Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 KHẢO SÁT TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA MỘT SỐ CẶP MỒI ỨNG DỤNG TRONG BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRÊN TÔM SÚ BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Đoàn Thị Minh Nguyệt(1), Trần Thị Tuyết Nga(2), Huỳnh Thị Hồng Phƣợng(2), Nguyễn Hữu Thanh(1) (1)Trường Đại học An Giang; (2) Cơng ty TNHH MTV Sinh hóa PHUSA Ngày nhận 06/04/2019; Ngày gửi phản biện 08/04/2019; Chấp nhận đăng 15/05/2019 Email: dtmnguyet@agu.edu.vn Tóm tắt Sản xuất tơm sú mang lại giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, tôm sú thường hay bị bệnh, bệnh gan vi khuẩn Vì vậy, nhằm giúp phát nhanh bệnh, nghiên cứu thực Nghiên cứu khảo sát cặp mồi đặc hiệu phát nhanh xác vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (VP) gây bệnh hủy hoại gan tủy (AHPND) tôm sú phương pháp PCR thực ba cặp mồi tên V1, V2, V3 Cả cặp mồi có khả làm mồi khuếch đại cho đoạn gene toxR vi khuẩn VP Kết cho thấy V1 cặp mồi đặc hiệu có trình tự mồi xi 5’-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’; mồi ngược 5’-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’ đáp ứng khả phát vi khuẩn VP tôm sú với số đặc điểm: i) nhiệt độ gắn mồi thích hợp 58 oC ii) độ nhạy mồi 186,5 x10-4 ng/µL iii) mồi khơng bắt cặp với trình tự DNA hai loại virus gây bệnh còi Monodon Baculovirus (MBV) bệnh đốm trắng White Spot Syndrome Virus (WSSV) có biểu bệnh gần giống bệnh gây vi khuẩn VP Ứng dụng cặp mồi V1 phát bốn mẫu tôm bị nhiễm VP tám mẫu thu chợ Từ khóa: Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, cặp mồi đặc hiệu Abstract SURVEY ON THE SPECIFIC OF SOME PAIRS APPLYING IN THE KIT FOR QUICK AND ACCURATE DETECTION OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS BACTERIA ON TIGER SHRIMP BY PCR METHOD Shrimp production can bring highly economic values However, shrimp often get infected by bacteria, particularly live disease Thus, to help detect the disease rapidly, this study was conducted The study investiaged specific primers for rapid and accurate detection of Vibrio parahaemolyticus (VP) causing of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in tiger shrimp by PCR, which were performed on three primer pairs called V1, V2, and V3 All three primer pairs have the ability to amplify the toxR gene segment on VP bacteria The results showed that V1 is the most specific primer pair with the forward primer sequence 5'GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 ' and the reverse 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3 'rmeets VP bacterium detection capacity on black tiger shrimp with a number of characteristics: i) the appropriate priming temperature is 58 oC ii) the sensitivity of primer is 186.5 x 10- ng/µL and iii) non-paired primers with DNA sequences of two whistle-causing viruses Monodon Baculovirus 65 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 (MBV) and White Spot Syndrome Virus (WSSV) exhibit disease-like illness caused by micro VP bacteria Application of V1 primer pair detected four samples of VP contaminated shrimp in eight samples collected at the market Giới thiệu Tình hình dịch bệnh ảnh hưởng khơng nhỏ đến nghề tơm ni hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic nerosis syndrome - AHPNS) hay gọi hội chứng chết sớm (Early mortality syndrome – EMS) khiến cho tôm nuôi chết vòng 24 - 48 (Sirikharin cs., 2015), tỷ lệ chết lên đến 100% gây thiệt hại to lớn cho người nuôi tôm chủ yếu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (VP) gây thiệt hại nhiều cho nghề nuôi tôm Vi khuẩn VP vi khuẩn gram (-), khơng sinh bào tử, có dạng hình que, trụ, cong thẳng, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,4 - 2,4 µm, vi khuẩn ưa mặn, sinh trưởng nồng độ NaCl từ 1,5 - 6% (Mirbakhsh cs., 2014) Nồng độ NaCl 3% tối ưu cho VP phát triển, VP sinh trưởng nhiệt độ từ 10 – 43 °C, tối ưu 37 °C Ở điều kiện thuận lợi, thời gian hệ vi khuẩn - phút với mật độ 106 tế bào Daniels cs (2000), pH tối ưu từ 7,8 - 8,6, sinh trưởng bị ức chế có diện 0,1% acetic acid (pH = 5,1) Trong môi trường lỏng Tryptic Soy Broth (TSB) 2% NaCl, vi khuẩn mọc nhanh, tạo nhiều sinh khối Trên môi trường thạch rắn TCBS (Thiosulfate Citrate Bite Salts sucrose), khuẩn lạc VP có màu xanh, bóng, nhơ cao, đường kính khoảng 3-4 mm, tâm có màu đậm hơn, khơng làm axit hóa môi trường bên khuẩn lạc, đặc điểm để phân biệt với khuẩn lạc Vibrio cholerae (Trần, 2006) Mặc dù có nhiều nghiên cứu chẩn đốn bệnh thông qua dấu hiệu lâm sàng vỏ mềm tối, bơi chậm chạp, bỏ ăn, đổi màu gan tụy dấu hiệu cho thấy nhiễm bệnh tôm (Zorriehzahra & Banaederakhshan, 2015), việc phát vi khuẩn VP phương pháp nuôi cấy truyền thống tốn nhiều thời gian, công sức lao động, tăng chi phí sản xuất việc tìm phương pháp mới, phát nhanh xác vi khuẩn nhu cầu cần thiết Trong năm gần đây, dựa thành tựu bật sinh học phân tử, nhiều phương pháp đề nghị phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) xem phương pháp phát nhanh xác vi khuẩn VP (Mirbakhsh cs., 2014; Lightner cs., 2013) Phương pháp giúp khắc phục nhược điểm bảo quản, vận chuyển thành phần phản ứng xa, giúp rút ngắn thời gian phát hiện, hạn chế nguy ngoại nhiễm, dễ bảo quản, dễ vận chuyển, thao tác đơn giản, nhanh, tiện lợi Một yếu tố quan trọng phát nhanh vi khuẩn VP phương pháp PCR phải chọn cặp mồi đặc hiệu tức cặp mồi phải đạt yêu cầu tỉ lệ GC, chiều dài mồi đồng thời phải đáp ứng nghiêm ngặt số yếu tố cặp mồi nhiệt độ bắt cặp, độ đặc hiệu độ nhạy để chẩn đốn bệnh xác tránh nhầm lẫn với số bệnh bệnh còi bệnh đốm trắng tơm có biểu bệnh gần giống bệnh hủy hoại gan tủy vi khuẩn VP gây Vì nghiên cứu tính đặc hiệu số cặp mồi ứng dụng KIT phát nhanh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tôm sú phương pháp PCR thực để tìm cặp mồi đặc hiệu có khả phát nhanh xác