Phân lập và khảo sát tính chất của một số toxin mới từ nọc bò cạp đen Heterometrus laoticus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HOÀNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ TP Hồ Chí Minh – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HOÀNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH Hoàng Ngọc Anh GS TSKH Utkin Yuri Nikolaevich TP Hồ Chí Minh – 2017 MỞ ĐẦU Cùng với phát triển kinh tế, xã hội giới, việc nghiên cứu, tìm tòi, phát triển tìm loại dược phẩm để chữa trị bệnh cho người vấn đề ngày cấp bách xã hội khoa học Bên cạnh việc tổng hợp loại thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật nọc độc động vật nguồn dược liệu quý để bổ sung cho việc tổng hợp nguồn thuốc Từ lâu, nọc độc loài động vật rắn, ong, bọ cạp nhiều loài khác sử dụng làm nguyên liệu để chữa bệnh Trong dân gian, bò cạp thường dùng nguyên (toàn yết) phần đuôi (yết vĩ) để trị động kinh trẻ em, uốn ván, bán thân bất toại, quai bị, méo miệng… dạng thuốc bột làm viên uống Cùng với tiến khoa học, có nghiên cứu giới nọc bò cạp cách 100 năm xác định nọc độc bò cạp có hoạt tính thần kinh Tuy nhiên, việc nghiên cứu nọc bò cạp Việt Nam giai đoạn bắt đầu, chưa có nhiều nghiên cứu công bố việc ứng dụng nọc bò cạp làm thuốc trị bênh cho người mà thuốc dân gian truyền miệng chưa có nhiều kiểm chứng khoa học Trong nọc bò cạp chứa nhiều polypeptide có khả tác động lên thụ thể kênh ion màng tế bào bị kích thích, loại polypeptide nhà khoa học nghiên cứu nhằm tạo thuốc chữa bệnh như: Parkinson, cao huyết áp, ung thư, Alzheimer Nhằm đóng góp nguồn nguyên liệu nghiên cứu khoa học cho ngành dược, hướng tới làm thuốc chữa bệnh làm sở cho nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Qua đề tài “Phân lập khảo sát tính chất toxin số toxin từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus”, hướng nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus laoticus với hi vọng mang đến sở cho nghiên cứu việc ứng dụng nọc bò cạp dùng làm nguồn nguyên liệu cho dược phẩm Trang PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bọ cạp đen Heterometrus laoticus thu mua tỉnh An Giang thành đợt, đợt vào tháng đợt vào tháng với tổng số lần 850 cá thể Bọ cạp thu mua sau nuôi phòng thí nghiệm để lấy nọc phục vụ cho nghiên cứu Để thu nọc bọ cạp từ phần đuôi có chứa túi nọc, bọ cạp kích thích trực tiếp vào phần đuôi (đốt thứ đốt thứ 6) sử dụng dòng điện chiều có tần số kích thích 2,63kHz trì suốt trình tiết nọc bọ cạp (5 – giây) Bọ cạp giữ cố định kim loại, kim loại nối với cực âm nguồn điện Điện cực dương sử dụng để kích thích trực tiếp vào phần đuôi chích để bọ cạp tiết hoàn toàn nọc có túi nọc Nọc bọ cạp tiết thu lam thủy tinh mỏng dạng chất lỏng không màu có màu trắng sữa đục Nọc sau thu làm khô bình hút ẩm có chứa CaCl2 khan khoảng Nọc sau khô gom lại lọ thủy tinh nhỏ bảo quản tủ lạnh nhiệt độ -20oC sử dụng Bọ cạp sau mua để ổn định ngày tiến hành lấy nọc, khoảng cách hai lần lấy nọc liên tiếp hai tuần Nọc thô tinh chế thành phân đoạn nhỏ sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel gel Sephadex G-50 sắc ký lỏng hiệu cao Các phân đoạn nọc thu tiếp tục đánh giá độc tính chuột dễ nghiên cứu cấu trúc sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân khối phổ Trang KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Định danh bọ cạp đen thumẫu An Giang Bọ cạp đen tiến hành thu mẫu vùng An Giang, miền Nam, Việt Nam Sau đó, mẫu vật bọ cạp tiến hành vận chuyển sang Pháp, gửi mẫu phòng Sinh thái môi trường thuộc Viện Bảo tàng lịch sử Quốc gia Pháp Tiến sỹ khoa học Wilson R Lourenco để tiến hành định danh bọ cạp Kết xác định mẫu bọ cạp vùng An Giang thuộc loại Heterometrus laoticus (Phụ lục 1) 3.2 Nuôi bọ cạp phòng thí nghiệm thu hoạch nọc Bọ cạp H laoticus sau thu mua vùng An Giang (2 đợt, 850 cá thể) chia vào thau để tiến hành thử nghiệm nuôi nhốt phòng thí nghiệm, thau có số lượng trung bình từ 65-75 cá thể, tiến hành nuôi theo dõi 06 tháng cho kết hình 3.1 Trang Lượng nọc thô thu (mg) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Đợt 0,93 0,7594 0,6628 0,6106 0,5737 0,5652 0,4864 0,3942 0,3529 0,3758 0,23610,2168 0,1996 0,489 10 11 12 13 14 Số lần Hình 3.1 Lượng nọc bọ cạp thu theo thời gian Lượng nọc thu từ bọ cạp nuôi phòng thí nghiệm giảm dần theo thời gian nuôi Trong phòng thí nghiệm, bọ cạp nuôi với mật độ lớn so với tự nhiên, không gian hoạt động ít, thức ăn cung cấp đầy đủ nên tình trạng cạnh tranh nguồn thức ăn chống lại kẻ thù môi trường tự nhiên 3.3 Khảo sát, đánh giá phân tích nọc thô bọ cạp H laoticus 3.3.1 Phân tích hàm lượng protein tổng nọc thô Lượng protein có nọc thô xác định phương pháp so màu biuret với đường chuẩn xây dựng nồng độ dung dịch albumin khác Từ kết xây dựng đường chuẩn phương trình hồi quy đường chuẩn tính toán nồng độ protein có nọc H laoticus thu 1,293 mg/mL từ xác định hàm lượng protein tan nước dung dịch nọc thô lấy từ bọ cạp 64,65% 3.3.2 Phân tích nọc bọ cạp sắc ký lọc gel gel Sephadex G50 xác định khối lượng phân tử phân đoạn Thực sắc ký lọc gel gel Sephadex G – 50 với 4.500 mg nọc thô Phòng Các chất có hoạt tính sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới, thu phân đoạn nọc với tỷ lệ khối lượng phân đoạn thể bảng 3.1 Trang Bảng 3.1 Khối lượng phân đoạn nọc bọ cạp Phân đoạn Lượng nọc (mg) Tỉ lệ (%) 102,7 5,42 174,2 9,20 253,2 13,37 688,9 36,39 674,2 35,61 Tổng khối lượng 1.893,2 Bằng sắc ký lọc gel, nọc thô từ loài bọ cạp H.laoticusđã phân tách thành phân đoạn nọc khác tương ứng với khối lượng phân tử khác Khối lượng phân tử phân đoạn xác định sơ phương pháp SDS-PAGE so sánh với mẫu chuẩn khối lượng (hình 3.2) kDa M1 Sg Sg Sg Sg Sg 170 130 100 70 55 40 35 25 15 10 Hình 3.2 Kết điện di phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn Trang 3.3.3 Khảo sát độc tính phân đoạn nọc bọ cạp H laoticus chuột Bảng 3.2 Kết thử độc tính chuột phân đoạn nọc Phân Biểu chuột sau tiêm phân đoạn Nhận xét đoạn Nước Chuột gãi mõm, nằm im sau hoạt động bình thường Không độc Chuột giảm hoạt động, xù lông, thở gấp phục Độc nhẹ hồi sau 30 phút Chuột nằm im, chảy nước bọt, liệt chi, thở gấp Độc phục hồi sau Chuột nằm im, mắt nhắm, co giật, liệt chi, chảy Độc gây nước bọt, chuột tử vong sau chết Chuột run, nằm im, hoạt động bình thường sau 60 phút Không độc Chuột run, nằm im, sau bình thường Không độc cất Phân đoạn tách từ nọc thô bọ cạp H laoticus phương pháp sắc ký lọc gel, thông qua thử nghiệm độc tính lên chuột cho thấy phân đoạn có độc tính gây chết Vì vậy, phân đoạn xác định độc tính cấp chuột đạt kết độc tính cấp phân đoạn tách từ nọc thô bọ cạp Heterometrus laoticus LD50 = 24, 07 ± 1,09 mg/kg.Phân đoạn sau xác nhận có độc tính mạnh tiếp tục phân tách HPLC để thu phân đoạn thứ cấp (hình 3.3) Hình 3.3 Sắc ký đồ phân tách phân đoạn HPLC Các phân đoạn thứ cấp phân đoạn tiếp tục đánh giá độc tính chuột cho kết tóm tắt bảng 3.2 Các phân đoạn thứ cấp có độc tính (phân đoạn 4.6, 4.7, 4.11 4.15) tiếp tục tinh chế xác định khối lượng phân tử peptide thành phần Trang Bảng 3.3 Kết thử độc tính phân đoạn thứ cấp Phân đoạn Độc tính Phân đoạn Độc tính 4.1 Không độc 4.14 Không độc 4.2 Không độc 4.15 Gây độc 4.3 Gây độc 4.16 Không độc 4.4 Không độc 4.17 Không độc 4.5 Gây độc 4.18 Không độc 4.6 Độc gây chết 4.19 Không độc 4.7 Gây độc 4.20 Không độc 4.8 Không độc 4.21 Không độc 4.9 Không độc 4.22 Không độc 4.10 Không độc 4.23 Không độc 4.11 Gây độc 4.24 Không độc 4.12 Không độc 4.25 Không độc 4.13 Không độc Nước muối sinh lý Không độc 3.4 Tinh chế xác định khối lượng phân tử phân đoạn thứ cấp Phân đoạn 4.6 phân tách thành phân đoạn gồm 4.6.1, 4.6.2, 4.6.3 Phân đoạn 4.6.1 thu lượng mẫu tương đối ít, phân đoan 4.6.2 4.6.3 lượng mẫu thu nhiều nên tiếp tục tinh chế để xác định khối lượng phân tử Kết cho thấy phân đoạn thứ cấp 4.6.2 có khối lượng phân tử 3.669,155 Da, phân đoạn thứ cấp 4.6.3 có khối lượng phân tử 2.915,040 Da Phân đoạn 4.7 tách phân đoạn Trong đó, peptide 4.7.2 tinh chế khảo sát khối lượng phân tử, kết cho thấy peptide 4.7.1 có khối lượng phân tử 3.700,2 Da peptide 4.7.2 có khối lượng phân tử 3.846,872 Da Phân đoạn 4.11 tách 01 peptide 4.11.1 xác định khối lượng phân tử 3.695,907 Da Phân đoạn 4.15 tách làm phân đoạn peptide Trong số đó, làm xác định khối lượng phân tử ba peptide phân đoạn thứ cấp 4.15.8 2.461,105 Da ; 3.285,285 Da 5.021,4 Da 3.5 Khảo sát cấu trúc bậc polypeptide phân đoạn 4.6 tác động lên kênh K+ 3.5.1 Khảo sát cấu trúc bậc polypeptide phân đoạn 4.6 Bảng 3.4 Khối lượng phân tử polypeptide tách Trang Phân đoạn Khối lượng phân tử (Da) 4.6.2 (Hetlaxin) 3.670,8 4.6.3 2.915,4 4.7.1 3.700,2 4.7.2 3.846,2 4.11 3.700,3 2.461,1 4.15 3.285,3 5.021,4 Các polypeptide từ phân đoạn 4.6.2 (đặt tên Hetlaxin) 4.6.3 khử, sau peridylethyl hóa phân tích khối phổ để xác định số lượng cầu disulfide cấu trúc Kết cho thấy có tín hiệu phù hợp với khối lượng 4.498 Da (cho peptide từ phân đoạn 4.6.2) tín hiệu phù hợp với khối lượng 3.538 Da (cho peptide từ phân đoạn 4.6.3) thu khối phổ MALDI Sự tăng khối lượng tương ứng với với nhóm pyridylethyl phân tử Hetlaxin nhóm polypeptide từ phân đoạn 4.6.3 Điều cho thấy Hetlaxin chứa cầu disulfid polypeptide từ phân đoạn 4.6.3 chứa cầu disulfid Phần cuối N chuỗi polypeptide Hetlaxin xác định phương pháp thoái hóa Edman ISXTGSXQ Trình tự amino acid Hetlaxin đồng thời phân tích khối phổ MALDI (Hình 3.4) Hình 3.4 Phân tích trình tự amino