Tổng hợp theo định hướng và đánh giá tác động ức chế enzym α amylase và α glucosidase của một số dẫn chất flavonoid

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THANH THẢO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TỔNG HỢP THEO ĐỊNH HƯỚNG VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM α-AMYLASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT FLAVONOID Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TỔNG HỢP THEO ĐỊNH HƯỚNG VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM α-AMYLASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT FLAVONOID Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thụy Việt Phương GS.TS Trần Thành Đạo Họ tên học viên: Nguyễn Thanh Thảo Lớp: Cao học 2018-2020 Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm Bào chế thuốc Mã số: 8720202 Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Người cam đoan Nguyễn Thanh Thảo Luận văn Thạc sĩ Dược học – Năm học 2018-2020 “Tổng hợp theo định hướng đánh giá tác động ức chế enzym α-amylase α-glucosidase số dẫn chất flavonoid” Nguyễn Thanh Thảo Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thụy Việt Phương GS.TS Trần Thành Đạo Mở đầu Kiểm soát tăng đường huyết sau ăn cách làm chậm hấp thu glucose thông qua ức chế enzym thủy phân carbohydrat α-amylase α-glucosidase cách tiếp cận điều trị bệnh đái tháo đường type Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu kết hợp sàng lọc in silico để định hướng tổng hợp đánh giá hoạt tính in vitro thực hai enzym với dẫn chất flavonoid tiềm Đề tài đặt mục tiêu tổng hợp theo định hướng đánh giá tác động ức chế enzym α-amylase α-glucosidase số dẫn chất flavonoid Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đề tài tiến hành sàng lọc in silico thơng qua q trình gắn kết phân tử (molecular docking), 1046 flavonoid enzym mục tiêu α-amylase (PDB id: 4GQR) αglucosidase (PDB id: 2QMJ) Kết sau trình sàng lọc, thu dẫn chất benzylaminochalcon tiềm tiến hành tổng hợp phương pháp ngưng tụ Claisen-Schmidt nhiệt độ phòng có hỗ trợ vi sóng Các dẫn chất tổng hợp đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-amylase α-glucosidase in vitro so với chất đối chiếu acarbose phương pháp: phương pháp thuốc thử iod với α-amylase tụy lợn, đo quang bước sóng 660 nm; phương pháp sử dụng chất p-Nitrophenyl-α-Dglucopyranosid (p-NPG) với α-glucosidase nấm men đo quang bước sóng 415 nm Kết Kết 1041 gắn kết vào khoang tác động mục tiêu enzym α-amylase (PDB id: 4GQR) enzym α-glucosidase (PDB id: 2QMJ) với lượng dao động từ 10,9 kcal/mol đến -6,4 kcal/mol (enzym α-amylase) từ -9,0 kcal/mol đến -4,8 kcal/mol (enzym α-glucosidase) Sau sàng lọc, dẫn chất thuộc cấu trúc khung flavanon, flavon chalcon có lượng liên kết tốt thể tiềm ức chế enzym Tổng cộng 12 dẫn chất benzylaminochalcon tiềm lựa chọn, tổng hợp đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-amylase enzym αglucosidase Kết thu dẫn chất TC5, TC7 TC8 có khả ức chế tốt hai enzym mục tiêu, với giá trị IC50 38,62 µg/mL; 105,22 µg/mL; 3,81 µg/mL so với acarbose (184,86 µg/mL) xác định α-glucosidase; I% tương ứng 20,47 ± 1,46%; 21,85 ± 1,38%; 17,45 ± 1,57% so với acarbose (15,22 ± 0,81%) nồng độ 15,625 µg/mL xác định α-amylase Kết luận Nghiên cứu bước đầu cung cấp liệu dẫn chất benzylaminochalcon tiềm trình nghiên cứu thuốc điều trị bệnh đái tháo đường tương lai Từ khóa: α-amylase, α-glucosidase, flavonoid, benzylaminochalcon, in silico, in vitro Final thesis for the Master’s degree of Pharmacy – Academic year: 2018 - 2020 Oriented-synthesis and investigation of inhibiting enzymes α-amylase and αglucosidase of some flavonoid derivatives Nguyen Thanh Thao Supervisor: Nguyen Thuy Viet Phuong, Ph.D Tran Thanh Dao, Prof, Ph.D Introduction Controlling postprandial hyperglycemia by decreasing glucose uptake through inhibition of the carbohydrates hydrolyzed enzymes namely α-amylase and αglucosidase is one of the approaches to the treatment of type diabetes However, there have