VP mang tính cấp thiết cao Phƣơng tiện phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Phương tiện: Mẫu thí nghiệm: DNA khn mẫu sử dụng cho thí nghiệm khảo sát mồi DNA plasmid tinh sạch, có nồng độ gốc 186,5 ng/µL, trình tự DNA virus gây bệnh cịi (MBV) virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) lấy từ ngân hàng gen NCBI tổng hợp xác định 66 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 hàm lượng DNA Công ty Trách nhiệm hữu hạn thành viên sinh hóa PHUSA (Cty PHUSA) cung cấp DNA mục tiêu sử dụng thí nghiệm ứng dụng phương pháp PCR để phát VP DNA ly trích từ mẫu tơm thực tế Thiết bị: Máy PCR BIO-RAD T100, máy heatblock VWR Digital Moden 949035, máy vortex mini VWR Scientific Product, máy đo nồng độ DNA Nedovix DS-11, máy li tâm nhỏ Digital CD2012, máy chụp hình gel Major Scient MUVB100, điện di BIO-RAD PowerPAC 300, cân điện tử, lị vi sóng, tủ lạnh số thiết bị cần thiết khác Hóa chất: Hóa chất ly trích DNA, hóa chất PCR gồm H2O khử ion, Taq polymerase, dung dịch đệm PCR PSA buffer, dNTPs, DNA thang chuẩn Bio-2000 (DNA Ladder_DL), dung dịch điện di Tris-acetate EDTA 1X (TAE 1X), Ultra Clear Quick Dissolve Agarose, dye nhuộm DNA sản xuất cung cấp công ty PHUSA 2.2 Phương pháp nghiên cứu Lựa chọn thiết kế đoạn mồi cho phản ứng PCR bước quan trọng định đến kết quy trình Mồi lựa chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, chiều dài mồi khoảng 18-25 nucleotide, nhiệt độ nóng chảy (nhiệt độ biến tính) khoảng 60 o C – 65 oC, thành phần GC đoạn mồi nằm khoảng 40 – 60% để nhiệt độ bắt cặp mồi khơng q thấp, có G C đầu 3’ để giúp cho đầu 3’ mồi liên kết mạnh Nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi mồi ngược không cách xa, chênh lệch nhiệt độ lớn mồi có nhiệt độ biến tính (Tm) cao gắn cặp khơng đặc hiệu, cịn mồi có Tm thấp lai với DNA Chiều dài sản phẩm khuếch đại khoảng 200 – 400 bp, nhiệt độ biến tính khoảng 80 – 85 oC (không bắt buộc) Theo nghiên cứu dấu hiệu nhận biết trình tự gene vi khuẩn VP mức độ lồi phương pháp PCR gene đích gen toxR (Kim cs., 1999) gen toxR có trình tự bảo tồn cao lồi sử dụng dùng để phát nhanh vi khuẩn VP mẫu bệnh phẩm Ba cặp mồi V1, V2,V3 dùng để xác định gen toxR, theo số hiệu gene L11929.1 sở liệu NCBI nghiên cứu (Kim cs., 1999; Wong cs., 1999) khảo sát bảng Bảng Danh sách cặp mồi chọn Ký hiệu mồi V1 V2 V3 Trình tự Tm GC (Mồi xuôi mồi ngƣợc) (oC) (%) 5’-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’ 59 50 5’-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’ 58 48 5’-CTTTCTTCAGACTCAAGC-3’ 56 45 5’-AACGAGTCTTCTGCATGGTG-3’ 58 50 5’-AGCCCGCTTTCTTCAGACTC-3’ 61 55 5’-AACGAGTCTTCTGCATGGTG-3’ 58 50 Kích thƣớc sản phẩm (base pair) 367 394 398 Các nghiên cứu tiến hành lần lặp lại Sử dụng sở liệu NCBI để thu nhận trình tự gen mục tiêu phần mềm Primer3 version 0.4.0 để lựa chọn cặp mồi Khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi nhằm lựa chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho mồi gắn vào DNA mạch khuôn Nhiệt độ bắt cặp mồi khảo sát mức nhiệt độ 63oC, 58oC, 53oC 67 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 Pha loãng mồi ban đầu nồng độ 10 µM dung dịch TE 1X Các thành phần tham gia phản ứng PCR tham khảo bảng Bảng Thành phần tham gia phản ứng PCR khảo sát nhiệt độ gắn mồi Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ phản ứng Thể tích phản ứng 50 µL H2O khử ion 40,5 PSA buffer 10X 1X dNTPs 10 mM 0,2 pmol 0,5 Taq polymerase 5U 2U Cặp mồi khảo sát 10 µM 0,2 µM DNA VP 186,5 ng/µL -3 186,5 x10 ng/µL Chu kỳ nhiệt máy PCR thiết lập hình Hình Chu kỳ nhiệt PCR thiết lập khảo sát nhiệt độ gắn mồi Trong đó, (1) giai đoạn biến tính, (2) giai đoạn gắn cặp, (3) giai đoạn kéo dài Sau phản ứng PCR kết thúc, tiến hành chạy điện di điện 90 V, cường độ 400 mA 45 phút sau đọc kết Gel sử dụng để chạy điện di gel agarose 2% hòa tan dung dịch TAE 1X Chỉ tiêu đánh giá: Sản phẩm có băng với kích thước sản phẩm khuếch đại tương ứng với cặp mồi khảo sát Băng sản phẩm sáng rõ đậm thể nhiệt độ gắn mồi thích hợp Kiểm tra độ đặc hiệu mồi: kiểm tra cặp mồi có khuếch đại trình tự DNA mục tiêu không nghĩa cặp mồi bắt cặp với trình tự DNA vi khuẩn VP mà không bắt cặp với DNA virus gây bệnh khác Trong nghiên cứu khảo sát khả bắt cặp cặp mồi lên đoạn DNA VP, MBV WSSV Cách thực hiện: Sử dụng chu kỳ nhiệt tối ưu nghiên cứu nhiệt độ bắt cặp mồi thành phần tham gia phản ứng (bảng 2) thêm thành phần DNA MRV DNA WSSV Chỉ tiêu đánh giá: Sản phẩm băng sáng rõ vi khuẩn VP, không xuất băng MBV WSSV Khảo sát độ nhạy mồi: Độ nhạy mồi kiểm tra nồng độ pha loãng bảng 3, nồng độ lập lại lần Bảng Pha lỗng nồng độ DNA mục tiêu 68 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 Nồng độ mong muốn (ng/µL) Pha lỗng 186,5x10-2 198 µL TE + µL DNA (186,5 ng) 186,5x10-3 180 µL TE + 20 µL DNA (186,5x10-2 ng) 186,5x10-4 180 µL TE + 20 µL DNA (186,5x10-3 ng) 186,5x10-5 180 µL TE + 20 µL DNA (186,5x10-4 ng) 186,5x10-6 180 µL TE + 20 µL DNA (186,5x10-5 ng) 186,5x10-7 180 µLTE + 20 µL DNA (186,5x10-6 ng) 186,5x10-8 180 µL TE + 20 µL DNA (186,5x10-7 ng) Cách thực hiện: Tiến hành PCR mồi với nồng độ giảm dần thể bảng 3, sử dụng chu kỳ nhiệt tối ưu 58oC thành phần tham gia phản ứng bảng có DNA plasmid VP pha lỗng nồng độ bảng Chỉ tiêu đánh giá: Sản phẩm PCR băng sáng rõ tương ứng với nồng độ sản phẩm khuếch đại cặp mồi Nồng độ DNA mục tiêu giảm độ sáng, rõ đậm băng sản phẩm điện di giảm dần Nồng độ nhỏ nhìn thấy băng sản phẩm độ nhạy mồi Ứng dụng cặp mồi đặc hiệu KIT để phát mẫu tôm bệnh thu từ thực tế Ứng dụng cặp mồi để phát vi khuẩn VP có mẫu tôm thu chợ Hưng Lợi, thành phố Cần Thơ chợ Mỹ Xuyên, thành phố Long Xuyên tỉnh An Giang Mỗi chợ thu mua mẫu tôm, mẫu tơm ly trích DNA Kit-PHUSA, sử dụng máy đo OD (optical density) để xác định độ tinh đo nồng độ DNA tôm ly trích, thành phần tham gia phản ứng PCR phát vi khuẩn VP mẫu tôm bảng với