PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HỒNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BỊ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chun ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.27.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ TP Hồ Chí Minh – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HỒNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.27.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH Hoàng Ngọc Anh GS TSKH Utkin Yuri Nikolaevich TP Hồ Chí Minh – 2017 VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HỒNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT TOXIN CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BỌ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số chuyên ngành: 62.44.27.01 Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TSKH Hoàng Ngọc Anh Giáo sư TSKH Utkin Yuri Nikolaevich Tp Hồ Chí Minh – Năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: 1) Luận văn sản phẩm nghiên cứu 2) Số liệu luận văn trung thực 3) Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu ii MỤC LỤC Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Mở đầu 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu bọ cạp 1.1.1 Phân bố môi trường sống 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Nọc độc 1.1.4 Bọ cạp Việt Nam .8 1.2 Cấu trúc ảnh hưởng toxin nọc bọ cạp 1.2.1 Cấu trúc toxin .9 1.2.2 Tác động ảnh hưởng nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion .11 1.3 Một số nghiên cứu toxin có nọc bọ cạp .17 1.3.1 Các phương pháp cô lập tinh chế toxin 17 1.3.2 Một số nghiên cứu nọc độc chi Heterometrus 19 1.4 Ứng dụng nọc bọ cạp .22 1.4.1 Nghiên cứu giới 22 1.4.2 Nghiên cứu ứng dụng nọc bọ cạp Việt Nam 24 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 27 2.2.1 Ni bọ cạp phịng thí nghiệm 27 2.2.2 Xác định pH hàm lượng protein nọc bọ cạp H laoticus .28 2.2.3 Xác định khối lượng phân tử nọc bọ cạp H laoticus 29 iii 2.2.4 Cô lập toxin từ nọc bọ cạp 31 2.2.5 Xác định trình tự acid amin chuỗi polypeptide 35 2.2.6 Xác định trình tự acid amin các toxin chuột 39 2.2.7 Xác định cấu trúc bậc phân đoạn 5.21.1 40 2.3 Khảo sát độc tính các phân đoạn độc 40 2.3.1 Khảo sát độc tính sơ các phân đoạn độc lên chuột 40 2.3.2 Khảo sát độc tính sơ các phân đoạn độc lên trùng .41 2.3.3 Xác định độc tính cấp phân đoạn độc chuột 42 2.3.4 Xác định độc tính cấp phân đoạn độc lên côn trùng 43 2.4.Khảo sát tương tác của các phân đoạn độc với kênh vận chuyển K+ .43 NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 45 3.1 Định danh bò cạp thu mua An Giang 46 3.2 Ni bọ cạp phịng thí nghiệm thu hoạch nọc 46 3.2.1 Nuôi bọ cạp phịng thí nghiệm 46 3.2.2 Thu nọc bọ cạp H laoticus .47 3.3 Khảo sát, đánh giá phân tích nọc thơ bọ cạp H laoticus 49 3.3.1 Khảo sát độ pH nọc thô 49 3.3.2 Phân tích hàm lượng protein tổng nọc thơ 49 3.3.3 Phân tích nọc bọ cạp sắc ký lọc gel gel Sephadex G50 .50 3.3.4 Xác định khối lượng phân tử phân đoạn nọc .52 3.4 Khảo sát độc tính nọc bọ cạp H laoticus chuột 54 3.4.1 Đánh giá độc tính các phân đoạn nọc thu chuột 54 3.4.2 Đánh giá độc tính cấp các phân đoạn độc lên chuột 56 3.4.3 Phân tích thành phần phân đoạn 58 3.4.4 Khảo sát độc tính các phân đoạn peptide thứ cấp lên chuột 59 3.5 Tinh chế xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp có độc tính 62 3.5.1 Phân tách peptide từ phân đoạn 4.6 62 3.5.2 Phân tách peptide từ phân đoạn 4.7 64 3.5.3 Phân tách peptide từ phân đoạn 4.11 65 3.5.4 Phân tách peptide từ phân đoạn 4.15 66 iv 3.6 Khảo sát cấu trúc bậc các polypeptide phân đoạn 4.6 tác động lên kênh vận chuyển K+ 67 3.6.1 Khảo sát cấu trúc bậc các polypeptide phân đoạn 4.6 67 3.6.2 Khảo sát tác động Hetlaxin lên kênh vận chuyển K+ 70 3.7.Khảo sát độc tính các phân đoạn nọc bọ cạp H laoticus lên dế 72 3.7.1 Kết khảo sát độc tính các phân đoạn nọc dế .72 3.7.2 Xác định độc tính cấp phân đoạn độc lên côn trùng 73 3.7.3 Phân tách phân đoạn .75 3.7.4 Khảo sát độc tính các phân đoạn thứ cấp dế 75 3.7.5 Cô lập xác định khối lượng phân tử protein các phân đoạn thứ cấp có độc tính dế 76 KẾT LUẬN 83 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN .86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 123 PHỤ LỤC 131 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT COSY Correlation spectroscopy DAD Diode-array detector DNA Deoxyribonucleic acid DQF Double quantum filtered EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid HPLC High performance liquid chromatography LD Lethal dose MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization MS Mass spectroscopy NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PD Protective dose SDS Sodium dodecyl sulfate TFA Trifluoroacetic acid TOF Time of flight vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các đại diện độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri 12 Bảng 1.2 Đại diện các nhóm độc tố kênh vận chuyển K+ 16 Bảng 2.1 Tóm tắt lập đường chuẩn định lượng protein phương pháp biuret 29 Bảng 2.2 Thông số sắc ký lỏng hiệu cao các phân đoạn độc thứ cấp 34 Bảng 2.3 Thơng số q trình sắc ký lỏng hiệu cao phân đoạn 35 Bảng 2.4 Dấu hiệu nhận biết sơ độc tính lên chuột các phân đoạn gây độc.41 Bảng 2.5 Dấu hiệu nhận biết sơ độc tính trùng các phân đoạn gây độc 42 Bảng 3.1 Kết đo mật độ quang mẫu chuẩn 49 Bảng 3.2 Khối lượng các phân đoạn nọc bọ cạp 51 Bảng 3.3 Kết đo UV nồng độ thực tế phân đoạn nọc bọ cạp 54 Bảng 3.4 Kết thử độc tính chuột các phân đoạn nọc 55 Bảng 3.5 Tỷ lệ tử vong chuột liều khác khoảng LD0 LD100 sau 24 tiêm 56 Bảng 3.6 Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens 56 Bảng 3.7 Kết thử độc tính phân đoạn thứ cấp 60 Bảng 3.8 Khối lượng phân tử polypeptide tách 68 Bảng 3.9 Kết thử độc tính dế các phân đoạn nọc 72 Bảng 3.10 Tỷ lệ tử vong dế liều khác khoảng LD0 LD100 sau 24 tiêm 73 Bảng 3.11 Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens 74 Bảng 3.12 Kết thử độc tính các phân đoạn thứ cấp dế 76 Bảng 3.13 Tóm tắt quá trình phân tách phân đoạn HPLC 77 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số lồi bọ cạp đại diện họ khác Hình 1.2 Lồi bọ cạp Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 Hình 1.3 Cấu trúc toxin ngắn nọc bọ cạp 10 Hình 1.4 Cấu trúc khơng gian số toxin tách từ nọc bọ cạp 10 Hình 1.5 Sắc ký đồ trao đổi ion nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus 18 Hình 1.6 Sắc ký đồ sắc ký lọc gel nọc bọ cạp Scorpio Maurus 19 Hình 1.7 Sắc ký đồ sắc ký hiệu cao nọc bọ cạp Scorpio Maurus 19 Hình 2.1 Thau ni bọ cạp phịng thí nghiệm 28 Hình 2.2 Thu nọc bọ cạp H laoticus 31 Hình 2.3 Nguyên tắc phương pháp Edman 36 Hình 2.4 Phản ứng phụ phương pháp Edman 37 Hình 2.5 Xác định trình tự chuỗi polypeptide ngắn chuỗi ban đầu 38 Hình 2.6 Tách hai chuỗi polypeptide liên kết cầu disulfide 38 Hình 3.1 Trọng lượng bọ cạp tháng 47 Hình 3.2 Mẫu nọc thô bọ cạp H.laoticus 48 Hình 3.3 Lượng nọc bọ cạp thu theo thời gian 48 Hình 3.4 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein 50 Hình 3.5 Sắc ký đồ nọc thơ bọ cạp thực sắc ký lọc gel 51 Hình 3.6 Kết điện di phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn 53 Hình 3.7 Đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng 57 Hình 3.8 Sắc ký đồ phân tách phân đoạn HPLC 59 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.6 63 Hình 3.10 Khối lượng phân tử phân đoạn 4.6.2 63 Hình 3.11 Khối lượng phân tử phân đoạn 4.6.3 64 Hình 3.12 