nhóm carboxylic (iii) Tham số 2D mơ tả cấu tr c dạng hình học topo, cho phép xác định xác thứ tự, vị trí nguyên tố hay mảnh cấu trúc phân tử Các tham số 2D thường tính tốn dựa lý thuyết graph (iii) Tham số 3D mô tả đặc điểm cấu trúc phân tử không gian Các tham số 3D tính tốn dựa phương pháp l thuyết MoRSE, GETAWAY, tính tốn lượng tử, mơ tả bề mặt thể tích phân tử

Trong nghiên cứu lựa chọn tham số phân tử 2D để mô tả cấu trúc hợp chất Bởi so với mô tả phân tử 3D mơ tả phân tử 2D không cần tới thông tin cấu trúc 3D phân tử, có tính ổn định cao hợp chất mô tả dạng 3D thường có độ linh động cấu dạng

Kết quả: Sử dụng phần mềm Dragon 6.0 tính tốn 3764 TSPT cho phân tử CSDL Sau xử lí loại bỏ TSPT gây nhiễu, 1632 TSPT cịn lại kiểm tra quan hệ phi tuyến với biến đáp ứng LogIC50 Cuối

các hợp chất tính toán với 534 TSPT 2D lưu dạng file.txt - Phân chia tập huấn luyện / tập kiểm tra

Sử dụng phương pháp phân chia ngẫu nhiên chia 45 hợp chất CSDL thành 34 hợp chất phân vào tập huấn luyện, 11 hợp chất phân vào tập kiểm tra

STATISTICA 10.0 để xác định tương quan hoạt tính ức chế với tham số mô tả phân tử Dragon

 Lựa chọn TSPT thích hợp: tất biến khơng phải đưa hết vào mơ hình Mặc dù việc thêm biến độc lập vào làm tăng hệ số tương quan R2, tốt chúng có liên hệ mạnh với biến phụ thuộc Mơ hình chọn ứng với mơ hình có Q2

cao Thực thuật giải di truyền để chọn mơ hình có biến tối ưu phần mềm Mobydigs 1.0

Thuật giải di truyền dựa chế chọn lọc tiến hóa tự nhiên: “Trong hệ, tập sinh vật tạo cách lai ghép nhân tố thích hợp với mơi trường sinh vật hệ cũ với xuất đột biến ngẫu nhiên cá thể hệ mới” Vận dụng chế này, thuật toán mã hoá tất tham số cấu tr c ban đầu nhiễm sắc - biểu diễn vec tơ Từ nhiễm sắc thể ban đầu này, tạo ngẫu nhiên quần thể Quần thể đánh giá từ nhiễm sắc thể thích nghi (tức có hàm mục tiêu Q2 cao nhất) chọn làm khung để tạo quần thể Quy trình làm tăng Q2

toàn nhiễm sắc thể cách truyền đặc tính cấu trúc thuận lợi từ quần thể sang quần thể khác Sau số chu kỳ tìm kiếm đánh giá, cuối ta tìm nhiễm sắc thể (mơ hình) phù hợp với giá trị Q2 cao

Các bước thực thuật giải di truyền:

(1) Khởi tạo quần thể ban đầu (file đầu vào lưu dạng file.mdd chứa liệu tên, mơ tả phân tử tính tốn phần mềm Dragon 6.0, giá trị log IC50 hợp chất tập huấn luyện)

(2) Xác định hàm mục tiêu (fitness) cho cá thể quần thể Hàm mục tiêu nghiên cứu giá trị Q2

(4) Các cá thể quần thể sinh thay cho cá thể quần thể cũ

(5) Nếu điều kiện dừng, giải thuật dừng lại trả cá thể tốt với giá trị hàm mục tiêu

Kết lựa chọn tham số mơ tả phân tử xây dựng mơ hình tốt Đó ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm), B06[N-O]

 Lập mơ hình với số biến chọn phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính (MLR) phần mềm STATISTICA 10.0 MLR trường hợp phổ biến thực tế, tổ hợp tuyến tính biến phụ thuộc (Y) với nhiều biến độc lập (x) Trong nghiên cứu x TSPT đặc trưng cho cấu trúc hợp chất CSDL, Y giá trị logIC50

với IC50 nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzyme HDAC2 Phân tích hồi

qui bao hàm nghĩa “ước tính” (Estimating) hay “dự đốn” (Predictive) sau tương quan tuyến tính x Y thiết lập biểu thức tốn học cụ thể người ta ước tính hay dự đoán giá trị Y từ giá trị x Đường biểu diễn biểu thức toán học gọi đường hồi qui Y theo x