acid Hetlaxin khối phổ Cùng lúc thực vỡ mảnh MS/MS hoàn toàn chuỗi peptide xác định khối lượng peptide phương pháp dấu bàn tay nhờ trypsin Dựa liệu thoái hóa Edman khối phổ hay 3.18 trình tự amino acid Hetlaxin xác định Dữ liệu khối phổ MS/MS mảnh peptide thu tác động trypsin gốc cystein đầu cuối -C bị amide hóa gốc lysin vị trí 30 tìm thấy phương pháp xác định trình tự amino Trang acid MS/MS mảnh thu tác động trypsin Cấu trúc Hetlaxin xác định hình 3.5 KCYDPCKKKTGC KKTGCPNAKCMNK IS QCYD KKTGCPNAKCMNKSC CYGC ISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMN Khối phổ ISXTGSXQ Thoái hóa Edman ISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMNKSCKCYGC Trình tự Hetlaxin Hình 3.5 Cấu trúc bậc Hetlaxin So sánh trình tự amino acid Hetlaxin với trình tự amino acid alpha-toxin có tương tác với kênh kali (Hình 3.6) cho thấy Hetlaxin đồng đẳng toxin Hetlaxin có tương đồng cao với toxin AFB73769, trình tự amino acid toxin suy từ sản phẩm cDNA (tổng hợp) thu từ tuyến nọc bọ cạp H laoticus Thái Lan, chưa có tài liệu hoạt tính sinh học toxin Một toxin tương đồng khác (HsTX1-P59867 toxin Vm24P0DJ31những toxin có tương tác mạnh với kênh Kali Kv1.1 Kv1.3 (Hình 3.6) 10 20 30 ISCTGSKQCY DPCKKKTGCP NAKCMNKSCK CYGC* HETLAXIN ISCTGSKQCY DPCKRKTGCP NAKCMNKSCK CYGCG AFB73769 IRCSGSRDCY SPCMKQTGCP NAKCINKSCK CYGC* P84094(KAX6D_HETSP) ASCRTPKDCA DPCRKETGCP YGKCMNRKCK CNRC* P59867 (KAX63_HETSP) AAAISCVGSPECP PKCRAQ-GCK NGKCMNRKCK CYYC* P0DJ31 (KA211_VAEMS) AAAISCVGSKECL PKCKAQ-GCK SGKCMNKKCK CY-CP P0DJ32(KA212_VAEMS) Hình 3.6 So sánh tương đồng hetlaxin với toxin khác Kết hợp với phân tích khối phổ MS MS/MS liệu thu thực phương pháp thoái hóa Edman, cấu trúc phân đoạn 4.6.2 xác định Sự tương tác peptide tách với kênh Kv1.3 xem xét, từ nhận định chuỗi polypeptide cô lập toxin tạm đặt tên Hetlaxin Hetlaxin thuộc họ alpha-toxin, toxin tách từ H.laoticus có lực mạnh với kênh kali Kv1.3 Trong Hetroscorpin -1 (HS-1) toxin tách từ H.laoticus Thái Lan có trình tự amino acid khác xa so với Hetlaxin báo cáo tách dụng kênh thần kinh K, HelaTx1 tách từ bọ cạp lại tương tác mạnh kênh Kv1.3 Hetlaxin Trang 3.5.2 Khảo sát tác động Hetlaxin lên kênh K+ Sự tương tác Hetlaxin với cổng dẫn truyền ion K+ kênh kali nghiên cứu thí nghiệm cạnh tranh liên kết Chimeric protein KcsA-Kv1.3 KcsA-Kv1.1, biểu khác loài màng E coli, sử dụng kênh K+ R-AgTx2 sử dụng phối tử Sự liên kết R-AgTx2 ghi nhận nhờ kính hiển vi đồng tiêu quét laser Có thể thấy Hetlaxin cạnh tranh hiệu với R-AgTx2 liên kết với hai kênh chimeric (Hình 3.7) Các giá trị IC50 xác định 0,48 ± 0,01 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho Kv1.3 Kv1.1, giá trị Ki tính sử dụng phương trình Cheng-Prusoff 59 ± nM 0,8 ± 0,3 M Những số liệu cho thấy Hetlaxin tương tác hiệu với kênh kali Kv1.3, tương tác với kênh Kv1.1 thấp khoảng mười lần [53,87] 4000 900 600 300 relative units A Signal intensity relative units Signal intensity 1200 B 3000 2000 1000 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 lg [C] lg [C] Hình 3.7 Sự cạnh tranh Hetlaxin với R-AgTx liên kết với kênh kali KcsA-Kv1.1 (A) KcsA-Kv1.3 (B) Cho đến thời điểm tại, từ loài H laoticus phân bố Thái Lan có hai toxin cô lập xác định trình tự Hetroscorpin-1 (HS-1) HelaTx1 HS-1 có khối lượng phân tử 8.293 Da, chứa gốc cysteine thuộc họ scorpine có độc tính với côn trùng có hoạt tính kháng khuẩn báo cáo tương tác HS-1 với kênh kali HelaTx1 có khối lượng phân tử 2.763 Da chứa gốc cysteine, có khả tương tác với kênh kali khác tương tác mạnh với kênh Kv1.1 (EC50 = 9,9 ± 1,6 μM) HelaTx1 liên kết với kênh Kv1.3, nhiên lực liên kết thấp nhiều so với kênh Kv1.1 Ở nồng độ 30 μM, toxin HelaTx1 tương tác 20 % kênh kali Dựa kết thử nghiệm khả liên kết với kênh kali protein từ Hetlaxin cô lập từ nọc loài H laoticus phân bố Việt Nam cho thấy khả liên kết ức chế hoạt động kênh kali Kv1.3 Kv1.1 Đối với kênh Kv1.3, protein phát có khả ức chế nồng độ thấp, 0,48 ± 0,01 μM 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho Kv1.3 Kv1.1 Những nghiên cứu cho thấy Hetlaxincó khả ức chế hoạt động kênh Kv1.3 hiệu HelaTx1 công bố Trang 10 toxin có khả ức chế kênh Kv1.3 mạnh phân lập từ H laoticus (0,48 µM) [90] [85]Trước đây, đa số báo cáo cho thấy toxin nọc bọ cạpH laoticus tác dụng kênh thần kinh Kv1.1 chưa có báo cáo rõ liên kết protein với Kv1.3 Hetlaxin toxin thời điểm viết tách từ nọc bọ cạp H laoticus có tác động mạnh kênh Kv1.3 3.6 Khảo sát độc tính phân đoạn nọc bọ cạp H laoticus lên dế 3.6.1 Kết khảo sát độc tính phân đoạn nọc thu dế Các phân đoạn nọc bọ cạp H laoticus thử nghiệm xác định độc tính côn trùng phương pháp tiêm bên bụng dế, lô gồm tiêm đối chứng sử dụng nước cất cho kết bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết thử độc tính dế phân đoạn nọc PĐ Các biểu dế Nhận xét Dế nằm im, sau hoạt động bình thường Không độc Dế nằm im, sau hoạt động bình thường Không độc Dế nằm im, sau hoạt động bình thường Không độc Dế nằm im, sau hoạt động bình thường Không độc Dế hoạt động mạnh, nhảy liên tục bồn quan sát, sau nằm im, 26 phút sau Độc gây dế ngừng hoạt động, tứ chi rụng ra, tử chết vong Nước cất Dế run, nằm im, sau bình thường Không độc Đối với phân đoạn 5, sau tiêm năm phút đầu tiên, dế hoạt động mạnh, chạy nhảy liên tục Đến phút thứ 10, dế bắt đầu nằm yên đến phút thứ 26, dế có biểu tử vong, tứ chi rụng Phân đoạn xác định phân đoạn có độc tính côn trùng 3.6.2 Xác định độc tính cấp phân đoạn độc lên côn trùng theo đường tiêm bụng bên dế Sau tiến hành tiêm bên bụng dế lô thử nghiệm lô đối chứng xác định sau :  Xác định liều tối đa không gây chết LD0 = 20,3 µg/g  Xác định liều tối thiểu gây chết 100% LD100 = 393,75 µg/g  Xác định liều chết trung bình LD50 theo phương pháp Karber – Behrens theo bảng 3.7 ta có: ∑ab =1.600,52 Trang 11 n = 60/8 = 7,50 𝐿𝐷50 = 𝐿𝐷100 − ∑ 𝑎𝑏 1600,52 = 393,75 − = 180,35 𝑛 7,50 Vậy LD50 = 180,35 µg/g Bảng 3.6 Tỷ lệ tử vong dế liều khác khoảng LD0 LD100 sau 24 tiêm Liều tiêm 20,30 73,65 127,00 180,35 233,70 287,05 340,40 393,75 Số dế/lô 8 8 8 Số dế chết 3 4 Số dế sống 5 4 0,00 37,50 37,50 50,00 50,00 75,00 87,50 100,00 Tỷ lệ chết (%) Bảng 3.7 Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens 1,50 3,00 3,50 4,00 5,00 6,50 6,50 b 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 