not been any studies on flavonoids through combining in silico screening for the synthesis and in vitro biological testing for both enzymes In this study aimed to synthesis then investigate the inhibitory activity of these flavonoids on enzymes αamylase and α-glucosidase Materials and methods This study included molecular docking with two target enzymes α-amylase (PDB id: 4GQR) and α-glucosidase (PDB id: 2QMJ), a total of 1046 substances were screened The results obtained through virtual screening, potential benzylaminochalcon derivatives were synthesized from original-material 4-aminoacetophenon by ClaisenSchmidt condensation method at room temperature or with microwave assistance The biological activity of synthetized derivatives were assessed on these enzymes in vitro by two methods: iodine reagent method with pig pancreatic α-amylase, measured photometrically at 660 nm; The method using p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (p-NPG) substrate with yeast α-glucosidase measured photometrically at 415 nm Results and discussion 1041 compounds were docked to the active site of targets, α-amylase enzyme (PDB id: 4GQR) and enzyme glucosidase (PDB id: 2QMJ) with binding affinities ranging from -10.9 kcal/mol to -6.4 kcal/mol (enzyme α-amylase) and -9.0 kcal/mol to -4.8 kcal/mol (enzyme α-glucosidase) The screening results showed that potential flavonoids belonging to flavanon, flavon and chalcon had a good binding affinities A total of 12 potential benzylaminochalcon derivatives were selected and synthesized Of which, new substances and synthetized substances were synthesized and determined for their structure and purities Three benzylaminochalcon TC5, TC7 and TC8 having good inhibitory abilities compared to acarbose on both target enzymes, with IC50 values of 38.62 µg/mL, 105.22 µg/m, 3.81 µg/mL, respectively on α-glucosidase in comparision to acarbose (184.86 µg/mL) towards to α-glucosidase The percentage of inhibitory activity (I%) of these benzylaminochalcon on α-amylase were also evalutated with their I% of 20.47 ± 1.46%, 21.85 ± 1.38%, 17.45 ± 1.57% compared to acarbose (15.22 ± 0.81%) in concentration 15.625 µg/mL determined α-amylase Conclusion This study provided useful information of benzylaminochalcon derivatives as potential inhibitors for both α-glucosidase and α-amylase enzymes leading to drug development for the treatment of type diabetes Keywords: α-amylase, α-glucosidase, flavonoid, benzylaminochalcon, in silico, in vitro MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1.1.1 Khái quát bệnh đái tháo đường 1.1.2 Nguyên nhân phân loại bệnh đái tháo đường 1.1.3 Chẩn đoán điều trị bệnh đái tháo đường 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ α-AMYLASE 1.2.1 Cấu trúc enzym α-amylase tụy người (HPA) 1.2.2 Hoạt động xúc tác α-amylase 1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ α-GLUCOSIDASE 10 1.3.1 Cấu trúc enzym maltase-glucoamylase 11 1.3.2 Hoạt động xúc tác NtMGAM 12 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN ENZYM α-AMYLASE VÀ αGLUCOSIDASE TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 13 1.4.1 Nghiên cứu giới 13 1.4.2 Nghiên cứu nước 15 1.5 HỢP CHẤT FLAVONOID 17 1.5.1 Cấu trúc hóa học 19 1.5.2 Phương pháp tổng hợp 21 1.6 MƠ HÌNH SÀNG LỌC IN SILICO 24 1.6.1 Giới thiệu 24 1.6.2 Gắn kết phân tử (molecular docking) 25 1.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-AMYLASE VÀ αGLUCOSIDASE IN VITRO 29 1.7.1 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro 29 1.7.2 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro 30 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Gắn kết phân tử (molecular docking) 33 2.1.2 Đối tượng tổng hợp 34 2.1.3 Thử nghiệm khả ức chế α-amylase α-glucosidase in vitro 37 2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 37 2.2.1 Nguyên liệu 37 2.2.2 Trang thiết bị 39 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.3.1 Gắn kết phân tử (molecular docking) 40 2.3.2 Phương pháp tổng hợp 44 2.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế α-amylase 50 2.3.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ 55 3.1 SÀNG LỌC IN SILICO 55 3.1.1 Về lượng gắn kết (điểm số docking) 58 3.1.2 Kết phân tích tương tác flavonoid hai enzym mục tiêu 59 3.1.3 Chọn lựa chất tiềm cho tổng hợp 61 3.2 KẾT QUẢ TỔNG HỢP 66 3.2.1 Tổng hợp 1-(4-((2-hydroxybenzyliden)amino)phenyl)ethanon 66 3.2.2 Tổng hợp 1-(4-((2-hydroxybenzyl)amino)phenyl)ethanon (Amin1) 67 3.2.3 Tổng hợp 1-(4-((4-hydroxybenzyl)amino)phenyl)ethanon (Amin2) 68 3.2.4 Tổng hợp benzylaminochalcon TC1 69 3.2.5 Tổng hợp benzylaminochalcon TC2 70 3.2.6 Tổng hợp benzylaminochalcon TC3 71 3.2.7 Tổng hợp benzylaminochalcon TC4 73 .i 3.2.8 Tổng hợp benzylaminochalcon TC5 74 3.2.9 Tổng hợp benzylaminochalcon TC6 75 3.2.10 Tổng hợp benzylaminochalcon TC7 77 3.2.11 Tổng hợp benzylaminochalcon TC8 78 3.2.12 Tổng hợp benzylaminochalcon TC9 79 3.2.13 Tổng hợp benzylaminochalcon TC10 80 3.2.14 Tổng hợp benzylaminochalcon TC11 82 3.2.15 Tổng hợp benzylaminochalcon TC12 83 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-AMYLASE VÀ α-GLUCOSIDASE IN VITRO 84 3.3.1 Thử nghiệm khả ức chế α-amylase 84 3.3.2 Thử nghiệm khả ức chế α-glucosidase 86 CHƯƠNG BÀN LUẬN 90 4.1 KẾT QUẢ SÀNG LỌC 90 4.2 KẾT QUẢ TỔNG HỢP 93 4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYM IN VITRO 95 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99 5.1 KẾT LUẬN VẤN ĐỀ 99 5.1.1 Sàng lọc in silico 99 5.1.2 Tổng hợp 99 5.1.3 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym in vitro 100 5.2 KIẾN NGHỊ 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 PHỤ LỤC Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-75 Phụ lục 13.4 Phổ 1H NMR TC10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-76 Phụ lục 13.5 Phổ 1H NMR dãn rộng TC10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-77 Phụ lục 13.6 Phổ 13C NMR mẫu TC10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-78 Phụ lục 14 Các phổ TC11 Phụ lục 14.1 Phổ MS TC11 CTPT: C22H17Cl2NO2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn P.t.l: 398,28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-79 Phụ lục 14.2 Phổ UV TC11 Phụ lục 14.3 Phổ IR TC11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-80 Phụ lục 14.4 Phổ 1H NMR TC11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-81 Phụ lục 14.5 Phổ 1H NMR dãn rộng TC11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-82 Phụ lục 14.6 Phổ 13C NMR mẫu TC11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-83 Phụ lục 15 Các phổ TC12 Phụ lục 15.1 Phổ MS TC12 CTPT: C22H18F3NO2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn P.t.l: 397,40 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-84 Phụ lục 15.2 Phổ UV TC12 Phụ lục 15.3 Phổ IR TC12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-85 Phụ lục 15.4 Phổ 1H NMR TC12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-86 Phụ lục 15.5 Phổ 1H NMR dãn rộng TC12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-87 Phụ lục 15.6 Phổ 13C NMR mẫu TC12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-88 Phụ lục 15.7 Phổ 13C NMR dãn rộng mẫu TC12 (1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-89 Phụ lục 15.8 Phổ 13C NMR dãn rộng mẫu TC12 (2) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... cứu ? ?Tổng hợp theo định hướng đánh giá tác động ức chế enzym α- amylase α- glucosidase số dẫn chất flavonoid? ?? thực Mục tiêu tổng quát Tổng hợp theo định hướng đánh giá tác động ức chế enzym α- amylase. .. hợp đánh giá hoạt tính in vitro thực hai enzym với dẫn chất flavonoid tiềm Đề tài đặt mục tiêu tổng hợp theo định hướng đánh giá tác động ức chế enzym α- amylase α- glucosidase số dẫn chất flavonoid. .. BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TỔNG HỢP THEO ĐỊNH HƯỚNG VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM α- AMYLASE VÀ α- GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT