Nghiên cứu sự tương tác giữa protein p53 và protein bcl2 trong quá trình apoptosis gây ra bởi h2o2 trên dòng tế bào ung thư vú người

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN P53 VÀ PROTEIN BCL2 TRONG Q TRÌNH APOPTOSIS GÂY RA BỞI H2O2 TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân Võ Văn Thành Niệm BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN P53 VÀ PROTEIN BCL2 TRONG Q TRÌNH APOPTOSIS GÂY RA BỞI H2O2 TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Chức danh STT Họ tên trình thực Đơn vị cơng tác nhiệm vụ CN Võ Văn Thành Niệm Chủ nhiệm đề tài TS Bùi Chí Bảo Thành viên CN Nguyễn Hoàng Kiều Anh Thành viên Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM Đại học Quốc Tế - Đại học Quốc Gia TP.HCM MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iii CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM iv Độc lập - Tự - Hạnh phúc iv iv ., ngày tháng năm 200 iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu địa điểm Đối tượng vật liệu Phương pháp thí nghiệm 3.1 Nuôi cấy tế bào 3.2 Xử lý H2O2 3.3 Phương pháp dòng chảy tế bào 3.4 Nhuộm miễn dịch 3.5 Phương pháp PLA 3.6 Phân tích liệu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ Khả gây apoptosis H2O2 dòng tế bào ung thư vú 1.1 Sự thay đổi hình thái tế bào 1.2 Sự thay đổi biểu protein phương pháp dòng chảy tế bào 1.2.1 Khả gây apoptosis H2O2 tế bào MCF-7 1.2.2 Khả gây apoptosis H2O2 tế bào MDA-MB-231 1.2.3 So sanh khả gây apoptosis H2O2 dòng tế bào MCF-7 MDAMB-231 10 Sự đồng khu trú P53 BCl-2 dòng tế bào ung thư vú xảy trình apoptosis 10 Tương tác P53 BCl-2 dòng tế bào ung thư vú xảy trình apoptosis 12 CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN 13 i CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 15 Tài liệu tham khảo 16 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT H2O2 Hydro peroxit 7-AAD 7-Amino-Actinomycin TP53 Tumor protein p53 BCL2 B-cell lymphoma PLA Proximity Ligation Assay DANH MỤC HÌNH Hình 1: H2O2 thay đổi kiểu hình tế bào sau 10 phút xử lý Hình 2: Phân tích % tế bào apoptotic xử lý H2O2 0,16M mốc thời gian khác tế bào MCF-7.A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý E: biểu đồ đại diện cho tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn tế bào hoại tử Hình 3: Phân tích % tế bào apoptotic xử lý H2O2 0,16M mốc thời gian khác tế bào MDA-MB-231 A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý E: biểu đồ đại diện cho tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn tế bào hoại tử Hình 4: So sánh tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn tế bào hoại tử xử lý H2O2 0.16M dòng tế bào MCF-7 MDA-MB-231 10 Hình 5: Trong trình apoptosis, P53 BCL-2 đồng khu trú dịng tế bào MCF-7 khơng có dịng tế bào MDA-MB-231 11 Hình 6: Trong trình apoptosis, tương tác P53 BCL-2 xảy dịng tế bào MCF-7 khơng xảy dòng tế bào MDA-MB-231 12 iii CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ., ngày tháng năm 200 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN P53 VÀ PROTEIN BCL2 TRONG QUÁ TRÌNH APOPTOSIS GÂY RA BỞI H2O2 TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Võ Văn Thành Niệm Ngày, tháng, năm sinh: 26/11/1990 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Không Chức danh khoa học: Không Chức vụ: Nghiên cứu viên Điện thoại: Tổ chức: (+84-28) 3855 8411 Nhà riêng: Không Mobile: 0938512888 Fax: Không E-mail: thanhniem2611@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Địa tổ chức: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM Địa nhà riêng: 306/20 Quốc lộ 50, thị trấn Cần Giuộc, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1): Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: (+84-28) 3855 8411 Fax: (+84-28) 3855 2304 E-mail: daihocyduoc@ump.edu.vn Website: http://yds.edu.vn/yds2/ Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM Tên Khoa Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài iv Tên quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 - Được gia hạn (nếu có): Khơng Từ tháng… năm… đến tháng… năm… Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học nhà trường: tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Thực tế đạt Theo kế hoạch Ghi Số TT Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đề nghị (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) năm 2018 đến tháng năm 2019 5 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Thực tế đạt Theo kế hoạch Số Nội dung TT khoản chi Tổng NSKH Nguồn khác Tổng NSKH Nguồn khác Trả công lao động (khoa học, phổ thông) 5 5 Nguyên, vật liệu, lượng 0 0 0 Thiết bị, máy móc 0 0 0 v Xây dựng, sửa chữa nhỏ 0 0 0 Chi khác 0 0 0 5 5 Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức tham gia thực Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Võ Văn Thành Niệm Chủ nhiệm đề tài Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Võ Văn Thành Niệm Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Thực tế đạt Theo kế hoạch Số TT (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) vi Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục .của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Thời gian Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế hoạch Thực tế đạt Nuôi tế bào 4-5 /2018 4-5 /2018 Độc tính tế bào 6-7 /2018 6-7 /2018 Thiết kế mồi chuyên biệt cho gene ARID1A 7-9 /2018 7-9 /2018 Tách chiết RNA 10-11 /2018 10-11 /2018 Tổng hợp cDNA 11-12 /2018 11-12 /2018 Khuếch đại gene ARID1A 1-2 /2019 1-2 /2019 vii Người, quan thực Trong nghiên cứu này, tương tác P53 BCL-2 MCF-7 (P53 loại hoang dã) MDA-MB-231 (P53 đột biến ) nghiên cứu Liều H2O2 sử dụng để gây apoptosis phân tích phương pháp dịng chảy tế bào, tín hiệu đồng khu trú xác định nhuộm miễn dịch huỳnh quang, tương tác protein xác nhận phương pháp PLA Giả thuyết ảnh hưởng đến tương tác P53 BCL-2 thay đỗi cấu trúc P53, nên tế bào P53 đột biến (MDA-MB-231), tín hiệu đồng khu trú tương tác P53-BCL-2 đáng kể tế bào P53 kiểu hoang dã (MCF-7) Bất kể, tỷ lệ apoptosis MDA-MB231, so với MCF-7, điều trị thấp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu địa điểm Nghiên cứu thực phịng thí nghiệm Thần kinh học Liệu pháp miễn dịch, Trung tâm Sinh học phân tử Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Đối tượng vật liệu Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 MDA-MB-231 q tặng từ đối tác nước ngồi phịng thí nghiệm Các kháng thể sử dụng cho miễn dịch huỳnh quang: P53 ( độ pha loãng 1/100, Cơng nghệ sinh học Santa Cruz), BCL-2 (độ pha lỗng 1: 100, Công nghệ sinh học Santa Cruz), kháng thể thứ cấp IgG Alexa (độ pha loãng 1: 2000, Invitrogen) Bộ hóa chất phát Apoptosis (The PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I - BD Biosciences, Sandiego, CA) Bộ hóa chất phát tương tác protein ( Duolink® In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit - DUO92101, Sigma-Aldrich) Phương pháp thí nghiệm 3.1 Ni cấy tế bào Các dịng tế bào sử dụng nghiên cứu MDA-MB-231 MCF-7 MDAMB-231 MCF-7 (ATCC) tăng trưởng thường xun mức 5% CO2, 95% khơng khí 37oC DMEM chứa 10 mM glucose bổ sung 10% FBS, mM pyruvate, HEPES 10mM, 50μM 2-mercaptoethanol, 100U penicillin / mL 100g streptomycin / mL trước thí nghiệm 3.2 Xử lý H2O2 H2O2 thương mại với nồng độ tính tốn 1,6M Các tế bào cấy vào đĩa giếng (3 x 105 tế bào / giếng) nuôi cấy 24 Sau đó, tế bào rửa với 1x PBS xử lý 0,16 M H2O2 ml mơi trường ni cấy Các tế bào sau ổn định 37oC, 5% CO2 95% không khí 10 phút sau tế bào rửa hai lần với 1X PBS 3.3 Phương pháp dòng chảy tế bào Các dòng tế bào MDA-MB-231 MCF-7 cấy (105 tế bào / đĩa) vào đĩa nuôi cấy 60 mm với môi trường ml DMEM + 10% FBS ổn định 24 môi trường 5% CO2 Tiếp theo, tế bào xử lý môi trường nuôi cấy (đối chứng) 0,16M H2O2 với thời gian thay đổi sau: 10 phút, 20 phút, 60 phút 90 phút Bộ hóa chất phát apoptosis sử dụng để đánh giá apoptosis Cụ thể tế bào rửa hai lần PBS lạnh tất dung dịch rửa thu thập falcol 15 ml Sau đó, 200μL Trypsin 1X sử dụng để tách tế bào lại tất tế bào ly tâm đhuyền phù dung dịch đệm Binding 1ml với mật độ 1x106 tế bào / ml trước chuyển 1x105 tế bào sang eppendoft nhuộm với 5μL Anexin V 7-Amino-Actinomycin (7-AAD), lắc nhẹ ủ 15 phút nhiệt độ phịng bóng tối Cuối cùng, thêm 400 μL dung dịch Binding vào eppendorf, trước phân tích phương pháp dòng chảy tế bào 5000 tế bào phân tích phản ứng máy BD FACSCanto II (BD Bioscatics, Sandiego, CA) Chứng âm thiết lập tế bào không nhuộm nhuộm màu Anexin V 7AAD, chứng dương sử dụng 10% H2O2 Phần mềm BD FACSDiva sử dụng để phân tích liệu 3.4 Nhuộm miễn dịch Các tế bào cấy slide tám buồng (3 x 104 tế bào / giếng) Sau xử lý, slide rửa với 1x PBS, cố định 4% formaldehyd phút, đtăng tinh thấm màng tế bào 0,01% Triton X-100 37oC 30 phút bị khóa huyết 5% PBS phòng nhiệt độ Các tế bào ủ với P53 (1: 100) nhiệt độ phòng rửa lần với 1x PBS Sau chúng ủ với MDM2 (1: 100) / BCL-2 (1: 100) 4oC qua đêm Các slide rửa lần PBS nhuộm với kháng thể phát huỳnh quang nhiệt độ phòng Nhân tế bào nhuộm với DAPI 3.5 Phương pháp PLA Các tế bào gieo hạt slide tám buồng (3 x 104 tế bào / giếng) Sau điều trị định, slide rửa với 1x PBS, cố định 4% formaldehyd phút, thấm 0,01% Triton X-100 37oC 30 phút bị chặn huyết tăng trưởng 5% PBS phòng nhiệt độ Các tế bào ủ với P53 (1: 100) nhiệt độ phòng rửa lần với 1x PBS Sau chúng ủ với BCL-2 (1: 100) 4oC qua đêm Các slide rửa lần PBS tiếp tục nhuộm phát tương tác kít thương mại PLA theo quy trình nhà sản xuất 3.6 Phân tích liệu Tất liệu trình bày dạng trung bình ± độ lệch chuẩn giá trị trung bình (SE) ba lần lặp lại Các tính tốn thống kê thực ANOVA hai chiều phần mềm vẽ biểu đồ liệu GraphPad Prism Holm-testídák sử dụng để phân tích khác biệt nhóm CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ Khả gây apoptosis H2O2 dòng tế bào ung thư vú 1.1 Sự thay đổi hình thái tế bào Sự khác biệt hình thái tế bào trước sau xử lý kiểm tra kính hiển vi độ phóng đại 100X Hình 1: H2O2 thay đổi kiểu hình tế bào sau 10 phút xử lý 1.2 Sự thay đổi biểu protein phương pháp dòng chảy tế bào Hiệu gây apoptosis H2O2 dòng tế bào MCF-7 MDA-MB-231 đo phương pháp tế bào học dòng chảy Nồng độ H2O2 (0,16M) giữ không đổi thời gian xử lý thay đổi sau: 10 phút, 20 phút, 60 phút 90 phút Đối với dòng tế bào, phương pháp điều trị 10 phút chứng minh mang lại kết mong muốn - tỷ lệ apoptosis sớm cao với số lượng apoptosis muộn chấp nhận 1.2.1 Khả gây apoptosis H2O2 tế bào MCF-7 Cũng suy từ biểu đồ xử lý 10 phút có tỷ lệ tế bào apoptosis sớm cao (33,40%) tỷ lệ thấp tế bào apoptosis muộn (33,20%) số lơ xử lý Hình 2: Phân tích % tế bào apoptotic xử lý H2O2 0,16M mốc thời gian khác tế bào MCF-7.A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý E: biểu đồ đại diện cho tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn tế bào hoại tử 1.2.2 Khả gây apoptosis H2O2 tế bào MDA-MB-231 Tương tự vậy, tỷ lệ tế bào apoptosis sớm cao điều trị 10 phút (18,60%), với tỷ lệ thấp tế bào apoptosis muộn (12,50%) Hình 3: Phân tích % tế bào apoptotic xử lý H2O2 0,16M mốc thời gian khác tế bào MDA-MB-231 A: 10 phút, B: 20 phút, C: 60 phút, D: 90 phút xử lý E: biểu đồ đại diện cho tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn tế bào hoại tử 1.2.3 So sanh khả gây apoptosis H2O2 dòng tế bào MCF-7 MDA-MB-231 Biểu đồ xây dựng để so sánh hiệu gây apoptotic điều trị H2O2 10 phút hai dịng tế bào Có thể thấy rõ, tế bào MDA-MB-231, có tỷ lệ tế bào khả thi cao gần gấp đôi so với tế bào MCF-7, cho thấy khả kháng H2O2 vượt trội so với tế bào chúng Hình 4: So sánh tỷ lệ phần trăm tế bào sống, apoptosis sớm, apop apoptosis muộn tế bào hoại tử xử lý H2O2 0.16M dòng tế bào MCF-7 MDA-MB-231 Sự đồng khu trú P53 BCl-2 dòng tế bào ung thư vú xảy trình apoptosis P53 BCL-2 tương ứng miễn dịch thuốc nhuộm bột màu xanh (AF 488) đỏ (AF 633) sau xử lý 10 phút 0,16M H2O2 Các tế bào sau quan sát kính hiển vi huỳnh quang với mục tiêu công suất cao 40x Các tín hiệu colocalization 10 xác định tích hợp hai màu - vàng, có bước sóng nằm khoảng từ 597 nm 577nm- (Hình 5) Hình 5: Trong trình apoptosis, P53 BCL-2 đồng khu trú dịng tế bào MCF-7 khơng có dịng tế bào MDA-MB-231 11 Tương tác P53 BCl-2 dòng tế bào ung thư vú xảy trình apoptosis Hình 6: Trong trình apoptosis, tương tác P53 BCL-2 xảy dòng tế bào MCF-7 khơng xảy dịng tế bào MDA-MB-231 12 CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN Như nói trên, apoptosis đóng vai trị quan trọng phát triển khối u thông qua tương tác với tăng sinh q trình phát triển bệnh Nhân tố quan trọng trình apoptosis độc lập phiên mã P53, chứng minh kết hợp với BCL-2 để bắt đầu kiện H2O2 sử dụng làm thuốc thử gây apoptotic thí nghiệm Trong liều khuyến cáo dao động từ 100 - 500 μM 20 phút, tác giả sợ liều nhỏ khơng hiệu nồng độ thuốc thử pha lỗng Do đó, phần mười H2O2 (0,16M) mơi trường nuôi cấy sử dụng thời gian thử nghiệm thay đổi sau: 10, 20, 60 90 phút Về khác biệt hình thái, khơng thấy có thay đổi rõ rệt hai dòng tế bào trước sau điều trị Vì kiện liên kết P53 BCL-2 khởi đầu trình apoptosis độc lập phiên mã, số lượng tế bào có tương tác P53 - BCL-2 trải qua trình apoptosis sớm Trong chuỗi thử nghiệm apoptosis này, thực tính sẵn có Apoptosis Tuy nhiên, kết đủ khác biệt đó, đáng tin cậy Nói chung, phương pháp điều trị 10m chọn để thực thí nghiệm hiệu việc tạo tỷ lệ đủ tế bào apoptosis sớm (33,40% MCF-7, 18,60% MDA-MB-231) với số lượng tế bào khả thi hợp lý ( 28,50% MCF-7, 66,0% MDA-MB-231) không gây tỷ lệ apoptosis muộn không cân xứng (33,20% MCF-6, 12,50% MDA-MB231) Bất kể, việc xử lý 10m 0,16M H2O2 cho thấy hiệu mạnh mẽ MCF-7 MDAMB-231 Tuy nhiên, MDA-MB-231 cho thấy khả kháng H2O2 cao MCF-7 tính chất đột biến protein P53 Cụ thể, P53 mặt chức quan trọng để kích hoạt trình apoptosis gây căng thẳng genoto [9] P53 đột biến chứng minh có khả [10] Để nghiên cứu khả tương tác protein nghiên cứu, miễn dịch huỳnh quang tiến hành Đối với đồng định vị P53 - BCL-2, kết thống kê khẳng định lại tương tác hai protein trường hợp apoptosis Trong dòng tế bào MCF-7 với P53 kiểu hoang dã, tế bào điều khiển cho thấy lượng tín hiệu đồng định vị đáng kể, tế bào xử lý có số lượng tín hiệu lớn đáng kể (60,15% ± 3,92, P