lượng DNA mẫu tôm μL Chỉ tiêu đánh giá: có vi khuẩn VP diện mẫu tơm kiểm tra xuất băng sáng rõ kết điện di Kết thảo luận 3.1 Kết nhiệt độ gắn mồi cặp mồi Khi thiết kế mồi phần mềm Primer3, nhiệt độ gắn mồi thích hợp cặp mồi thể Tuy nhiên số trường hợp hóa chất hoạt động loại máy PCR mà nhiệt độ gắn mồi thực tế sai khác so với lý thuyết phần mềm Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi V1, V2, V3 thể hình 3a, 3b, 3c Nhiệt độ gắn mồi cặp mồi V1 phần mềm Primer3 có nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi 59 oC, mồi ngược 58 oC Tuy nhiên thực tế khảo sát V1 mức nhiệt độ gắn mồi 63 oC, 58 oC 53 oC, kết thể hình 3a, băng hình kích thước 367 bp Phản ứng PCR mồi V1 cho kết băng hình sáng mức nhiệt độ Ở nhiệt độ 53 o C sản phẩm PCR có sản phẩm phụ nên không sử dụng làm cặp mồi cho nghiên cứu Như vậy, nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho V1 63oC 58oC Điều phù hợp với nghiên cứu trước (Kim cs., 1999) sử dụng nhiệt độ gắn mồi 63 oC cho cặp mồi V1 để khảo sát khả gắn cặp cặp mồi 14 chuỗi trình tự của 14 chủng vi khuẩn VP Tương tự, nghiên cứu khác (Zulkifli cs., 2009) sử dụng cặp mồi V1 để kiểm tra 48 chủng 69 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 vi khuẩn Vibrio có chứa 14 chủng có gene toxR 34 chủng cịn lại chứa gene trh, tdh Trong nghiên cứu khảo sát nhiệt độ gắn mồi, (Zulkifli cs., 2009) sử dụng nhiệt độ 63 oC cho kết băng hình sáng rõ tương tự kết (Kim cs., 1999) trước Trong nghiên cứu này, phát thêm 58oC băng hình có độ sáng rõ nhiệt độ 63oC khơng có sản phẩm phụ 53oC Nhiệt độ 58oC gắn mồi thích hợp V1 theo sở liệu NCBI phần mềm thiết kế đoạn mồi Primer3 Vì thế, nhiệt độ gắn mồi 58oC chọn nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho V1 Nhiệt độ gắn mồi cặp mồi V2, sau tham khảo nhiệt độ gắn mồi cặp mồi V2 phần mềm Primer3, nghiên cứu (Kim cs., 1999) kết từ nghiên cứu cho thấy V2 không cặp mồi đặc hiệu phát vi khuẩn VP ba mức nhiệt độ 63 0C, 58 0C 53 C sản phẩm PCR có nhiều sản phẩm phụ, băng hình khơng sáng rõ hình 3b Do cặp mồi V2 khơng sử dụng cho nghiên cứu Nhiệt độ gắn mồi cặp mồi V3 thể hình 3c Cả ba mức nhiệt độ sản phẩm PCR có băng hình sáng rõ, tương ứng với kích thước sản phẩm khuếch đại 398 bp Độ sáng băng tương đối giống nhau, V3 sử dụng ba mức nhiệt độ 63oC, 58oC 53oC để thực phản ứng PCR Tuy nhiên, nhiệt độ nóng chảy trung bình mồi xi mồi ngược V3 59.5oC (bảng 1) cần phải chọn nhiệt độ gắn mồi gần với nhiệt độ nóng chảy nên nhiệt độ 58oC chọn nhiệt độ gắn mồi cho V3 khảo sát Hai cặp mồi V1 V3 với nhiệt độ gắn mồi 58oC tiến hành khảo sát độ đặc hiệu mồi Hình 3a, 3b, 3c kết khảo sát nhiệt độ gắn cặp mồi V1, V2, V3 Trong đó: Các giếng 1, 2, kết khảo sát mồi 63 oC; giếng 4, 5, mồi 58 oC; giếng 7, 8, mồi 53 oC; giếng 10 đối chứng âm 3.2 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi DNA virus gây bệnh còi (MBV) virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) sử