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.7.2 64 Hình 3.13 Khối lượng phân tử phân đoạn 4.7.2 65 Hình 3.14 Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.11.1 65 Hình 3.15 Khối lượng phân tử phân đoạn 4.11.1 66 viii 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 synaptosomes, Biochemical and Biophysical Research Communications, 95(4), pp 1607-1614 Kharrat, R., P Mansuelle, F Sampieri, M Crest, R Oughideni, J Van Rietschoten, M.F Martin-Eauclaire, H Rochat, and M El Ayeb (1997), Maurotoxin, a four disulfide bridge toxin from Scorpio maurus venom: purification, structure and action on potassium channels, FEBS Lett, 406(3), pp 284-90 Knaus, H.G., C Schwarzer, R.O Koch, A Eberhart, G.J Kaczorowski, H Glossmann, F Wunder, O Pongs, M.L Garcia, and G Sperk (1996), Distribution of high-conductance Ca(2+)-activated K+ channels in rat brain: targeting to axons and nerve terminals, J Neurosci, 16(3), pp 955-63 Kohen, R., Y Yamamoto, K.C Cundy, and B.N Ames (1988), Antioxidant activity of carnosine, homocarnosine, and anserine present in muscle and brain, Proc Natl Acad Sci U S A, 85(9), pp 3175-9 Kopeyan, C., G Martinez, S Lissitzky, F Miranda, and H Rochat (1974), Disulfide bonds of toxin II of the scorpion Androctonus australis Hector, Eur J Biochem, 47(3), pp 483-9 Kudryashova, K.S., O.V Nekrasova, A.I Kuzmenkov, A.A Vassilevski, A.A Ignatova, Y.V Korolkova, E.V Grishin, M.P Kirpichnikov, and A.V Feofanov (2013), Fluorescent system based on bacterial expression of hybrid KcsA channels designed for Kv1.3 ligand screening and study, Anal Bioanal Chem, 405(7), pp 2379-89 Lebreton, F., M Delepierre, A.N Ramirez, C Balderas, and L.D Possani (1994), Primary and NMR three-dimensional structure determination of a novel crustacean toxin from the venom of the scorpion Centruroides limpidus limpidus Karsch, Biochemistry, 33(37), pp 11135-49 Lebrun, B., R Romi-Lebrun, M.F Martin-Eauclaire, A Yasuda, M Ishiguro, Y Oyama, O Pongs, and T Nakajima (1997), A four-disulphide-bridged toxin, with high affinity towards voltage-gated K+ channels, isolated from Heterometrus spinnifer (Scorpionidae) venom, Biochem J, 328 ( Pt 1), pp 3217 Lecomte, C., J.M Sabatier, J Van Rietschoten, and H Rochat (1998), Synthetic peptides as tools to investigate the structure and pharmacology of potassium channel-acting short-chain scorpion toxins, Biochimie, 80(2), pp 151-4 Lippens, G., J Najib, S.J Wodak, and A Tartar (1995), NMR sequential assignments and solution structure of chlorotoxin, a small scorpion toxin that blocks chloride channels, Biochemistry, 34(1), pp 13-21 Littleton, J.T and B Ganetzky (2000), Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome, Neuron, 26(1), pp 35-43 Lourenỗo, W (1994), Diversity and endemism in tropical versus temperate scorpion communities, Compte rendu des séances de la société de biogéographie, 70(3), pp 155-160 Ma, Y., Y Zhao, R Zhao, W Zhang, Y He, Y Wu, Z Cao, L Guo, and W Li (2010), Molecular diversity of toxic components from the scorpion Heterometrus petersii venom revealed by proteomic and transcriptome analysis, Proteomics, 10(13), pp 2471-2485 126 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 Mamelak, A.N and D.B Jacoby (2007), Targeted delivery of antitumoral therapy to glioma and other malignancies with synthetic chlorotoxin (TM-601), Expert Opin Drug Deliv, 4(2), pp 175-86 Martin, M.F and H Rochat (1986), Large scale purification of toxins from the venom of the scorpion Androctonus australis Hector, Toxicon, 24(11-12), pp 1131-9 Martin, M.F and H Rochat (1984), Purification and amino acid sequence of toxin I" from the venom of the North African scorpion Androctonus australis Hector, Toxicon, 