Kết mơ hình MLR xây dựng gồm biến TSPT sau:

LogIC50 = 2.808 + 0.064×ATS8m – 230.167×JGI10 –

1.072×SM15_AEA(bo) – 2.821×SM08_AEA(dm) + 3.519×SM09_AEA(dm) – 0.700×B06[N-O]

(3.1) Trong ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm), B06[N-O] biến tham số phân tử 2D Hệ số biến mang dấu (+), giá trị biến TSPTcàng lớn logIC50 lớn, IC50 lớn

chứng tỏ hoạt tính ức chế enzyme HDAC2 chất nhỏ Và ngược lại, hệ số biến mang dấu (-), giá trị biến TSPTcàng lớn logIC50 nhỏ,

3.1.2 Đánh giá mơ hình theo tiêu chí OECD

Đánh giá mơ hình QSAR cơng việc quan trọng định việc mơ hình xây dựng sử dụng để dự đốn sàng lọc hay khơng Để sử dụng thơng qua mơ hình QSAR quan quản lý, mơ hình phải thỏa mãn nguyên tắc, tiêu chí OECD (Tổ chức kinh tế giới):

Tiêu chí 1: Tồn CSDL sử dụng đích xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) enzym HDAC2 tiến hành theo điều kiện thí

nghiệm sử dụng Kit định lượng Bioscence®

Tiêu chí 2: Thuật toán áp dụng rõ ràng: Các phương pháp xây dựng mơ hình nghiên cứu chúng tơi nêu rõ mục 2.2 Do tính rõ ràng đ ng đắn phương pháp mà mơ hình sử dụng lặp lại để phát hợp chất ức chế HDAC2

Tiêu chí 3: Xác định miền ứng dụng mơ hình

Để đạt khả dự đoán tốt sàng lọc ảo, việc xác định miền ứng dụng mơ hình QSAR vô cần thiết Miền ứng dụng khoảng khơng gian cấu trúc bao gổm mơ hình Chỉ dự đốn hợp chất có cấu trúc nằm miền cấu trúc đáng tin cậy

Hình 3.1 Miền ứng dụng mơ hình QSAR xác định hợp chất có khả ức chế HDAC2.

Sau tính tốn tập huấn luyện, ta thấy 34/34 hợp chất nằm miền ứng dụng Với tập kiểm tra, toàn 11 hợp chất nằm miền ứng dụng, thấy dự đốn mơ hình tập kiểm tra hồn tồn đáng tin cậy

Tiêu chí 4: Kết đánh giá nội ngoại trình bày bảng 3.1

Bảng 3.1. Kết đánh giá nội đánh ngoại mơ hình QSAR

Thơng số R2 Q2 Q2ext

Giá trị thực tế 0,89 0,81 0,85

Ta có R2 ~ 1,0 chứng tỏ độ xác mơ hình cao, Q2 = 0,81 cho thấy mơ hình có độ ổn định tốt Khả dự đoán nội 88,85% khả dự đốn ngoại 84,64% cho thấy mơ hình có khả dự đốn hoạt tính tốt

Tiêu chí 5: Giải thích chế mơ hình

Mơ hình QSAR có tham gia biến, tham số phân tử 2D Tham số phân tử 2D biểu diễn cấu tr c theo kích thước, độ phân nhánh, hình dạng tổng thể

Các tham số phân tử 2D mơ hình bao gồm ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm), B06[N-O] Trong đó:

 ATS8m: mơ tả tự tương quan Moreau-Broto (ATS) đại diện cho tương tác nguyên tử khoảng cách topo 8, (lag 8) theo khối lượng nguyên tử Giá trị dương, hệ số tham số mang dấu (+) chứng tỏ có mặt nguyên tử khối lượng lớn làm tăng tương tác giảm hoạt tính ức chế

 JGI 10: Chỉ số topo trung bình cụm 10 Hệ số tham số mang dấu (+), giá trị cao làm giảm hoạt tính