a.b 80.03 160,05 186,73 213,40 266,75 346,78 346,78 a a: Số trung bình dế chết hai liều Liều tiêm (µg/g) b: hiệu số hai lần 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 200 300 400 % Dế chết Hình 3.8 Đồ thị tỷ lệ % dế chết theo liều dùng Dựa vào đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng ta xác định liều LD16 liều LD84 sau: LD16 = 43,85 µg/g LD84 = 330,65 µg/g Trang 12 Từ tính phân phối chuẩn s = 143,40, với bước nhảy liều d = 53,40 Hằng số Karber – Behrens k = 0,564 Sai số chuẩn liều LD50 tính theo công thức: 𝑘×𝑠×𝑑 𝐸𝑠 = √ 𝑛 Es 23,99 Vậy độc tính cấp phân đoạn tách từ nọc thô bọ cạp H laoticus LD50 = 180,35 ± 23,99 µg/g Như phương pháp Karber – Behrens xác định độc tính cấp phân đoạn độc với côn trùng LD50 = 180,35 ± 23,99 µg/g 3.6.3 Phân tách phân đoạn sắc ký lỏng hiệu cao Phân đoạn sau xác định có độc tính gây chết côn trùng (dế), tiếp tục phân tách để thu toxin nhằm xác định cấu trúc toxin có độc tính xác định khả tương tác kênh kali Phân đoạn phân tách sử dụng sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo, cột Eclipse XDB C18, sắc ký đồ thu hình 3.23 Các phân đoạn sau tách riêng đánh số từ 5.1 đến 5.25 sau sử dụng để đánh giá độc tính dế 3.6.4 Khảo sát độc tính lên dế phân đoạn thứ cấp Dựa vào kết khảo sát độc tính phân đoạn thứ cấp lên côn trùng bảng 3.8, 13 phân đoạn xác định có độc tính dế thử nghiệm phân đoạn 5.3; 5.7; 5.8; 5.9; 5.10; 5.12; 5.13; 5.15; 5.17; 5.18; 5.21; 5.24 Các phân đoạn độc nhẹ tỷ lệ tử vong lô 50 % (3/6) sau giờ, phân đoạn độc mạnh có tỷ kệ tử vong lô 5/6 sau phân đoạn xác định có độc tính mạnh (độc gây chết, tỷ lệ 5/6) phân đoạn: 5.7, 5.12, 5.15, 5.21 Bảng 3.8 Kết thử độc tính phân đoạn sau tách sắc ký lỏng hiệu cao lên côn trùng Phân đoạn 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 Kết Không độc (0/6) Không độc (0/6) Độc nhẹ (3/6) Không độc (0/6) Không độc (0/6) Phân đoạn Phân đoạn 5.9 Kết Độc nhẹ (3/6) 5.17 Kết Quả Độc nhẹ (3/6) 5.10 Độc nhẹ (3/6) 5.18 Độc nhẹ (3/6) 5.11 5.19 Không độc (0/6) 5.12 Không độc (0/6) Độc mạnh (5/6) 5.20 Không độc (0/6) 5.13 Độc nhẹ (3/6) 5.21 Độc mạnh (5/6) Trang 13 5.6 5.7 5.8 Không độc (0/6) Độc mạnh (5/6) Độc nhẹ (3/6) 5.14 5.15 5.16 Không độc (0/6) Độc mạnh (5/6) Không độc (0/6) 5.22 Độc nhẹ (3/6) 5.23 5.24 Không độc (0/6) Độc nhẹ (3/6) Từ kết sơ trên, phân đoạn độc côn trùng tiến hành tinh chế để thu mẫu toxin nhằm tiến hành xác định khối lượng phân tử toxin Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn 3.7 Cô lập xác định khối lượng phân tử phân đoạn thứ cấp có độc tính 3.7.1 Cô lập polypeptide từ phân đoạn thứ cấp Các phân đoạn thứ cấp xác định có độc tính phân tách sắc ký lỏng hiệu cao nhằm thu chuỗi polypeptide để phân tích xác định cấu trúc khả tương tác đối kênh kali Kết tóm tắt trình cô lập thể bảng bảng 3.8 3.7.2 Xác định cấu trúc chuỗi polypeptide phân đoạn 5.21 Phân đoạn 5.21 chọn để tiếp tục tiến hành sắc ký để cô lập hai chuỗi polypetide có thành phần từ xác định đặc tính hai chuỗi polypeptide Khối lượng phân tử hai chuỗi polypeptide xác định phương pháp khối phổ MALDI-TOF cho kết khối lượng phân tử hai phân đoạn 5.21.1 5.21.2 317,974 Da 832,600 Da Đây toxin ngắn, khác với toxin xác định có độc tính côn trùng nọc bọ cạp H laoticus phân bố Thái Lan toxin dài có khối lượng phân tử lớn 8.293,07 Da [90] Phân đoạn 5.21.1 xác định cấu trúc sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân Nhiệt độ độ pH mẫu thay đổi khoảng 10 – 45 oC – 7,5 Đầu tiên xác định hệ spin peptide Trang 14 phổ DQF-COSY, tiếp theo, phổ NOESY để xác định trình tự amino acid chuổi peptide Thu kết phổ NMR hình 3.38 [12,29,30,46,52,75] Hình 3.10 Phổ NMR toxin 5.21.1 Qua hình 3.10, cho thấy H gốc amin cuối bị ion hóa Dựa vào kết phổ NMR phổ MS dự đoán cấu trúc toxin 5.21.1 dipeptide Leu-Trp (hình 3.11) Như vậy, phân đoạn nọc bọ cạp H.laoticus có độc tính côn trùng, làm toxin phân đoạn 5.21.1 Leu-Trp toxin ngắn có khối lượng phân từ 317,974 Da A B Trang 15 C Hình 3.11 Cấu trúc toxin 5.21.1 (Leu-Trp) A: Cấu trúc phẳng Leu – Trp ; B : Vị trí nhóm H phổ NMR C: Mô hình cấu trúc không gian Leu - Trp Số lượng dipeptide có hoạt tính sinh học phát từ thiên nhiên tính tới thời điểm viết hạn chế Một vài dipeptide có hoạt tính sinh học phát sớm carnosine (β-alanyl-L-histidine) anserine (β-alanyl-N-methyl-L-histidine) tìm thấy mô mô não động vật Cùng với homocarnosine ophidine, dipeptide nghiên cứu khả kháng oxy hoá tiềm ứng dụng dược phẩm Có công bố hoạt tính carnosine anserine khả điều trị số bệnh người đái tháo đường, xơ vữa động mạch, Alzheimer nhờ khả ngăn cản hình thành sản phẩm glycat hoá (các sản phẩm glycosyl hoá protein hay lipid mà tham gia enzyme điều hoà) Gần đây, từ mô cá hồi Chum (Oncorhynchus keta), số dipeptide, điển hình Phe–Leu, Ala–Trp, Val–Trp, Met–Trp, Ile–Trp, Leu–Trp, tìm thấy cho kết thử nghiệm ức chế enzyme ACE (angiotensin-converting enzyme), từ mang tới tiềm sử dụng làm thuốc điều trị bệnh tăng huyết áp [42,50,68,79,95,100,105] Trang 16 KẾT LUẬN Qua trình khảo sát nghiên cứu nọc từ bọ cạp Heterometrus laoticus phân bố An Giang, số kết sau ghi nhận tóm tắt sau Bọ cạp Heterometrus laoticus tự nhiên bị ảnh hưởng môi trường xung quanh, cạnh tranh nguồn thức ăn, chống lại kẻ thù nên lượng nọc thô bọ cạp tương đối nhiều Trong điều kiện nuôi phòng thí nghiệm, bọ cạp vận động, thức ăn nước cung cấp đầy đủ nên trọng lượng bọ cạp tăng nhiều, lượng nọc thu giảm đáng kể theo thời gian nuôi Điều kiện nuôi thử nghiệm phòng thí nghiệm sau :  Số lượng bọ cạp trung bình 50 thau nuôi  Cho ăn tuần lần, trung bình 2,00 g dế/bọ cạp  Lượng nọc thu 850 bọ cạp tháng nuôi 6,9653 g nọc, trung bình 8,19 mg/con Bằng phương pháp sắc ký lọc gel gel Sephadex G-50 với dung môi đệm ammonium acetate (pH = 4,7), nọc thô bọ cạp H laoticus tách thành phân đoạn nọc có ba phân đoạn có độc tính phân đoạn 2, Trong ba phân đoạn độc có phân đoạn phân đoạn độc gây chết chuột, phân đoạn gây độc chuột sau phục hồi Khi khảo sát độc tính phân đoạn tách côn trùng cho thấy phân đoạn có độc tính gây chết dế So sánh kết điện di cho thấy phân đoạn chứa protein có khối lượng phân tử nằm vùng từ đến 10 kDa khoảng 65 kDa Phân đoạn chứa protein có khối lượng phân tử khoảng kDa kDa Khảo sát phân đoạn có độc tính gây chết chuột  Độc tính cấp phân đoạn theo tiêm tĩnh mạch chuột, liều chết trung bình LD50 24,07 ± 1,09 mg/kg, xếp vào độc loại II (loại có độc tính cao) so sánh với độc tính cấp nọc thô, phân đoạn lại có độc tính yếu nọc thô, điều xác định nọc thô, peptide có khối lượng phân tử thấp độc động vật peptide có khối lượng phân tử lớn enzyme phospholipase có tác dụng độc động vật, chúng tương tác với làm cho độc tính nọc thô mạnh so với phân đoạn  Bằng phương pháp HPLC, phân đoạn tách thành 25 phân đoạn thứ cấp khác Trong có phân đoạn có độc tính gây chết động vật phân đoạn 4.6 phân Trang 17 đoạn khác có độc tính không gây chết chuột phân đọan thứ cấp 4.3, 4.5, 4.7, 4.11, 4.15  Phân đoạn 4.6 tiếp tục phân tách xác định khối lượng phân tử polypeptide có phân đoạn 4.6 : phân đoạn 4.6.2 3.670,8 Da, phân đoạn 4.6.3 2.915,4 Da, phân đoạn 4.7.1 3.700,2 Da, phân đoạn 4.7.2 3.846,2 Da, phân đoạn 4.11.1 3.700,3 Da, phân đoạn 4.15 2.461,1 Da; 3.285,3 Da; 5.021,4 Da  Trong polypeptide tách xác định polypeptide phân đoạn 4.6.2 toxin có tác dụng mạnh với kênh Kv1.3 Toxin đặt tên Heltaxin xếp vào họ alphatoxin Hetlaxin toxin lần tách từ H.laoticus mà có lực mạnh với kênh kali Kv1.3 với cấu trúc sau : ISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMNKSCKCYGC Khảo sát phân đoạn độc dế  Xác định độc tính cấp dế (theo đường tiêm bên bụng dế) LD50 = 180,35 ± 23,99 µg/g  Phân đoạn độc côn trùng xác định 24 phân đoạn thứ cấp phương pháp HPLC Trong phân đoạn độc mạnh (độc gây chết 100 % dế thử nghiệm) phân đoạn 5.3; 5.7; 5.8; 5.9; 5.10; 5.12; 5.13; 5.15; 5.17; 5.18; 5.21; 5.24 phân đoạn độc nhẹ (chết 50 % dế thử nghiệm) phân đoạn : 5.7; 5.12; 5.15; 5.21  Đã xác định khối lượng phân tử phân đoạn thứ cấp 5.21.1 317,974 Da phân đoạn thứ cấp 5.21.2 832,600 Da  Bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân xác định cấu trúc toxin 5.21.1 Leu-Trp Trang 18 PHỤ LỤC Trang 19 Phụ lục Kết nuôi thử nghiệm bọ cạp tháng (05/2011 – 11/2011) Ngày tháng Số lượng bọ cạp Số lượng bọ cạp Lượng dế nuôi sống (con) chết (con) (gram) Trọng lượng trung bình bọ cạp (gram) Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt 19/05/2011 500 - - - - 11,78 20/5/2011 403 - 97 - 1.000 - 11,78 27/05/2011 376 - 27 - 1.000 - 14,10 03/06/2011 366 - 10 - 1.000 - 15,72 10/06/2011 334 - 32 - 800 - 17,57 20/06/2011 305 - 29 - 800 - 17,82 20/07/2011 275 - 30 - 600 - 18,06 20/08/2011 249 220 26 130 500 500 18,.63 11,23 20/09/2011 202 152 47 68 500 400 18,93 17,64 20/10/2011 150 126 52 26 300 300 19,03 18,12 20/11/2011 144 104 22 300 300 19,73 18,45 Trang 20 ... hành nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Qua đề tài Phân lập khảo sát tính chất toxin số toxin từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus , hướng nghiên cứu nọc bò cạp Heterometrus laoticus với... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HOÀNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS. .. Hetlaxin toxin thời điểm viết tách từ nọc bọ cạp H laoticus có tác động mạnh kênh Kv1.3 3.6 Khảo sát độc tính phân đoạn nọc bọ cạp H laoticus lên dế 3.6.1 Kết khảo sát độc tính phân đoạn nọc thu