22(5), pp 695-703 Martin, M.F., H Rochat, P Marchot, and P.E Bougis (1987), Use of high performance liquid chromatography to demonstrate quantitative variation in components of venom from the scorpion Androctonus australis Hector, Toxicon, 25(5), pp 569-73 Mazzotti, L and M.A Bravo-Becherelle (1961), [Scorpionism in the Mexican Republic], Rev Inst Salubr Enferm Trop, 21, pp 3-19 Miller, C., E Moczydlowski, R Latorre, and M Phillips (1985), Charybdotoxin, a protein inhibitor of single Ca2+-activated K+ channels from mammalian skeletal muscle, Nature, 313(6000), pp 316-8 Nie, Y., X.C Zeng, Y Yang, F Luo, X Luo, S Wu, L Zhang, and J Zhou (2012), A novel class of antimicrobial peptides from the scorpion Heterometrus spinifer, Peptides, 38(2), pp 389-94 Ono, S., M Hosokawa, K Miyashita, and K Takahashi (2006), Inhibition properties of dipeptides from salmon muscle hydrolysate on angiotensin Iconverting enzyme, International Journal of Food Science & Technology, 41(4), pp 383-386 Pedarzani, P., D D'Hoedt, K.B Doorty, J.D Wadsworth, J.S Joseph, K Jeyaseelan, R.M Kini, S.V Gadre, S.M Sapatnekar, M Stocker, and P.N Strong (2002), Tamapin, a venom peptide from the Indian red scorpion (Mesobuthus tamulus) that targets small conductance Ca2+-activated K+ channels and afterhyperpolarization currents in central neurons, J Biol Chem, 277(48), pp 46101-9 Pedarzani, P., J.E McCutcheon, G Rogge, B.S Jensen, P Christophersen, C Hougaard, D Strobaek, and M Stocker (2005), Specific enhancement of SK channel activity selectively potentiates the afterhyperpolarizing current I(AHP) and modulates the firing properties of hippocampal pyramidal neurons, J Biol Chem, 280(50), pp 41404-11 Pedroso, E., A Grandas, J.C Amor, and E Giralt (1987), Reversed-phase highperformance liquid chromatography of protected peptide segments, J Chromatogr, 409, pp 281-90 Possani, L., B Becerril, J Tytgat, and M Delepierre, High Affinity Scorpion Toxins for Studying Potassium and Sodium Channels, in Ion Channel Localization, A Lopatin and C Nichols, Editors 2001, Humana Press p 145165 Possani, L.D., B Becerril, M Delepierre, and J Tytgat (1999), Scorpion toxins specific for Na+-channels, European Journal of Biochemistry, 264(2), pp 287300 127 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 Pragl, B., A Koschak, M Trieb, G Obermair, W.A Kaufmann, U Gerster, E Blanc, C Hahn, H Prinz, G Schutz, H Darbon, H.J Gruber, and H.G Knaus (2002), Synthesis, characterization, and application of cy-dye- and alexa-dyelabeled hongotoxin(1) analogues The first high affinity fluorescence probes for voltage-gated K+ channels, Bioconjug Chem, 13(3), pp 416-25 Rain, J.O The Scorpion Files 2008 [cited 2014 Nov 11] Rajendra, W., A Armugam, and K Jeyaseelan (2004), Neuroprotection and peptide toxins, Brain Res Brain Res Rev, 45(2), pp 125-41 Rashid, I., D.M van Reyk, and M.J Davies Carnosine and its constituents inhibit glycation of low-density lipoproteins that promotes foam cell formation in vitro, FEBS Letters, 581(5), pp 1067-1070 Rodriguez de la Vega, R.C and L.D Possani (2004), Current views on scorpion toxins specific for K+-channels, Toxicon, 43(8), pp 865-75 Savarin, P., R Romi-Lebrun, S Zinn-Justin, B Lebrun, T Nakajima, B Gilquin, and A Menez (1999), Structural and functional consequences of the presence of a fourth disulfide bridge in the scorpion short toxins: solution structure of the potassium channel inhibitor HsTX1, Protein Sci, 8(12), pp 2672-85 Schiavon, E., T Sacco, R.R Cassulini, G Gurrola, F Tempia, L.D Possani, and E Wanke (2006), Resurgent current and voltage sensor trapping enhanced activation by a beta-scorpion toxin solely in Nav1.6 channel Significance in mice Purkinje