dụng làm đối chứng biểu bệnh hai virus giống với biểu bệnh vi khuẩn VP gây Cặp mồi sử dụng KIT để phát nhanh xác VP phải mồi đặc hiệu gắn cặp với DNA VP mà không bắt cặp với DNA hai loại virus khác Kết khảo sát gắn cặp đặc hiệu mồi thể hình 4a 4b bên 70 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 Kết độ đặc hiệu cặp mồi V1: Hình 4a kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi V1 Trong đó, giếng 1, 2, kết khảo sát khả gắn mồi lên DNA virus gây bệnh còi (MBV); giếng 4, 5, kết gắn mồi lên virus gây bệnh đốm trắng (WSSV); giếng đối chứng âm (nước cất) giếng đối chứng dương (vi khuẩn VP) Hình 4a Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi V1 Từ hình 4a cho thấy, cặp mồi V1 bắt cặp với trình tự DNA VP mà khơng bắt cặp với DNA virus MBV WSSV Nghiên cứu (Kim cs., 1999) sử dụng cặp mồi V1 để thử nghiệm khả bắt cặp cặp mồi V1 với DNA 14 loài Vibrio khác bao gồm V cholerae O1 NIH41, V cholerae O1 NIH35A3, V cholerae O139, V cholerae non-O1, V hollisae, V anguillarum , V alginolyticus, V alginolyticus, V mimicus, V vulnificus, V fluvialis, V furnisii, V damsela, V metchnikovii, kết cho thấy ngồi việc khơng bắt cặp với DNA virus MBV, WSSV cặp mồi V1 không bắt cặp với trình tự DNA 14 lồi vi khuẩn Vibrio kể Tương tự, nghiên cứu (Zulkifli cs., 2009) sử dụng cặp mồi V1 để nhận diện vi khuẩn VP kết kiểm tra 48 chủng vi khuẩn Vibrio có 14 chủng chứa gene toxR 34 chủng lại chứa gene trh, tdh cho thấy cặp mồi V1 bắt cặp lên trình tự gen 14 chủng có chứa gene toxR Do cặp mồi V1 dùng để phát vi khuẩn VP cách chuyên biệt Kết độ đặc hiệu cặp mồi V3 thể hình 4b Cặp mồi V3 bắt cặp với trình tự DNA VP mà khơng bắt cặp với DNA virus gây bệnh khác Cả hai cặp mồi V1 V3 không bắt cặp với trình tự DNA MBV WSSV, điều cho thấy hai mồi đặc hiệu với vi khuẩn VP sử dụng để phát VP Tuy nhiên, độ nhạy mồi yếu tố cần thiết mang tính đặc hiệu mồi cần tiến hành khảo sát độ nhạy mồi để chọn cặp mồi tối ưu Hình 4b Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi V3 71 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 3.3 Kết khảo sát độ nhạy mồi Độ nhạy mồi yếu tố quan trọng KIT độ nhạy mồi độ nhạy KIT Độ nhạy hiểu nồng độ DNA VP thấp mà mồi nhận biết, gắn cặp khuếch cho kết điện di có băng hình sáng rõ Cặp mồi có độ nhạy cao tức cho kết điện di có băng hình sáng rõ nồng độ DNA thấp Kết độ nhạy cặp mồi V1 Phản ứng PCR sử dụng nồng độ DNA vi khuẩn ban đầu 186,5 ng/µL, sau pha lỗng nồng độ từ 186,5x10-2 ng/µL đến 186,5x10-8 ng/µL, kết điện di cho thấy độ nhạy cặp mồi V1 V3 thể hình 5a, 5b Hình 5a, 5b Kết khảo sát độ nhạy cặp mồi V1 V3 Trong đó: N đối chứng âm, giếng lại nồng độ DNA vi khuẩn pha loãng từ 186,5x10-2 ng/µL đến 186,5x10-8 ng/µL, mẫu lặp lại lần Các giếng có băng sản phẩm khoảng 367 bp, băng có độ đậm, sáng rõ giảm dần theo nồng độ DNA ban đầu Điều cho thấy thời gian số chu kỳ khếch đại PCR nồng độ DNA mạch khuôn cao mồi dễ dàng gắn cặp khuếch