Kiểm tra xác định hoạt lực của dịch sinh khối thu được rồi hòa với nước theo tỷ lệ nhất định để thu được chế phẩm có hoạt tính mong muốn. Trộn khô các chất Veegum và Xanthan theo tỷ lệ [r]
(1)1
CHƯƠNG VI:
(2)2
VI.2
(3)3
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU BT
Tuyển
chọn
chủng
Lên men
Lên men bán rắn
Lên men chìm
(4)4
Chọn chủng tự nhiên
có độc lực cao
Tuyển chọn chủng
Tạo giống
gây đột biến
Tạo giống
công nghệ gen
1
Phân lập Bt từ đất
(5)5
Bảo quản
giống
Cấy
truyền
Bảo quản
trong parrafin
Bảo quản
trong cát
Đông
khô
Bảo quản
trên giấy lọc
(6)6
Quy trình lên men chìm Bacillus thuringiensis
Nước
P C khoáng
Hơi nước T h ù n g c h ứ a Ly tâm Chuẩn hóa Tạo chế phẩm
Đóng gói
Thổi khí
(7)7
Nhân giống cho ni cấy vi khuẩn
Mục đích: Tạo lượng giống hoạt hoá nhằm giúp giai đoạn pha
lag phát triển nhanh.
Nếu lag kéo dài: tốn thời gian, môi trường.
Thời gian pha lag phụ thuộc: lượng giống, trạng thái sinh lý
giống:
Tỷ lệ giống chọn: – 10%.
Giống vi khuẩn tiếp vào vi khuẩn giai đoạn
phát triển log, tế bào chuyển hố mạnh.
(8)8
Các thơng số q trình lên men
• Thành phần mơi trường
• Nhiệt độ
• pH
• Thổi khí
(9)9
Thành phần môi trường lên men Bt
Thành phần Hàm lượng (g/l)
Bột đậu tương 25 22,5 - 40 - 18 25 40
Bột khô lạc - - 30 - 14 - -
-Bột ngô - - - - - 5 - 20
Nước chiết ngô - 20 30 20 16,7 36 3
-Tinh bột 10 15 - - 7,5 - -
-Bột cá - - - - - 3 5 10
Pepton - - 2 - - - - 1
Glucoza 10 - 45 30 - - 20
-Rỉ đường - - - - 18,6 - -
-Cao nấm men - - 2 - - - - 2
KH2PO4 1 - - - - 2,16 1 1
K2HPO4 1 - - - - - -
-FeSO4.7H2O 0,02 - 0,02 - - - -
-MgSO4.7H2O - - 0,3 - - 0,75 - 0,7
MnSO4.H2O - - 0,02 - - - -
-ZnSO4.7H2O - - 0,02 - - - -
-CaCO4 1 1,5 - - 1 1,5 1 2
(10)-10
Các phương pháp lên men
Phương pháp nuôi cấy chìm
Chuẩn bị mơi trường lên men: Hồ trộn thành phần môi
trường nước; trùng; làm nguội bơm vào thiết
bị lên men.
Quá trình lên men:
Nhiệt độ: 28 – 34
oC.
pH: pH
BĐ= 6,8 – 7,2; pH
QT5,5 – 5,6
8,5 Hoặc giữ
không đổi cách sử dụng NaOH; NH
4OH H
2SO
4.
Bổ sung dầu phá bọt polypropylen, glycol, silicon dầu
thực vật tinh chế môi trường giàu protein.
Điều khiển lượng oxy hồ tan thích hợp.
Dừng lên men đạt tỷ lệ tách bào tử tự lớn nhất: 36– 96
giờ.
(11)11
Phương pháp nuôi cấy bán rắn
Chuẩn bị môi trường lên men: Cám, nước dung dịch
dinh dưỡng, muối khoáng trộn lẫn trùng
bằng hơi.
Giống nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm
máy lắc.
Quá trình lên men:
Nhiệt độ: 30
oC.
Độ ẩm môi trường: 50 – 70%.
Độ ẩm khơng khí ni cấy: 80 – 100%.
Kết thúc lên men thường sau 48 giờ; khơng khí ẩm
(12)12
(13)13
Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành tinh thể Cry
Nhiệt độ thích hợp: 25 – 35
oC; T
opt= 30
oC
pH thích hợp: 7,0; pH cao thấp làm biến tính tinh thể.
Lượng oxy đưa vào môi trường phải tuỳ theo giai đoạn:
Giai đoạn sinh trưởng thiếu oxy: tích luỹ sinh khối giảm mạnh.