 Các tham số SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm) thuộc nhóm mơ tả Edge adjacency indices Việc giải thích biến gặp phải khó khăn chế chúng phức tạp đòi hỏi hiểu biết chuyên sâu hóa lượng tử Bên cạnh chưa có nhiều tài liệu tham khảo, chưa đủ sở để giải thích

 B06[N-O] = có mặt khơng có mặt khoảng cách nguyên tử Nitơ Oxi liên kết (C-C) Hệ số B06[N-O] mang dấu (-) giá trị làm tăng hoạt tính ức chế

Như mơ hình thỏa mãn tiêu chí đánh giá OECD, ứng dụng mơ hình để ứng dụng vào dự đốn hoạt tính sinh học hợp chất thiết kế

3.1.3 Sàng lọc ảo đánh giá khả ức chế HDAC2 sử dụng mô hình xây dựng đƣợc

Hình 3.2. Tóm tắt quy trình sàng lọc in silico chất ức chế HDAC2 từ CSDL PubChem

- Sàng lọc sử dụng tìm kiếm đồng dạng CSDL PubChem:

PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) CSDL miễn phí cấu trúc hóa học, đặc tính vai trị sinh học hợp chất hóa học chất nói chung Các hợp chất có nguồn gốc từ khoảng 80 nhà cung cấp, với khoảng 31 nghìn hợp chất PubChem giúp tìm kiếm nhanh chóng hợp chất hóa học dựa vào phương pháp tìm kiếm theo tương đồng cấu trúc PubChem chứa thơng tin tên, tên gọi khác, tính chất: cấu trúc hóa học, tên đoạn, cấu trúc hóa học, khối lượng phân tử, logP, liên kết cho nhận hydrogen

Để tìm kiếm PubChem, "structural query input" PubChem Identifier (CID – tên định danh PubChem), SMILES, Inchi Trong nghiên cứu này, dùng SAHA cấu trúc truy vấn Bởi nhóm chất ức chế histon deacetylase (HDAC), acid hydroxamic nhóm chất quan tâm ý tập trung nghiên cứu nhiều Do acid hydroxamic có cấu tr c đơn giản, dễ tổng hợp có nhóm -NHOH tạo phức bền với Zn+ ở trung tâm hoạt động HDAC mang lại có hoạt

Tìm kiếm đồng dạng

Hợp chất ức chế HDAC2 QSAR

tính ức chế enzym mạnh Trên thực tế, FDA phê duyệt acid hydroxamic UHDAC điển hình vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid, Zolinza) vào năm 2006 sử dụng điều trị u lympho da tế bào [refractory cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)] Chính SAHA lựa chọn cấu trúc truy vấn (chất mẫu), sử dụng để sàng lọc hợp chất có cấu tr c tương tự Các chất có cấu tr c tương tự SAHA hy vọng có tính chất hoạt tính sinh học giống SAHA

Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng kỹ thuật tìm kiếm hợp chất có cấu trúc tương tự với hợp chất mẫu (SAHA) CSDL (Pubchem) cấu trúc hợp chất Kỹ thuật tiến hành dựa nguyên tắc tương tự, theo phân tử có cấu trúc tương tự thường có đặc tính hoạt động sinh học tương tự Các hợpchất xếp hạng dựa tương đồng với chất mẫu Độ tương đồng chất với chất mẫu phản ánh khả có hoạt tính chất

Hệ số Tanimoto (Còn gọi hệ số Jaccard) hệ số tương đồng sử dụng để biểu diễn giống chất CSDL sàng lọc chất mẫu rộng rãi hóa tin Hệ số tính tốn dựa cơng thức:

Hệ số Tanimoto =

Trong đó: Số lượng đặc tính xuất cấu trúc A Số lượng đặc tính xuất cấu trúc B

NC Số lượng đặc tính xuất cấu trúc A B

mơ hình QSAR xây dựng (3.1) để dự đốn hoạt tính cho chúng Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excell 2007 Kết tính tốn TSPT dự đốn hoạt tính nêu Phụ lục

- Từ kết sàng lọc này, chọn 10% hợp chất có IC50 thấp nhất,

được nêu bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết sàng lọc ảo từ sở liệu PubChem. STT Mã CID

(PubChem)

Cấu trúc IC50

dự đoán (μM)

1 58624316 0.032781

2 20721667 0.0213922

3 85697302 0.012845

4 44359800 0.0231520

5 42637850 0.0326886

7 14496775 0.0387043

8 0.0395340 0.0395340

9 88254626 0.003744

10 21302179 0.0380004

11 54077290 0.0240224

12 90889464 0.0044032

13 70232351 0.003756

14 4953736 0.0331159

Như so với SAHA, chất ức chế HDAC2 mạnh, ứng dụng lâm sàng, hợp chất sàng lọc CSDL PubChem có hoạt tính ức chế HDAC2 cao nhiều Các hợp chất hydroxamics có cấu tr c tương đồng với SAHA > 85% Do hơp chất hồn tồn tổng hợp có nhiều tiềm phát triển thành thuốc chống ung thư

Trong nghiên cứu này, mơ hình QSAR xây dựng giúp phát hợp chất có tiềm ức chế HDAC2 dựa thông tin cấu trúc phân tử Mô hình in silico này có vai trị quan trọng việc sàng lọc nhanh hiệu hợp chất ch ng chưa tổng hợp hay phân lập giúp tiết kiệm thời gian, tiền bạc trình nghiên cứu, phát triển thuốc chống ung thư

3.2 Bàn luận

3.2.1 Về mơ hình QSAR

QSAR kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực dược phẩm, y học, hóa học… Kỹ thuật sử dụng TSPT, kỹ thuật xác suất thống kê trí tuệ nhân tạo để xây dựng mơ hình Mơ hình xây dựng phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính, lựa chọn tham số phân tử giải thuật di truyền Phương pháp gi p tối ưu hóa mơ hình nhằm tìm mơ hình biểu thị tốt mối quan hệ biến đáp ứng tham số phân tử

Mơ hình QSAR xây dựng gồm TSPT 2D Tham số 2D mô tả cấu tr c dạng hình học topo, cho phép xác định xác thứ tự, vị trí nguyên tố hay mảnh cấu trúc phân tử Mô tả phân tử 2D không cần tới thông tin cấu trúc 3D phân tử, có tính ổn định cao hợp chất mô tả dạng 3D thường có độ linh động cấu dạng Tuy nhiên, không kết hợp phương pháp protein docking xây dựng mơ hình QSAR nên khơng thu thơng tin cấu dạng, không xác định chế tương tác chất enzyme HDAC2

mơ hình QSAR; việc giải thích biến TSPT đơi gặp phải khó khăn chế chúng phức tạp đòi hỏi hiểu biết chuyên sâu hóa lượng tử; bên cạnh chưa có nhiều tài liệu tham khảo, chưa đủ sở để giải thích

3.2.2 Về quy trình sàng lọc ảo

Trong nghiên cứu này, tiến hành sàng lọc hợp chất ức chế HDAC2 từ CSDL PubChem Quá trình sàng lọc qua bước CSDL PubChem sau sàng lọc phương pháp “Tìm kiếm đồng dạng” với hệ số đồng dạng Tanimoto ≥ 0.85, liệu đầu vào cấu trúc dạng SMILE SAHA Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng kỹ thuật tìm kiếm hợp chất có cấu trúc tương tự với hợp chất mẫu (SAHA) CSDL (PubChem) cấu trúc hợp chất Kỹ thuật tiến hành dựa nguyên tắc tương tự, theo phân tử có cấu tr c tương tự thường có đặc tính hoạt động sinh học tương tự Các hợpchất xếp hạng dựa tương đồng với chất mẫu Độ tương đồng chất với chất mẫu phản ánh khả có hoạt tính chất Kết qua phương pháp “tìm kiếm đồng dạng” dãy dẫn chất Hydroxamics có cấu tr c tương đồng với SAHA ≥ 0.85 Lựa chọn 120 chất chưa nghiên cứu tác dụng ức chế enzym HDAC2 tiếp tục sàng lọc qua mơ hình QSAR xây dựng nhằm dự đoán nồng độ ức chế 50% HDAC2 (IC50) Từ tìm hợp chất có hoạt tính

ức chế HDAC2 dự đốn mạnh có tiềm phát triển thành thuốc chống ung thư

Như từ CSDL lớn (hơn 31 nghìn chất) qua hệ thống sàng lọc sàng lọc tập hợp nhỏ hợp chất có tiềm ức chế enzym HDAC2 Phương pháp giúp ích nhiều cho việc phát hợp chất có hoạt tính sinh học trước ch ng tổng hợp hay phân lập Từ gi p tiết kiệm nhiều thời gian công sức tiền bạc cho khâu trình nghiên cứu phát triển thuốc

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Từ kết nghiên cứu trình bày ch ng tơi r t kết luận sau:

1 Nghiên cứu xây dựng thành cơng mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ định lượng cấu trúc tác dụng ức chế enzyme HDAC2 có phương trình:

LogIC50 = 2.808 + 0.064×ATS8m – 230.167×JGI10 –

1.072×SM15_AEA(bo)– 2.821×SM08_AEA(dm) + 3.519×SM09_AEA(dm) – 0.700×B06[N-O]

2 Nghiên cứu đánh giá mơ hình xây dựng theo ngun tắc OECD với R2=0.89, Q2= 0.81, khả dự đoán nội 88,85% khả dự đoán ngoại 84,64% Như mơ hình thoả mãn tiêu chí đánh giá nội ngoại độ xác, độ ổn định khả dự đốn tốt Mơ hình xây dựng được ứng dụng để sàng lọc CSDL lớn nhằm tìm kiếm hợp chất ức chế HDAC2

3 Nghiên cứu sàng lọc 120 hợp chất từ CSDL Pubchem, 14 số có hoạt tính mạnh tương đương SAHA, thuốc ức chế HDAC lưu hành thị trường Đặc biệt, có hợp chất mạnh SAHA 60 -70 lần chưa nghiên cứu tác dụng chống ung thư Các hợp chất có tiềm phát triển thành thuốc chống ung thư

KIẾN NGHỊ

Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu khóa luận tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế HDAC2 cao, xin đưa đề xuất sau:

1 Nghiên cứu phương pháp Docking phân tử để tìm hiểu chế ức chế HDAC2 14 hợp chất sàng lọc

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1 Nguyễn Bá Đức (2001), "Bài giảng UNG TH HỌC", NXB Y Học Tài liệu Tiếng Anh

2 Anand P., Kunnumakkara A B., Sundaram C., Harikumar K B, Tharakan S T., Lai O S and Sung B B (2008), "Cancer is a preventable disease that requires major lifestyle changes", Pharm Res 25(9), 2097 - 2116

3 Andrea M., Viviana C., Manuela P and Todeschini R (2006), "DRAGON SOFTWARE: an easy approach to molecular descriptor and calculator", MATCH Commun Math Comput Chem 56, 237-248 Andrianov V., Gailite V., Lola D., Loza E and Semenikhina V

(2009), "Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase: design, synthesis and SAR", Eur J Med Chem 44

5 Bae H and Nam S W (2014), "HDAC2 (histone deacetylase 2)", Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 18, 594-597

6 Bernstein B E and Tong J K (2000), "Genomewide studies of histone deacetylase function in yeast", Proc Natl Acad Sci U S A 97(25), 13708-13

7 Bertrand P (2010), "Inside HDAC with HDAC inhibitors", Eur J Med Chem. 45(6), 2095-116

8 Chun P (2011), "Synthesis and Importance of Bulky Aromatic Cap of Novel SAHA Analogs for HDAC Inhibition and Anticancer Activity", Bulletin of the Korean Chemical Society 32(6), 1891-1896

9 Chueh A C (2015), "Mechanisms of Histone Deacetylase Inhibitor-Regulated Gene Expression in Cancer Cells", Antioxid Redox Signal 23(1), 66-84

11 Dallavalle S., Cincinelli R., Vesci L and Barbarino M (2009), "Design, synthesis, and evaluation of biphenyl-4-yl-acrylohydroxamic acid derivatives as histone deacetylase (HDAC) inhibitors", Eur J Med Chem, 1-13

12 de Martel C., Ferlay J., Franceschi S., Vignat J., Bray F and Forman D M (2012), "Global burden of cancers attributable to infections in 2008: a review and synthetic analysis.", The Lancet Oncology 13(6), 607 - 615

13 de Ruijter A J., van Gennip A H., Caron H N and Kemp S (2003), "Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family", Biochem J 370(Pt 3), 737-49

14 Do T M Dung (2015), "Novel 3-substituted-2-oxoindoline-based N-hydroxypropenamides as Histone Deacetylase Inhibitors and Antitumor Agents", Medicinal Chemistry 11(8), 725-735

15 Do Thi Mai Dung, Phan Thi Phuong Dung, Dao Thi Kim Oanh, Tran Khac Vu, Hyunggu Hahn, Byung Woo Han, Minji Pyo, Young Guk Kim, Sang-Bae Han and Nam, N.H (2015), "Exploration of novel 5'(7')-substituted-2'-oxospiro[1,3]dioxolane-2,3'-indoline-based N-hydroxypropenamides as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents", Arabian Journal of Chemistry

16 Dokmanovic M (2005), "Prospects: histone deacetylase inhibitors", J Cell Biochem 96(2), 293-304

17 Edwardand C (2000), "Histone deacetylase transcriptional control and cancer", Journal of cenlular Physyology 184(1), 1-16

18 Eric V (2006), "Histone Deacetylases Transcriptional Regulation and Other Cellular Functions"

20 John J I and Shoichet B K (2005), "ZINC – A Free Database of Commercially Available Cosmpounds for Virtual Screening", J Chem Inf Model 45(1)

21 Johnstone R W.(2002), "Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the treatment of cancer", Nat Rev Drug Discov 1(4), 287-299

22 Kamb A., Wee S and Lengauer C (2007), "Why is cancer drug discovery so difficult?", Nat Rev Drug Discov. 6(2), 115-120

23 Kim S., Thiessen P A., Bolton E E., Chen J., Fu G., Gindulyte A., Han L., He J., He S., Shoemaker B A., Wang J., Yu B., and Zhang J (2016), "PubChem Substance and Compound databases", Nucleic Acids Res 44

24 Lai M.J (2012), "Synthesis and Biological Evaluation of 1-Arylsulfonyl-5-(N-hydroxyacrylamide)indoles as Potent Histone Deacetylase Inhibitors with Antitumor Activity in Vivo", Medicinal Chemistry 55(8), 3777–3791

25 Lee Y H., Seo D., Choi K J., Andersen J B., Won M A., Kitade M., Gomez-Quiroz L E., Judge A D., Marquardt J U., Raggi C, Conner E A., MacLachlan I and Factor V M (2014), "Antitumor effects in hepatocarcinoma of isoform-selective inhibition of HDAC2", Cancer Res 74(17), 4752-61

26 Marson C M., Mahadevan T., Dines J., Sengmany S., Morrell J M., Alao J P., Joel S P and Vigushin D M (2007), "Structure-activity relationships of aryloxyalkanoic acid hydroxyamides as potent inhibitors of histone deacetylase", Bioorg Med Chem Lett 17(1), 136-41

28 Organisation for Economic Co-operation and Developme (2007), "Guidance Document on the Validation of (Q)SAR Models ", Environment directorate joint meeting of the chemicals committee and the working party on chemicals, pesticides and biotechnology

29 Pawan K and Sasazuki T (2008), "HDAC2 deficiency sensitizes colon cancer cells to TNFα-induced apoptosis through inhibition of NF-κB activity", Experimental Cell Research 314(7), 1507–1518

30 Pingyuan W., Zhiqing L and Chen H (2009), "Sulfamides as novel histone deacetylase inhibitors", Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 17, 1123-1128

31 Roperoand Santiago (2007), "The role of histone deacetylases (HDACs) in human cancer", Molecular Oncology 1, 19-25

32 Roth S Y (2001), "Histone acetyltransferase", Annu.Rev.Biochem (120, 81-120e)

33 Stefan B., "Short Manual to the Chemical Drawing Program ChemDraw®", IfC Department of Chemistry

34 Sento E and Glozak M A (2007), "Histone deacetylases and cancer", Oncogene 26, 5420-5432

35 The Chemicals Committee and Working Party on Chemicals.(2004), "OECD Principles for the Validation, for Regulatory Purposes, of (Quantitative) Structure-Activity Relationship Models"

36 Thaler F (2013), "Synthesis and biological characterization of spiro[2H-(1,3)-benzoxazine-2,40-piperidine] based histone deacetylase inhibitors", European journal of medicinal chemistry 64, 273-84

37 Todeschini R and Consonni V (2000), "Handbook of Molecular Descriptors 1st", Federal Republic of Germany 11

38 Tran T.L Huong (2015), "Novel 2-oxoindoline-based hydroxamic acids: Synthesis, cytotoxicity and inhibition of histone deacetylation", Tetrahedron Letters Tetrahedron Letters 56(16), 6425–6429

40 WHO (2014), "World Cancer Report"

41 Yoshida M., Kijima M., Akita M and T, B (1990), "Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A", J Biol Chem 265(28), 17174-9

42 Zhang L., Fang H and W X (2010), "Strategies in developing promising histone deacetylase inhibitors", Medicinal Research Reviews 30(4), 585-602

PHỤ LỤC

Bảng Sàng lọc CSDL Pubchem hợp chất giống SAHA (Tanimoto similarity index ≥ 0.85), tính tốn tham số phân tử dự đốn hoạt tính mơ hình (3.1)

ST T

Cấu trúc

(https://pubchem.ncbi.nlm .nih.gov/compound/)

Mã CID ATS 8m

JGI10 SM15_ AEA (bo)

SM08_ AEA (dm)

SM09_ AEA (dm)

B06 [N-O]

IC50dự đoán

(μM)

1

10039224 2.865 0.003 -1 -1.282 0.4347064

2

58833044 2.94 0.006 -1 -1 0.6070787

3 s 87072389 2.784 0.006 -1.179 -1.385 0.1895215

4

5

46205431 2.882 0.007 -1.167 -1.333 0.1758513

6

53302622 2.992 0.008 -1 -1.3 0.0824400

7

9838671 2.887 0.007 1.049 -1.171 -1.373 0.1394253

8

59507279 2.887 0.005 1.049 -1.172 -1.414 0.2265910

9

88576450 2.865 0.007 -1 -1.178 0.1833417

10

11

24861500 4.074 0.004 1.532 0.347 0.111 1.0217461

12

58624316 2.683 0.008 -1.193 -1.62

0.032781

13

10516731 2.865 0.005 -1 -1.173 0.3659117

14

85697273 2.98 0.006 1.066 -1.169 -1.368 0.2061343

15

85697290 2.98 0.006 1.061 -1.164 -1.229 0.3832203

16

17

23075284

2.98 0.008 1.063 -1.166 -1.321

0.1298851

18

20721667 2.924 0.006 1.049 -1 -1.171 0.0213922

19

44456995 2.877 0.006 -1.172 -1.414 0.1726303

20

85697255 2.871 0.005 1.049 -1.172 -1.414 0.2240354

21

85697257 3.065 0.006 1.043 -1 -1 0.6242240

22

23

85697302 2.463 0.008 0.325 -1.766 -1.946

0.012845

24

23399147

3.065 0.009 1.064 -1.141 -1.185

0.1661152

25

14496776 2.378 0.007 0.608 -1.774 -1.94 0.1443687

26

57426850 2.199 0.007 0.181 -1.939 -2 0.3368304

27

70379132 2.348 0.007 0.349 -1.779 -1.948 0.2003737

28

29

44359673 2.94 0.006 -1 -1 0.6070787

30

44431491 2.932 0.008 -1 -1.3 0.0790071

31

59835569 2.952 0.006 -1 -1.349 0.1250892

32

56951447 4.01 0.01 1.584 -1 -1 0.1492143

33

23557326 2.865 0.006 -1.163 -1.358 0.2132279

34

35

44359800 2.875 0.01 -1 -1.414 0.0231520

36

85905437 2.995 0.004 -1 -1 1.2314345

37

85697276 3.065 0.007 1.075 -1 -1.171 0.1961748

38

42637850 2.679 0.008 -1.193 -1.62 0.0326886

39

24284701

2.88 0.006 -1 -1.353

0.1167208

40

41

14496778 2.69 0.003 0.879 -1.38 -1.63 0.4118330

42

564390 2.222 0.007 0.181 -1.939 -2 0.3423673

43

68394755 2.563 0.003 0.794 -1.597 -1.816 0.4245148

44

54753628 2.763 0.008 -1 -1.41

0.042486

45

71459490 2.982 0.006 -1 -1.325 0.1425234

46

47

56668788 3.001 0.005 -1 -1 0.8854045

48

44431497 3.06 0.006 1.03 -1 -1 0.6335470

49 52950298

3.763 0.006 1.733 0.958 0.606 0.2773072

50

71712264 3.267 0.005 1.414 -0.283 -0.586 0.2389080

51

89108892 2.964 0.006 -1 -1.349 0.1261578

52

53

11232029 3.01 0.006 1.049 -1 -1 0.5952860

54

71376590 2.94 0.006 -1 -1.171 0.2788060

55

88272608 2.955 0.006 -1 -1.349 0.1253555

56

