Một số vấn đề về di truyền học (Phân tích & sản phẩm gen)

Một số vấn đề di truyền học (Phân tích & sản phẩm gen) V Phân tích gen sản phẩm gen V.1 Các kỹ thuật phân tích axit nucleic V.1.1 Điện di phân tích ADN ARN Có nhiều phương pháp khác sử dụng để phân tích ADN ARN, điện di gel phương pháp sử dụng phổ biến nhờ ưu điểm nhanh tương đối đơn giản Nguyên tắc phương pháp do: tác động điện trường, phân tử ADN (thường tích điện âm) khác kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) di chuyển qua hệ mạng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác Vì vậy, chúng tách trường điện di, qua người ta thu thập phân tích phân đoạn ADN gen riêng rẽ Trên điện trường phân đoạn ADN có kích thước nhỏ có tốc độ di chuyển điện trường nhanh Sau điện di kết thúc, phân tử ADN quan sát thấy nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang, chẳng hạn ethidium (chất gắn kết với ADN cách cài vào khe nucleotit) Mỗi băng điện di thường phản ánh tập hợp phân tử ADN có kích thước Có hai loại vật liệu làm gel sử dụng phổ biến điện di, agarose polyacrylamid Trong đó, gel polyacrylamid có khả phân tách cao, khoảng kích thước ADN phân tích hẹp Vì vậy, điện di gel polyacrylamid phân tách phân đoạn ADN khác trí cặp nucleotit (1 bp) nhất, thường để phân tích đoạn ADN kích thước vài trăm bp Cịn gel agarose có khả phân tách thấp phân đoạn ADN kích thước nhỏ, hiệu phân tách phân đoạn ADN kích thước lớn tới hàng chục hàng trăm kb (1 kb = 1000 bp) Các phân đoạn ADN kích thước lớn khơng thể “lọt” qua lỗ có kích thước nhỏ gel, kể gel agarose Thay vào đó, chúng “trườn” qua mạng lưới gel việc đầu phân tử trước, đầu theo sau Kết phân đoạn ADN kích thước lớn (từ 30 đến 50 kb) có tốc độ di chuyển điện trường gần tương đương khó phân tách phương pháp điện di thông thường Đối với phân đoạn ADN kích thước lớn vậy, người ta phân tách việc sử dụng phương pháp điện di xung trường (pulsed-field gel electrophoresis) Trong phương pháp này, người ta sử dụng cặp điện cực nằm chéo góc điện di Việc “bật” “tắt” luân phiên cặp điện cực làm cho phân đoạn ADN lớn thay đổi chiều Các phân đoạn ADN có kích thước lớn chậm trình thay đổi chiều di chuyển Nhờ vậy, phân đoạn có kích thước khác phân tách khỏi trình di chuyển Kỹ thuật điện di xung trường thực tế sử dụng để xác định kích thước đầy đủ nhiễm sắc thể vi khuẩn, nhiễm sắc thể loài sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, nấm men Những lồi có kích thước hệ gen khoảng vài Mb Điện di khơng phân tách phân đoạn ADN khác kích thước mà hình dạng cấu hình không gian chúng Các phân tử ADN dạng mạch vòng giãn xoắn bị “đứt gãy” số nucleotit di chuyển chậm trường điện di so với phân tử ADN dạng mạch thẳng có khối lượng Tương tự vậy, phân tử ADN dạng siêu xoắn, kích thước thể tích thu nhỏ thường di chuyển nhanh trường điện di so với phân tử ADN dạng mạch vịng giãn xoắn có mức độ cuộn xoắn thấp có khối lượng Kỹ thuật điện di sử dụng để phân tách phân tử ARN Các phân đoạn ADN sợi kép mạch thẳng có cấu trúc bậc hai đồng nên tốc độ di chuyển trường điện di tương quan tỉ lệ thuận với khối lượng phân tử chúng Cũng giống ADN, phân tử ARN thường tích điện âm, cấu trúc dạng mạch đơn, cấu trúc bậc phân tử ARN có ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển chúng trường điện di Để hạn chế điều này, thông thường người ta phải xử lý ARN với số hóa chất ngăn cản hình thành liên kết cục phân tử ARN, chẳng hạn glyoxal Hợp chất liên kết với nhóm -NH2 bazơ nitơ ngăn cản kết cặp nucleotit Các phân tử ARN xử lý glyoxal không hình thành cấu trúc bậc có tốc độ di chuyển trường điện di dường đơn phụ thuộc vào khối lượng phân tử chúng V.1.2 Sử dụng enzym giới hạn phân tích ADN Hầu hết phân tử ADN tự nhiên lớn nhiều so với kích thước thao tác phân tích cách thuận lợi phịng thí nghiệm Trong tế bào, phần lớn nhiễm sắc thể thường phân tử ADN dài chứa hàng trăm trí hàng nghìn gen khác Vì vậy, để phân lập phân tích gen, người ta phải cắt phân tử ADN kích thước lớn thành phân đoạn nhỏ Cơng việc thực nhóm enzym đặc biệt gọi enzym giới hạn Tất enzym giới hạn có hai đặc tính: 1) nhận biết trình tự đặc hiệu phân tử ADN (gọi trình tự giới hạn); 2) cắt bên phân tử ADN vị trí đặc hiệu (hoặc vị trí giới hạn nhóm enzym giới hạn loại ; cách vị trí giới hạn số nucleotit định nhóm enzym giới hạn thuộc nhóm ) Trong nhóm enzym giới hạn, nhóm thường dùng nghiên cứu di truyền phân tử kỹ nghệ gen nhóm nhờ vị trí trình tự cắt chúng xác định rõ Vì đề cập đến việc ứng dụng nhóm enzym giới hạn Các trình tự giới hạn enzym nhóm thường gồm bp, thơng thường có tính đối xứng vị trí cắt thường nằm trình tự giới hạn Ví dụ enzym giới hạn coR tìm thấy vi khuẩn E coli có trình tự giới hạn 5’GAATTC- 3’ với vị trí cắt G A Tên enzym gồm ký tự đầu tên loài vi khuẩn mà từ enzym tìm thấy (Eco = Escherichia coli), ký tự sau tên chủng vi khuẩn số thứ tự enzym tìm thấy lồi vi khuẩn (EcoRI enzym giới hạn tìm thấy E coli) phân đoạn ADN tương ứng với vùng phân tử ADN ban đầu Việc sử dụng enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII có trình tự giới hạn gồm bp, có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT- 3’) cho sản phẩm cắt khác với sử dụng EcoRI (với phân tử ADN ban đầu) Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn tạo kiểu hình phổ điện di phân đoạn cắt giới hạn đặc thù gen phân tích Đối với số enzym giới hạn khác, chẳng hạn Sau3A1 (tìm thấy vi khuẩn Staphylococcus aureus) có trình tự giới hạn ngắn (5’-GATC3’), nên tần số cắt chúng thường cao enzym có trình tự giới hạn dài Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình vị trí cắt đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256) Ngược lại, enzym NotI có trình tự giới hạn dài (5’GCGGCCGC-3’) trung bình đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, có vị trí cắt (1/48 = 1/65536) Các enzym giới hạn khơng khác trình tự giới hạn độ dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng chúng, mà chúng khác cách “cắt” phân tử ADN Chẳng hạn enzym HpaI tạo phân tử ADN dạng đầu (đầu tù), enzym ERcoRI, HindIII PsIt cắt phân tử ADN tạo phân đoạn có đầu dính Sở dĩ gọi “đầu dính” phần trình tự hai đầu sau enzym cắt bổ trợ với theo ngun tắc Chargaff chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, với phân tử ADN cắt loại enzym giới hạn Tính chất ứng dụng rộng rãi công nghệ ADN tái tổ hợp kỹ thuật tách dòng phân tử V.1.3 Các phương pháp lai phân tử mẫu dò Các phân tử ADN sợi kép có tính chất đặc biệt khả biến tính (phân tách thành hai mạch đơn) hồi tính (hai mạch đơn có trình tự bổ trợ có xu hướng liên kết trở lại vắng mặt tác nhân gây biến tính) Khả liên kết bổ trợ bazơ nitơ cho phép hai mạch ADN có nguồn gốc khác có trình tự bổ trợ liên kết với điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH, ion hóa P) để tạo nên phân tử ADN Hiện tượng liên kết xảy hai mạch ADN với nhau, hai mạch ARN ADN ARN Phân tử axit nucleic sợi kép hình thành gọi phân tử lai trình kết cặp bazơ thuộc hai mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác theo nguyên tắc bổ trợ gọi trình lai phân tử Nhiều kỹ thuật nghiên cứu di truyền phân tử dựa nguyên tắc lai phân tử Chẳng hạn, nguyên tắc người ta dùng trình tự ADN biết trước để xác định trình tự bổ trợ tương ứng có hệ gen mẫu phân tích Phân đoạn ADN có trình tự biết trước dùng phản ứng lai gọi mẫu dị Các mẫu dị có nguồn gốc từ phân đoạn ADN tự nhiên tổng hợp theo nguyên tắc hóa học, để nhận biết chúng, mẫu dò thường đánh dấu với chất phóng xạ phát huỳnh quang (ở đây, gọi tắt chất phát quang) Có hai phương pháp đánh dấu mẫu dị ADN Phương pháp thứ dùng nguyên tắc tổng hợp hóa học phân tử ADN với tiền chất phân tử đánh dấu Phương pháp thứ hai gắn phân tử đánh dấu vào trình tự ADN có sẵn Chẳng hạn, việc sử dụng enzym polynucleotide kinase, người ta bổ sung nhóm phosphat g ATP vào nhóm 5’- OH phân tử ADN định đánh dấu Nếu nhóm phosphat đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P phân tử ADN dánh dấu phóng xạ Phương pháp đánh dấu ADN thứ hai (sử dụng tiền chất đánh dấu) thường thực dựa phản ứng PCR, cần sử dụng đoạn mồi ngắn cho enzym ADN polymerase thực phản ứng kéo dài chuỗi Các tiền chất đánh dấu sử dụng thường loại nucleotit cải biến thành dạng đánh dấu cách gắn với nhóm chất phát quang nguyên tử phóng xạ Với phương pháp này, khoảng 25% nucleotit phân tử ADN đánh dấu điều đủ đáp ứng hầu hết nhu cầu nghiên cứu khác Các phân tử ADN đánh dấu với tiền chất phát quang phát cách chiếu xạ mẫu ADN với ánh sáng UV có bước sóng phù hợp đo bước sóng phát xạ tương ứng Các phân tử ADN đánh dấu phóng xạ thường phát cách chụp mẫu ADN với phim tia X, đo máy khuếch đại tín hiệu hạt b từ nguyên tố phóng xạ 32P 35S (đây hai nguyên tố phóng xạ sử dụng phổ biến để dánh dấu ADN) Trong nghiên cứu di truyền học phân tử nay, có nhiều cách để xác định phân đoạn ADN ARN đặc hiệu dựa phương pháp lai đây, đề cập đến hai phương pháp dùng phổ biến: Xác định phân đoạn ADN ARN điện di mẫu dò Phương pháp sử dụng mẫu dò kết hợp với điện di phương pháp giúp xác định mức độ phổ biến kích thước đoạn trình tự ADN hoăc ARN quan tâm nghiên cứu Chẳng hạn kỹ thuật này, người ta xác định so sánh mức biểu gen loại tế bào mô khác thông qua định lượng phiên mã mARN tương ứng gen tế bào mơ tương ứng; hay để xác định kích thước đoạn ADN cắt giới hạn mang trình tự gen quan tâm nghiên cứu Giả sử cắt hệ gen nấm men enzym giới hạn EcoR cần xác định kích thước phân đoạn ADN cắt giới hạn mang trình gen A Sản phẩm ADN tổng số sau cắt EcoR tạo số lượng lớn phân đoạn có kích thước xấp xỉ kb (vì 46 = 4096 bp) Vì vậy, đem sản phẩm cắt giới hạn nhuộm với tBr, sản phẩm điện di dải phân đoạn liên tục có kích thước xấp xỉ kb, xác định xác phân đoạn mang gen A Trong trường hợp đó, kỹ thuật thẩm tách Southern (cịn gọi lai Southern) dùng để xác định phân đoạn mang gen Lúc này, người ta đem sản phẩm cắt giới hạn ngâm vào dung dịch có tính kiềm để làm biến tính phân đoạn ADN sợi kép Các phân đoạn sau chuyển sang màng tích điện dương gọi màng "thẩm tách" theo hình thức "đóng dấu" Nghĩa phân đoạn ADN định vị màng thẩm tách tương ứng với phân đoạn định vị gel điện di Các phân đoạn ADN gắn màng thẩm tách sau ủ với mẫu dị phân đoạn ADN chứa đoạn trình tự đặc trưng bổ trợ với trình tự gen A Quá trình ủ tiến hành điều kiện nhiệt độ nồng độ muối tương ứng với biến tính hồi tính axit nucleic Trong điều kiện đó, mẫu dò lai đặc hiệu với phân đoạn ADN mang gen A Do phân đoạn gen có kích thước thường lớn nhiều so với mẫu dị, nên khả hồi tính khó xảy khả lai với mẫu dị Sau đó, nhờ phương pháp phóng xạ tự chụp (mẫu dị đánh dấu phóng xạ), phân đoạn ADN bắt cặp với mẫu dị xác định phân lập rõ ràng Các phân đoạn phân đoạn mang trình tự gen A cần phân tích Một phương pháp tương tự áp dụng trực tiếp để phân tích sản phẩm phiên mã gen mARN, gọi phương pháp thẩm tách Northern (lai Northern) Tuy vậy, so với ADN phân tử mARN thường có kích thước ngắn (khoảng kb), nên thẩm tách Northern, phân tử mARN không cần cắt enzym giới hạn (nếu có cắt số vị trí cắt giới hạn enzym phân tử mARN thường thấp) Các phân tử mARN sau phân tách điện di chuyển lên màng tích điện dương lai với mẫu dị ADN có trình tự bổ trợ tương ứng thường đánh dấu phóng xạ (trong trường hợp này, sản phẩm lai kết cặp bazơ nitơ thuộc hai mạch ARN ADN có trình tự bổ trợ) Trong thực tiễn nghiên cứu, phương pháp thẩm tách Northern thường sử dụng để định lượng loại phân tử mARN định có mẫu phân tích, để xác định kích thước Lượng mARN xác định xem thông số phản ánh mức độ biểu gen mã hóa tương ứng Chẳng hạn như, phương pháp thẩm tách Northern, nhà nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng tác nhân phiên mã đến biểu gen định tiến hành so sánh lượng mARN gen mã hóa có tế bào xử lý khơng xử lý với tác nhân phiên mã Tương tự vậy, kỹ thuật cho phép xác định so sánh mức độ biểu gen khác loại tế bào, mô quan khác thể giai đoạn giai đoạn khác trình phát triển thể Trong kỹ thuật thẩm tách Northern, mẫu dò thường đưa vào phản ứng lai với lượng dư vừa đủ để đảm bảo lượng phân tử lai tạo thành tương ứng với lượng mARN có mặt mẫu nghiên cứu Hay nói cách khác, qua lượng sản phẩm lai, định lượng lượng mARN Nguyên lý phương pháp lai Northern Southern sở kỹ thuật phân tích gen vi dãy phản ứng (microarray) phát triển ngày sử dụng rộng rãi nghiên cứu di ... trình gen A Sản phẩm ADN tổng số sau cắt EcoR tạo số lượng lớn phân đoạn có kích thước xấp xỉ kb (vì 46 = 4096 bp) Vì vậy, đem sản phẩm cắt giới hạn nhuộm với tBr, sản phẩm điện di dải phân đoạn... nghiên cứu di truyền học phân tử nay, có nhiều cách để xác định phân đoạn ADN ARN đặc hiệu dựa phương pháp lai đây, đề cập đến hai phương pháp dùng phổ biến: Xác định phân đoạn ADN ARN điện di mẫu... lập rõ ràng Các phân đoạn phân đoạn mang trình tự gen A cần phân tích Một phương pháp tương tự áp dụng trực tiếp để phân tích sản phẩm phiên mã gen mARN, gọi phương pháp thẩm tách Northern (lai