đại số lượng lớn sản phẩm DNA nên băng hình sáng rõ dễ dàng nhận thấy Ngược lại, nồng độ DNA ban đầu thấp, số lượng mạch khuôn diện dung dịch phản ứng thấp, nên gắn cặp khếch đại đoạn DNA giảm dần biểu băng gel điện di mờ dần Vì độ sáng rõ băng gel điện di mà quan sát sáng rõ nồng độ xem nồng độ tối thiểu mà cặp mồi bắt cặp khuếch đại hay gọi độ nhạy mồi nồng độ pha lỗng đó, sau nồng độ pha lỗng cặp mồi khơng hoạt động cho kết băng sáng mờ nhìn thấy Kết từ gel diện di cho thấy nồng độ mẫu 186,5x10-2 ng/µL – 186,5x10-4 ng/µL nhìn thấy rõ tín hiệu băng hình, đến nồng độ 186,5x10-5 ng/µL băng mờ nhiều nồng độ thấp trở sau khơng cịn thấy xuất băng Như độ nhạy phản ứng 186,5x10-4 ng/µL Kết độ nhạy cặp mồi V3: Từ hình 5b nhận thấy nồng độ mẫu 186,5x 10-3 ng/µL băng hình nhìn thấy sáng, nồng độ thấp khơng thấy xuất băng sáng Như vậy, độ nhạy phản ứng 186,5x10-3 ng/µL Từ nghiên cứu cho thấy nồng độ pha lỗng DNA khn mẫu ban đầu, thời gian chu kỳ khuếch đại PCR, cặp mồi V1 gắn cặp với DNA khuôn mẫu tốt cho số lượng DNA khuếch đại nhiều từ băng hình biểu hiệu sáng rõ nồng độ thấp hơn186,5x10-4 ng/µL Như vậy, cặp mồi V1 cặp mồi thích hợp chọn để tham gia vào KIT phát nhanh vi khuẩn VP 72 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 3.4 Kết ứng dụng KIT để kiểm tra mẫu tôm bệnh từ thực tế Trong mẫu tôm thu mua từ chợ, bốn mẫu tôm thu từ chợ Hưng Lợi phát có mẫu tơm nhiễm VP mẫu (hình 6a) bốn mẫu tơm thu mua từ chợ Mỹ Xuyên có mẫu tơm nhiễm VP mẫu (hình 6b) Cả hai chợ có tỉ lệ tơm nhiễm VP chiếm 50% tổng số tôm kiểm tra Dựa vào độ sáng băng hình cho thấy mức độ nhiễm VP mẫu khác hình 6a, mẫu nhiễm thấp mẫu băng hình khơng sáng rõ Ở hình 6b, lần lặp lại thứ ba mẫu bơm DNA vào giếng phần hỗn hợp bị tràn dẫn đến kết băng hình mờ so với hai băng cịn lại Hình 6a Kết kiểm tra vi khuẩn VP mẫu tôm chợ Hưng Lợi Trong đó: giếng 1: đối chứng dương; giếng : đối chứng âm; giếng 3, 4, kết kiểm tra mẫu tôm thứ nhất; giếng 6, 7, kết mẫu tôm thứ 2, giếng 9, 10, 11 kết mẫu tôm thứ ba giếng 12, 13, 14 kết mẫu tôm thứ 367 bp Hình 6b Kết kiểm tra vi khuẩn VP mẫu tôm chợ Mỹ Xuyên Trong đó: giếng đối chứng dương (vi khuẩn VP); giếng đối chứng âm (nước cất); giếng 3, 4, kết kiểm tra VP mẫu tôm thứ nhất; giếng 6, 7, mẫu tôm thứ 2, giếng 9, 10, 11 mẫu tôm thứ giếng 12, 13, 14 mẫu tôm thứ Ứng dụng KIT phát vi khuẩn VP tám mẫu tôm hai chợ Hưng Lợi Mỹ Xuyên với số lần lặp lại ba cho thấy có bốn mẫu tơm phát nhiễm vi khuẩn VP, chiếm 50% tổng số tôm khảo sát Kết luận Căp mồi V1 có trình tự mồi xuôi 5’-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’; mồi ngược 5’ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’ đáp ứng mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tôm Cặp mồi thỏa mãn yêu cầu như: chiều dài từ 18-24 nucleotide; trình tự mồi hồn tồn ngẫu nhiên với tỉ lệ GC từ 48 - 50%; có G 73 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 đầu 3’; nhiệt độ gắn