Khảo sát thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa của thân cây hồng quân flacourtia rukam zoll et mor , flacourtiaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ PHƯƠNG THẢO KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY HỒNG QUÂN Flacourtia rukam Zoll et Mor., Flacourtiaceae Luận văn Thạc sĩ Dược học TP Hồ Chí Minh-Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÊ PHƯƠNG THẢO KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY HỒNG QUÂN Flacourtia rukam Zoll et Mor., Flacourtiaceae Ngành: Dược liệu Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Luận văn Thạc sĩ Dược học (Dược liệu Dược học cổ truyền) NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS HUỲNH NGỌC THỤY TP Hồ Chí Minh-Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng năm 2018 Người viết cam đoan Lê Phương Thảo TÓM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa: 2016 – 2018 Chuyên ngành: Dược liệu dược học cổ truyền – Mã số: 8720206 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY HỒNG QUÂN Flacourtia rukam Zoll et Mor., Flacourtiaceae LÊ PHƯƠNG THẢO Thầy hướng dẫn: PGS.TS HUỲNH NGỌC THỤY Mở đầu đặt vấn đề Hồng quân thuốc giàu tiềm chứng minh tác dụng điều trị tăng sinh tiền liệt tuyến Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa thân Hồng quân Flacourtia rukam Zoll et Mor., Flacourtiaceae” thực nhằm nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học lồi này, góp phần tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc cho người Đối tượng nghiên cứu Thân cành lớn Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll et Mor.) thu hái tháng 11/2016 núi Cô Tô, tỉnh An Giang Phương pháp nghiên cứu Chiết xuất, tách phân đoạn, phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc chất tinh khiết Thử nghiệm in vitro tác dụng quét gốc tự DPPH ức chế xanthin oxidase Kết bàn luận Khảo sát thành phần hóa học Từ 9,4 kg bột thân Hồng quân chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu 550 g cao cồn Chiết tách lỏng lỏng, thu 71 g cao CHCl3, 40 g cao EtOAc 94 g cao MeOH Chọn phân đoạn EtOAc chiết tách lỏng - rắn thu phân đoạn Bằng kỹ thuật sắc ký cột, kết hợp liệu phổ thu mg acid vanilic 2500 mg poliothrysosid Thử nghiệm hoạt tính sinh học Hoạt tính quét gốc tự DPPH: FRT-1 (IC50 = 2,26 µmol); FRT-2 (IC50 = 0,33 µmol) so với chứng dương quercetin (IC50 = 0,0041 µmol) Hoạt tính ức chế xanthin oxidase: FRT-1 (IC50 = 0,061 µmol); FRT-2 (IC50 = 0,018 µmol) so với chứng dương allopurinol (IC50 = 0,024 µmol) Kết luận kiến nghị Hồng quân dược liệu có tiềm việc làm giảm acid uric Đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hoạt tính phân đoạn khác, nhiều phận dùng khác SUMMARY Thesis of Master of pharmacy – Course: 2016 – 2018 Major: Traditional Pharmacy – Code: 8720206 BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION THE ANTIOXIDANT FROM STERMS OF Flacourtia rukam Zoll et Mor., Flacourtiaceae LÊ PHƯƠNG THẢO Instructor: HUỲNH NGỌC THỤY, Assoc Prof., Dr Introduction: Flacourtia rukam was know in treatment prostatic hyperplasia Thesis “Bioactive-guided isolation the antioaxidant from stem of Flacourtia rukam Zoll et Mor., Flacourtiaceae” was conducted to study the chemical composition and some new biological effects of this plant, contributing to the source of materials for human medicine Materials Stems and branches of Flacourtia rukam Zoll et Mor., were collected in 11/2016 at Co To mountain, An Giang Methods Extraction, seperation, isolation and purification as routine work Structure elucidations were based on NMR and MS spectrometric method In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant effects and inhibitory effects of xanthin oxidase were performed on TLC and 96 well plates Results Chemical composition : 9,4 kg of stem powder was extracted with 96% ethanol to yield 550 g extract, which succesively portioned with solvent to obtain 71 g CHCl3, 40 g EtOAc 94 g MeOH fractions CHCl3 fraction was blended silicagel and distributed solvent to obtain segments From them, mg acid vanilic and 2500 mg poliothrysosid were isolated by chromatography column method Bio-assay screening : Antioxidant effect by DPPH asay: FRT-1 (IC50 = 2,26 µmol); FRT-2 (IC50 = 0,33 µmol) compared with quercetin (IC50 = 0,0041 µmol) Inhibitory xanthin oxidase effect: FRT-1 (IC50 = 0,061 µmol); FRT-2 (IC50 = 0,018 µmol), allopurinol (IC50 = 0,024 µmol) Conclusion F.rukam has potential in decrease acid uric concentration Studies on this bioactivity in different parts from this plant is still in progressing MỤC LỤC s MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ v DANH MỤC CÁC BẢNG vi MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC .2 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Tổng quan họ Flacourtiaceae .2 1.1.3 Tổng quan chi Flacourtia .3 1.1.4 Tổng quan loài Flacourtia rukam 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Flacourtia indica .6 1.2.2 Flacourtia jangomas 1.2.3 Flacourtia inermis .8 1.2.4 Flacourtia rukam 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 17 1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 17 1.3.2 Tác dụng hạ đường huyết 18 1.3.3 Tác dụng bảo vệ gan .19 1.3.4 Tác dụng kháng viêm, giảm đau .20 1.3.5 Tác dụng kháng khuẩn 20 1.3.6 Tác dụng chống sốt rét 22 1.3.7 Tác dụng chống hen 22 1.3.8 Một số tác dụng khác 23 1.3.9 Công dụng y học cổ truyền 24 1.4 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG QUÉT GỐC TỰ DO DPPH 24 1.5 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE 25 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Nguyên liệu .27 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 27 2.1.3 Dung mơi hóa chất 28 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Chiết xuất 29 2.2.2 Tách phân đoạn .29 2.2.3 Xác định độ tinh khiết cao phân đoạn 30 2.2.4 Phân tích sơ thành phần hoá thực vật cao phân đoạn 30 2.2.5 Phân lập tinh chế 30 2.2.6 Thử nghiệm in vitro khả quét gốc tự DPPH tác dụng ức chế xanthine oxidase 32 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .39 3.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ TÁCH PHÂN ĐOẠN 39 3.2 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH QUÉT GỐC TỰ DO DPPH VÀ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE TRÊN CÁC CAO PHÂN ĐOẠN LẮC RẮN LỎNG .43 3.2.1 Sàng lọc hoạt tính quét gốc tự DPPH 43 3.2.2 Sàng lọc hoạt tính ức chế xanthin oxidase 44 3.3 PHÂN LẬP THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 46 3.4 TINH CHẾ, KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 50 3.4.1 Tinh chế, kiểm tra độ tinh khiết 50 3.4.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 54 3.5 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH QUÉT GỐC TỰ DO DPPH VÀ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE TRÊN CÁC CHẤT KẾT TINH 57 3.5.1 Thử nghiệm hoạt tính quét gốc tự DPPH 58 3.5.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế xanthin oxidase 59 Chương BÀN LUẬN 62 KẾT LUẬN 65 ĐỀ NGHỊ .66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 73 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt C-NMR 13 H-NMR CHCl3 COSY DĐVN DEPT DPPH DMSO EtOAc EtOH HMBC HPLC HSQC IC50 PO MeOH MIC MS NMR ppm SKLM UV VS Chữ nguyên Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance Chloroform Correlation Spectroscopy Ý nghĩa Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Cloroform Dược điển Việt Nam Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Dimethyl sulphoxid Ethyl acetate Ethanol Heteronuclear Multiple Bond Coherence High Performance Liquid Chromatography Heteronuclear Single Quantum Correlation Inhibitory Concentration 50% Methanol Minimum inhibitory concentration Mass spectroscopy Nuclear Magnetic Resonance Parts per million Ultra violet Vanillin Sulfuric Thuốc thử DPPH Ethyl acetat Ethanol Sắc ký lỏng hiệu cao Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử Đường uống Methanol Nồng độ ức chế tối thiểu Khối phổ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phần triệu Sắc ký lớp mỏng Tia tử ngoại DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Sơ đồ phân loại chi Flacourtia theo Takhtajan Hình 1.2 Đặc điểm hình thái loài F rukam Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất phân bố lỏng lỏng 39 Hình 3.4 Sắc ký đồ so sánh phân đoạn thu sau phân bố lỏng – lỏng .40 Hình 3.5 Sơ đồ chiết tách lỏng rắn 42 Hình 3.6 Sắc ký đồ so sánh phân đoạn thu sau chiết tách lỏng – rắn .43 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân đoạn thu sau sắc ký cột cao G 47 Hình 3.8 Sắc ký đồ phân đoạn thu sau sắc ký cột cao CE 49 Hình 3.9 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết FRT-1 .50 Hình 3.10 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết chất FRT-1 51 Hình 3.11 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết FRT-2 52 Hình 3.12 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết chất FRT-2 53 Hình 3.13 Cấu trúc tương tác HMBC FRT-1 .54 Hình 3.14 Cấu trúc tương tác HMBC, COSY FRT-2 56 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ thử phần trăm quét gốc tự DPPH 59 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ thử phần trăm quét ức chế xanthin oxidase 61 Hình 3.17 Sơ đồ tóm tắt q trình chiết xuất phân lập 63 Hình 3.18 Sơ đồ tóm tắt q trình chiết xuất phân lập 64 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Phổ HMBC (DMSO, 500 MHz) FRT-2 PL.18 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Phổ HMBC (DMSO, 500 MHz) trích vùng δC 110-170 ppm δH 6,2-8,2ppm FRT-2 PL.19 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Phổ HMBC (DMSO, 500 MHz) trích vùng δC 110-170 ppm δH 4,25-4,7ppm FRT-2 PL.20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Phổ COSY (DMSO, 500 MHz) FRT-2 Phổ COSY (DMSO, 500 MHz) trích vùng δH 6,2-8,2 ppm FRT-2 PL.21 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Phổ COSY (DMSO, 500 MHz) trích vùng δH 3,0-5,6 ppm FRT-2 PL.22 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh PL-4 DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG QUÉT GỐC TỰ DO DPPH PL.23 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh PL.24 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh IC50 = 380,11 µg/ml Kết thử tác dụng quét gốc tự DPPH :IC50 FRT-1 PL.25 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh IC50 = 134,55 µg/ml Kết thử tác dụng quét gốc tự DPPH :IC50 FRT-2 PL.26 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh IC50 = 1,23 µg/ml Kết thử tác dụng quét gốc tự DPPH :IC50 Quercetin PL.27 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh PL-5 DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE PL.28 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh PL.29 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh IC50= 10,23 µg/ml Kết thử tác dụng xanthin oxidase :IC50 FRT-1 PL.30 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh IC50= 7,33 µg/ml Kết thử tác dụng xanthin oxidase :IC50 FRT-2 PL.31 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh IC50= 3,26 µg/ml Kết thử tác dụng xanthin oxidase :IC50 Allopurinol PL.32 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÊ PHƯƠNG THẢO KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY HỒNG QUÂN Flacourtia rukam Zoll et Mor. , Flacourtiaceae. .. dược học cổ truyền – Mã số: 8720206 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY HỒNG QUÂN Flacourtia rukam Zoll et Mor. , Flacourtiaceae LÊ PHƯƠNG THẢO Thầy hướng. .. góp phần chứng minh tác dụng Nhận thấy thuốc giàu tiềm năng, không dừng lại tác dụng, đề tài ? ?Khảo sát thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa thân Hồng quân Flacourtia rukam Zoll et