Giai đoạn tạo bào tử hình thành tinh thể độc: thừa oxy lượng
bào tử không thay đổi lượng tinh thể tạo thành giảm
mạnh.
Tác động axit amin:
Lơxin izolơxin ức chế sinh trưởng hình thành bào tử
của Bt Nếu có mặt thêm valin tác dụng ức chế bị đi.
Có mặt treonin serin ức chế sinh trưởng hình
thành bào tử Bt Nếu có mặt hai axit amin
một lúc tác dụng ức chế bị Tác dụng ức chế
serin có mặt metionin.
Chất kháng sinh erythromycin nồng độ thấp chưa đủ ức chế sinh
(14)14
Thu hồi sản phẩm
Dịch lên men
Li tâm
Lọc ép
Kết tủa
Cô đặc
Sấy khô
(15)15
Những điều cần ý tạo dạng chế phẩm
Độc tính diệt trùng phải trì suốt công
đoạn: T<50 – 55
oC để nội độc tố bảo tử không bị phá huỷ.
Hoạt tính sinh học chế phẩm ổn định 18 – 36 tháng.
Dạng chế phẩm phải thích hợp thuận tiện cho việc sử dụng.
Hoạt lực chế phẩm phải trì lại điều kiện môi
trường áp dụng (độ bền chế phẩm).
Chế phẩm Bacillus diệt côn trùng theo đường tiêu hoá nên cần
(16)16
TẠO CHẾ PHẨM KỸ THUẬT
Thành phần
%
(w/w)
Vai trò
Giá tiền
($/kg)
Dịch lên men ly tâm 97 Tác nhân SH 28 Dung dịch Bevaloid 211
40% 2 Chất phân tán 0,03 Gum arabic 1 Chất bảo vệ
sấy 0,03
(17)17
TẠO CHẾ PHẨM KỸ THUẬT
Các bước tiến hành
1 Điều chỉnh pH dịch lên men 4,1 H2SO4 5M
2 Ly tâm liên tục dịch lên men ≥ 8000g < 35ºC, khuấy trộn liên tục thùng lên men
3 Lấy mẫu
4 Bổ sung từ từ chất phân tán với tỷ lệ 2% 1% gum arabic 5% lactoza đảo trộn phút để đảm bảo khơng vón cục 5 Sấy phun đến hàm lượng nước 6-7%
(18)18
TẠO CHẾ PHẨM BỘT MỊN 500 IU/mg
Thành phần chế phẩm
Thành phần %
(w/w) Vai trò Giá tiền ($/kg)
Chế phẩm kỹ thuật 0,6 Tác nhân SH 0,18
Bột Talc 98,9 Chất mang 0,18
Wessalon S 0,5 Chất chống hút
dính 0,03
Các bước tiến hành
1 Trộn chế phẩm kỹ thuật (80 000 IU/mg) với bột oxit silic, ví dụ Wessalon S theo tỷ lệ 5:4
(19)19
TẠO CHẾ PHẨM BỘT THẤM ƯỚT
Thành phần
%
(w/w)
Vai trò
Giá tiền
($/kg)
Chế phẩm kỹ thuật 20 Tác nhân SH 5,6 Bột Kaolin 75,25 Chất mang 0,44 Wessalon S 0,75 Chất chống hút
dính 0,03 Bevaloid 116 2 Chất phân tán 0,09 Surfynol 104S 2 Chất thấm ướt 0,26
(20)20
TẠO CHẾ PHẨM BỘT THẤM ƯỚT
Các bước tiến hành
1 Từ hoạt tính chế phẩm kỹ thuật ban đầu hoạt tính chế phẩm bột thấm ướt cần có tính tỷ lệ %, P chế phẩm kỹ thuật cần sử dụng 2 Bổ sung vào chế phẩm kỹ thuật bột oxit silic theo tỷ lệ 0,75% (khối
lượng so với sản phẩm cuối cùng), chất phân tán 2% chất thấm ướt 2% thiết bị đảo trộn Tiến hành < 35ºC toàn hạt bột oxít silic đóng tụ tan hết
(21)21
TẠO CHẾ PHẨM NƯỚC
Thành phần %
(w/w) Vai trò Giá tiền ($/kg)
Sinh khối 10 Tác nhân SH 2.8
Bevaloid 211 3 Chất phân tán 0,03
Veegum 0,45 Chất chống lắng 0,05
Xanthan gum 0,06 Chất chống lắng 0,03 Surfynol TG-E 0,5 Chất phân tán 0,06 K sorbate 0,2 Chất chống nấm 0,03 H2SO4 5M để chỉnh pH 4 Ngăn vi khuẩn phát
triển 0,03
Nước đến 100%
(22)22
TẠO CHẾ PHẨM NƯỚC
Các bước tiến hành
1 Ly tâm dịch lên men sản xuất chế phẩm kỹ thuật
2 Ổn định sinh khối cách bổ sung K sorbate tỷ lệ 2%, điều chỉnh pH bằng H2SO4 5M bổ sung dung dịch Bevaloid 211 với tỷ lệ 3% Hịa trộn nhất 10 phút K sorbate hịa tan hồn tồn.
3 Kiểm tra xác định hoạt lực dịch sinh khối thu hòa với nước theo tỷ lệ định để thu chế phẩm có hoạt tính mong muốn.
4 Trộn khơ chất Veegum Xanthan theo tỷ lệ 7,5:1, sau cho hỗn hợp từ từ vào nước Đảo trộn với lực cắt lớn < 60ºC 30 phút hịa hồn tồn
5 Cho hỗn hợp gel vào dịch sinh khối Đảo trộn từ từ.
6 Kiểm tra giữ pH Điều chỉnh H2SO4 NaOH 5M
7 Cuối bổ sung Surfynol TG-E Đảo trộn kỹ, tránh khuấy trộn nhiều khơng khí.
(23)23
TẠO CHẾ PHẨM DẦU
Thành phần
%
(w/w)
Vai trò
Giá tiền
($/kg)
Chế phẩm kỹ thuật 24 Tác nhân SH 6,72
Edelex 13 oil 74,4 Chất mang 1,14
Bentone 38 1,2 Chất chống lắng 0,09 Propylene carbonate 0,4 Chất hoạt hóa 0,05
(24)24
TẠO CHẾ PHẨM DẦU
Các bước tiến hành
1 Trộn chất chống lắng với 10% lượng dầu 45 phút Đảo trộn với lực cắt tối đa Bổ sung chất hoạt hóa nhanh vào đảo trộn với lực cắt lớn Để đầu thiết bị đảo trộn khắp thùng đảo trộn
2 Chuyển hỗn hợp gel vào thùng đảo trộn chính
3 Dùng lượng dầu lại rửa nốt phần gel vào thùng Đảo trộn dầu hỗn hợp gel 10 phút
4 Nghiền chế phẩm kỹ thuật cần để có kích thước hạt < 50µm Hịa trộn với hồn hợp dầu thùng trộn
(25)25
Các nguyên nhân gây hư hỏng chế phẩm BT
Nhiệt độ cao
Thời gian chịu tác động bất lợi
Sự có mặt nước tự do
pH bất lợi
Sự có mặt enzim
(26)26
Các phụ gia sử dụng tạo chế phẩm BT
• Chất giúp thấm ướt (wetters)
• Chất kết dính (stickers)
• Chất hấp dẫn (phagostimulants)
• Chất chống nắng (sunscreens)
(27)27
Synergist combinations
Nồng độ (%)
LC50 khơng có
synergist/LC50
cã synergist
ZnSO4 + CaCO3 0,1 + 0,5 16 ZnSO4 + (NH4)2HPO4 0,1 + 0,5 20 ZnSO4 + K2CO3 0,1 + 0,5 45 CaCO3 + (NH4)2HPO4 0,5 + 0,5 11
(28)28
5
Kiểm tra chất lượng sản phẩm
Các thông số bản
Hiệu lực diệt sâu, kích thước hạt, độ ẩm, pH, độ thấm ướt, độ phân tán,
độ tạo huyền phù, độ nhớt…
Hiệu lực sinh học
Số lượng tế bào và
bào tử tự do Hiệu lực diệt sâu
Trọng lượng phân tử protein tinh thể
• Số lượng TB BT: đếm kính hiển vi quang học
• Số lượng bào tử tự do:
đếm số khuẩn lạc mơi trường thạch
• Liều lượng gây chết ấu trùng côn trùng: LC50 LC95
• Liều thử 25-50 ấu trùng,
Thời gian 24 giờ, số lần lặp lại 4-6 lần
(29)29
Xác định hoạt lực diệt sâu
In vivo test
LC
50Hoạt độ diệt sâu, IU/mg =
của chế phẩm chuẩn x hoạt độ chế phẩm chuẩn LC50
LC50 của mẫu