44359788 2.795 0.007 0.81 -1.38 -1.598 0.1486498

57

85697281 3.065 0.006 1.074 -1 -1.17 0.2756449

58

59

9543542 3.111 0.005 1.354 -1 -1 0.5804522

60

54789249 2.845 0.006 -1 -1.39 0.0962167

61

54789247 2.935 0.007 -1 -1 0.4331006

62

68232694 2.796 0.009 -1.185 -1.34 0.0881255

63

14496779 2.779 0.004 -1.277 -1.414 0.4732568

64

65

17607862 2.387 0.009 0.242 -1.776 -1.944 0.1236229

66

24710930 2.496 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0.4932942

67

71354457 2.935 0.005 -1 -1.133 0.4612942

68

23428 2.469 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0.4839423

69

5196616 2.578 0.003 0.794 -1.597 -1.816 0.4290529

70

207164 2.754 0.004 -1 -1.414 0.1577748

71

72

42637654 2.189 0.007 0.181 -1.939 -2 0.3344511

73

57426849 2.017 0.012 -0.126 -2 0 977.4688919

74

46205758 3.164 0.007 1.049 -1 -1 0.0395340

75

54753629 3.016 0.005 -1 -1 0.8948695

76

16739374 3.149 0.007 1.21 -1 -1 0.3746286

77

78

44431496 3.069 0.006 1.03 -1 -1 0.6376020

79

56658395 3.239 0.004 1.242 -0.84 -1 0.5570702

80

59567106 2.904 0.008 0.821 -1.324 -1.389 0.2355086

81

102191201

2.882 0.007 -1.329 -1.414

0.2288591

82

88254626 2.964 0.007 -1 -1.502

83

44415994 2.883 0.003 -1 -1.282 0.4402888

84

4119737

2.514 0.007 0.884 -1.656 -1.801 0.127857

85

54508233 3.075 0.004 1.262 -1 -1 0.9000322

86

91172933 2.772 0.006 -1.172 -1.414 0.1602474

87

81275 3.209 0.005 1.414 -0.235 -0.503 0.2773776

88

89

4351049 3.221 0.006 1.028 -0.75 -0.77 0.7647220

90

15560754 3.093 0.006 1.388 -0.596 -1 0.0808510

91

21302179 2.789 0.007 -1 -1.512 0.0380004

92

54077290 3.022 0.006 -1 -1.176 0.0240224

93

58660950 3.004 0.006 1.155 -1 -1 0.5103040

94

95

3597078 2.914 0.006 -1 -1 0.5959920

96

3382807 3.052 0.004 1.01 -1 -1 1.2642211

97

17202535 3.064 0.006 1.024 -1 -1 0.6407555

98

17204914 2.985 0.005 -1 -1 0.8754187

99

36656244 2.803 0.011 0.731 -1.414 -1.55 0.0623897

100

70232351

101 101030013

3.638 0.005 1.597 0.244 0.103 0.7060332

102

43125168 2.6 0.006 0.54 -1.536 -1.804 0.1906166

103

59838335 2.677 0.008 -1.193 -1.62 0.0326423

104

4518322 3.296 0.003 1.414 -0.147 -0.481 0.4512904

105

3833468 3.19 0.004 1.307 -0.537 -0.75 0.4694463

106

71344197 3.346 0.003 1.45 0.02 -0.298 0.5326504

107

108

65450231 2.697 0.005 0.804 -1.338 -1.61 0.2192940

109

71402929 3.282 0.003 1.414 -0.147 -0.481 0.4468337

110

89974472 2.689 0.008 0.726 -1.549 -1.806 0.0834179

111

89556224 2.444 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0.4754412

112

203897 2.677 0.003 -1.313 -1.652 0.2395842

113

94794 2.849 0.004 -1 -1.139 0.5898757

114

115

4195216 2.925 0.003 -1 -1 1.6367313

116

20721653 1.982 -0.131 -2 0 52941.67496

10

117

4953736 2.655 0.009 0.706 -1.251 -1.681 0.0331159

118

1718311 2.746 0.006 0.709 -1.249 -1.406 0.3323904

119

13311491 2.692 0.003 -1.478 -1.69 0.3877590

120

DNA nhiễm sắc thể CTCL (Cutaneous T Cell Lymphoma): U lympho tế bào T da (