neurons, J Biol Chem, 281(29), pp 20326-37 Smith, P.K., R.I Krohn, G.T Hermanson, A.K Mallia, F.H Gartner, M.D Provenzano, E.K Fujimoto, N.M Goeke, B.J Olson, and D.C Klenk (1985), Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal Biochem, 150(1), pp 7685 Soroceanu, L., Y Gillespie, M.B Khazaeli, and H Sontheimer (1998), Use of chlorotoxin for targeting of primary brain tumors, Cancer Res, 58(21), pp 48719 Splawski, I., J Shen, K.W Timothy, M.H Lehmann, S Priori, J.L Robinson, A.J Moss, P.J Schwartz, J.A Towbin, G.M Vincent, and M.T Keating (2000), Spectrum of mutations in long-QT syndrome genes KVLQT1, HERG, SCN5A, KCNE1, and KCNE2, Circulation, 102(10), pp 1178-85 Srinivasan, K.N., P Gopalakrishnakone, P.T Tan, K.C Chew, B Cheng, R.M Kini, J.L Koh, S.H Seah, and V Brusic (2002), SCORPION, a molecular database of scorpion toxins, Toxicon, 40(1), pp 23-31 Sugg, E.E., M.L Garcia, J.P Reuben, A.A Patchett, and G.J Kaczorowski (1990), Synthesis and structural characterization of charybdotoxin, a potent peptidyl inhibitor of the high conductance Ca2(+)-activated K+ channel, J Biol Chem, 265(31), pp 18745-8 Tugarinov, V., I Kustanovich, N Zilberberg, M Gurevitz, and J Anglister (1997), Solution structures of a highly insecticidal recombinant scorpion alphatoxin and a mutant with increased activity, Biochemistry, 36(9), pp 2414-24 Uawonggul, N., S Thammasirirak, A Chaveerach, T Arkaravichien, W Bunyatratchata, W Ruangjirachuporn, P Jearranaiprepame, T Nakamura, M Matsuda, M Kobayashi, S Hattori, and S Daduang (2007), Purification and 128 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 characterization of Heteroscorpine-1 (HS-1) toxin from Heterometrus laoticus scorpion venom, Toxicon, 49(1), pp 19-29 Vacher, H., R Romi-Lebrun, C Mourre, B Lebrun, S Kourrich, F Masmejean, T Nakajima, C Legros, M Crest, P.E Bougis, and M.F Martin-Eauclaire (2001), A new class of scorpion toxin binding sites related to an A-type K+ channel: pharmacological characterization and localization in rat brain, FEBS Lett, 501(1), pp 31-6 Valdivia, H.H (1998), Modulation of intracellular Ca2+ levels in the heart by sorcin and FKBP12, two accessory proteins of ryanodine receptors, Trends Pharmacol Sci, 19(12), pp 479-82 Vandendriessche, T., I Kopljar, D.P Jenkins, E Diego-Garcia, Y AbdelMottaleb, E Vermassen, E Clynen, L Schoofs, H Wulff, D Snyders, and J Tytgat (2012), Purification, molecular cloning and functional characterization of HelaTx1 (Heterometrus laoticus): the first member of a new kappa-KTX subfamily, Biochem Pharmacol, 83(9), pp 1307-17 Veiseh, M., P Gabikian, S.B Bahrami, O Veiseh, M Zhang, R.C Hackman, A.C Ravanpay, M.R Stroud, Y Kusuma, S.J Hansen, D Kwok, N.M Munoz, R.W Sze, W.M Grady, N.M Greenberg, R.G Ellenbogen, and J.M Olson (2007), Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci, Cancer Res, 67(14), pp 6882-8 Wang, A.M., C Ma, Z.H Xie, and F Shen (2000), Use of carnosine as a natural anti-senescence drug for human beings, Biochemistry (Mosc), 65(7), pp 869-71 Wang, W.-X and Y.-H Ji (2005), Scorpion venom induces glioma cell apoptosis in vivo and inhibits glioma tumor growth in vitro, Journal of Neuro-Oncology, 73(1), pp 1-7 Watt, S.a (1990), Venoms and toxins The Biology of Scorpions, ed G Polis Stanford, CA: Stanford University Press Whittemore, F.W and H.L Keegan (1963), Medically important scorpions in the Pacific area Venomous and Poisonous Animals and Noxious Plants of the Pacific Region ed H.L.K.W.V MacFarlane New York: The Macmillan Company Wolff, J., K Horisaka, and H.M Fales (1968), The structure of ophidine, Biochemistry, 7(7), pp 2455-2457 Yan, R., Z Zhao, Y He, L Wu, D Cai, W Hong, Y Wu, Z Cao, C Zheng, and W Li (2011), A new natural alpha-helical peptide from the venom of the scorpion Heterometrus petersii kills HCV, Peptides, 32(1), pp 11-9 Yan, R., Z Zhao, Y He, L Wu, D Cai, W Hong, Y Wu, Z Cao, C Zheng, and W Li (2011), A new natural α-helical peptide from the venom of the scorpion Heterometrus petersii kills HCV, Peptides, 32(1), pp 11-19 Zamudio, F.Z., R Conde, C Arevalo, B Becerril, B.M Martin, H.H Valdivia, and L.D Possani (1997), The mechanism of inhibition of ryanodine receptor channels by imperatoxin I, a heterodimeric protein from the scorpion Pandinus imperator, J Biol Chem, 272(18), pp 11886-94 Zamudio, F.Z., G.B Gurrola, C Arevalo, R Sreekumar, J.W Walker, H.H Valdivia, and L.D Possani (1997), Primary structure and synthesis of 129 95 96 Imperatoxin A (IpTx(a)), a peptide activator of Ca2+ release channels/ryanodine receptors, FEBS Lett, 405(3), pp 385-9 Zapp, J.A and D.W Wilson (1938), QUANTITATIVE STUDIES OF CARNOSINE AND ANSERINE IN MAMMALIAN MUSCLE: II THE DISTRIBUTION OF CARNOSINE AND ANSERINE IN VARIOUS MUSCLES OF DIFFERENT SPECIES, Journal of Biological Chemistry, 126(1), pp 19-27 Zhu, S., B Gao, A Aumelas, M del Carmen Rodriguez, H Lanz-Mendoza, S Peigneur, E Diego-Garcia, M.F Martin-Eauclaire, J Tytgat, and L.D Possani (2010), MeuTXKbeta1, a scorpion venom-derived two-domain potassium channel toxin-like peptide with cytolytic activity, Biochim Biophys Acta, 1804(4), pp 872-83 130 PHỤ LỤC 131 Phụ lục 1.Thư xác định tên bọ cạp đen từ An Giang Phụ lục Kết nuôi thử nghiệm bọ cạp tháng (05/2011 – 11/2011) 132 Ngày tháng Số lượng bọ cạp Số lượng bọ cạp Lượng dế nuôi sống (con) chết (con) (gram) Trọng lượng trung bình bọ cạp (gram) Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt 19/05/2011 500 - - - - 11,78 20/5/2011 403 - 97 - 1.000 - 11,78 27/05/2011 376 - 27 - 1.000 - 14,10 03/06/2011 366 - 10 - 1.000 - 15,72 10/06/2011 334 - 32 - 800 - 17,57 20/06/2011 305 - 29 - 800 - 17,82 20/07/2011 275 - 30 - 600 - 18,06 20/08/2011 249 220 26 130 500 500 18,.63 11,23 20/09/2011 202 152 47 68 500 400 18,93 17,64 20/10/2011 150 126 52 26 300 300 19,03 18,12 20/11/2011 144 104 22 300 300 19,73 18,45 133 Đợt Phụ lục 3.Kết lượng nọc thu theo thhời gian (con) Số lượng bị cạp có nọc (con) Số lượng bị cạp khơng có nọc (con) Lượng nọc thơ thu (mg) Lượng nọc thơ trung bình (mg/con) 403 240 163 0.7594 3.16 366 220 146 0.6106 2.76 305 211 94 0,5737 2,72 295 189 106 0,3942 2,09 282 185 97 0,3529 1,91 275 170 105 0,1489 0,88 469 371 98 0,9300 2,51 415 244 171 0,5652 2,32 381 240 141 0,6628 2,76 10 354 235 119 0,4864 1,92 11 315 216 99 0,3758 1,74 12 276 189 87 0,2361 1,25 13 256 170 86 0,2168 1,28 14 248 153 95 0,1996 1,30 Lần Số lượng bò cạp thu nọc 134 Phụ lục 4: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.3 với bước sóng 210 nm Phụ lục 5: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.7 với bước sóng 210 nm 135 Phụ lục 6: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.9 với bước sóng 210 nm Phụ lục 7: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.10 với bước sóng 226 nm 136 Phụ lục 8: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.12 với bước sóng 210 nm Phụ lục Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.13 với bước sóng 210 nm 137 Phụ lục 10: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.15 với bước sóng 226 nm Phụ lục 11: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.17 với bước sóng 226 nm 138 Phụ luc 12: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.18 với bước sóng 226 nm Phụ lục 13: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.22 với bước sóng 226 nm 139 Phụ lục 14: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.24 với bước sóng 226 nm 140