mồi thích hợp 58oC; nhiệt độ biến tính hai mồi xuôi ngược không chênh lệch 2oC; khơng bắt cặp lên trình tự DNA virus MBV, WSSV; độ nhạy phát vi khuẩn VP nồng độ DNA pha lỗng 186,5x10-4 ng/µL nên sử dụng làm cặp mồi đặc hiệu KIT phát nhanh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (VP) tôm Sú TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D Lightner, C Redman, B Pantoja, L Noble, L T Nunan, and L Tran (2013) Documentation of an Emerging Disease (early mortality syndrome) in SE Asia & Mexico OIE Reference Laboratory for Shrimp Diseases, Department of Veterinary Science & Microbiology, School of Animal and Comparative Biomedical Sciences [2] H C Wong, M C Chen, S H Liu, and D P Liu (1999) Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries International Journal of Food Microbiology, 52(3),181-188, doi: https://doi.org/10.1016/S01681605(99)00143-9 [3] L T Trần (ed, 2006) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm (mỹ phẩm) [4] M Mirbakhsh, M Afsharnasab, A Khanafari, and M Razavi (2014) Molecular identification of Vibrio harveyi from larval stage of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) Boone (Crustacea: Decapoda) by polymerase chain reaction and 16S rDNA sequencing Iranian Journal of Fisheries Sciences, 13(2), 384-393 [5] M Zorriehzahra and R Banaederakhshan (2015) Early mortality syndrome (EMS) as new emerging threat in shrimp industry Adv Anim Vet Sci, 3(2S), 64-72 [6] N A Daniels et al (2000) Vibrio parahaemolyticus infections in the United States, 1973– 1998 The Journal of infectious diseases, 181(5), 1661-1666 [7] R Sirikharin et al (2015) Characterization and PCR detection of binary, Pir-like toxins from Vibrio parahaemolyticus isolates that cause acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp PloS one, 10(5), e0126987 [8] Y B Kim, J Okuda, C Matsumoto, N Takahashi, S Hashimoto, and M Nishibuchi (1999) Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene Journal of Clinical Microbiology, 37(4), 1173-1177 [9] Y Zulkifli, N Alitheen, R Son, S Yeap, M Lesley, and A Raha (2009) Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted to the toxR gene and detection of virulence genes International Food Research Journal, 16, 289-296 74 ... gan tủy vi khuẩn VP gây Vì nghiên cứu tính đặc hiệu số cặp mồi ứng dụng KIT phát nhanh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tôm sú phương pháp PCR thực để tìm cặp mồi đặc hiệu có khả phát nhanh xác... với biểu bệnh vi khuẩn VP gây Cặp mồi sử dụng KIT để phát nhanh xác VP phải mồi đặc hiệu gắn cặp với DNA VP mà không bắt cặp với DNA hai loại virus khác Kết khảo sát gắn cặp đặc hiệu mồi thể hình... tổng số tôm khảo sát Kết luận Căp mồi V1 có trình tự mồi xi 5’-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’; mồi ngược 5’ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’ đáp ứng mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus