Sự đột biến kháng rifampicin và isoniazid của mycobacterium tuberculosis phân lập tại bệnh viện trung ưng huế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH MAI VĂN TUẤN SỰ ĐỘT BIẾN KHÁNG RIFAMPICIN VÀ ISONIAZID CỦA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG HUẾ Chuyên ngành : Vi sinh y học Mã số : 62 72 01 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Hùng Vân TS Hoàng Tiến Mỹ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, tất số liệu kết luận án trung thực chưa công bố người khác Tác giả luận án MAI VĂN TUẤN MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN LAO 1.2 TÌNH HÌNH MẮC BỆNH LAO 1.3 VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 16 1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC 23 1.5 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN MỨC ĐỘ KHÁNG THUỐC 38 1.6 NHẬN ĐỊNH VỀ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 43 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.3 CÁC KỸ THUẬT ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 47 2.4 CÁC THIẾT BỊ, DỤNG CỤ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 68 2.5 CÁC HÓA CHẤT , NGUYÊN LIỆU KHÁC 68 2.6 XỬ LÝ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 69 2.7 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 69 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 72 3.1 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA MẪU NGHIÊN CỨU 72 3.2 MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO DÒNG THỨ NHẤT CỦA CÁC VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP ĐƯỢC 75 3.3 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 76 3.4 SO SÁNH MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO THEO CÁC YẾU TỐ KHÁC NHAU 92 Chương 4: BÀN LUẬN 98 4.1 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA MẪU NGHIÊN CỨU 99 4.2 MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO DÒNG THỨ NHẤT CỦA CÁC VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP ĐƯỢC 106 4.3 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 114 4.4 SO SÁNH MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO THEO CÁC YẾU TỐ KHÁC NHAU 130 KẾT LUẬN 138 KIẾN NGHỊ .140 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Mẫu hồ sơ bệnh nhân nghiên cứu Phụ lục 2: Một số quy trình tham khảo Phụ lục 3: Danh sách bệnh nhân nghiên cứu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AFB Acid-Fast Bacillus (Trực khuẩn kháng acid) AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) ARN Acid ribonucleic AT Adenine Thymine bp Base pair (Cặp bazơ, đơn vị đo chiều dài phân tử ADN) CFU Colony-Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CTCLQG Chương trình chống lao quốc gia DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di gel gradient biến tính nồng độ) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn men) EMB Ethambutol FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer (Hiệu ứng truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang) GC Guanine Cytosine HIV Human Immunodeficiency Virus (Virus gây suy giảm miễn dịch người) INH Isoniazid IUATLD International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (Liên hiệp quốc tế chống Lao Bệnh phổi) katG Gen mã hóa catalase peroxidase MAS-PCR Multiplex Allele Specific - PCR (PCR với nhiều alen đặc hiệu) MDR-TB Multidrug-Resistant TB (Bệnh lao đa kháng thuốc) MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube (Ống môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn lao phát huỳnh quang) MTB Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCR-RFLP PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (Kỹ thuật đa hình sử dụng men phân cắt giới hạn) PCR-SSCP Single-Strand Conformation Polymorphism (Đa hình cấu hình sợi đơn) RIF Rifampicin rpoB RNA Polymerase Beta subunit (gen mã hoá cho tiểu phần beta subunit ARN polymerase) RRDR Rifampicin Resistance-Determining Region (Vùng xác định đề kháng Rifampicin) TB Tuberculosis (Bệnh lao) Tm Melting temperature (Nhiệt độ biến tính) TP.HCM thành phố Hồ Chí Minh WHO World Health Organisation (Tổ chức Y tế giới) XDR-TB Extensive Drug Resistance TB (Bệnh lao siêu kháng thuốc cực kháng) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kính hiển vi điện tử Hình 1.2 a Nhuộm Ziehl-Neelsen vi khuẩn lao b Vi khuẩn lao nuôi cấy môi trường Löwenstein- Jensen Hình 1.3 Cấu trúc lớp vỏ Mycobacterium tuberculosis Hình 1.4 Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh lao, 2013 Hình 1.5 Bản đồ tỷ lệ mắc lao có MDR-TB Hình 1.6 Bản đồ tỷ lệ mắc lao điều trị có MDR-TB Hình 1.7 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao Hình 1.8 Kỹ thuật MGIT ống xét nghiệm Hình 1.9 Sơ đồ khối máy tự động giải trình tự dùng gel polyacrylamide Hình 1.10 Các strip LiPA với các kiểu đột biến khác Hình 1.11 Hình biểu diễn chế hoạt động phân tử beacon Hình 1.12 Hình biểu diễn chế hoạt động mẫu dò Taqman Hình 1.13 Hình biểu diễn chế hoạt động mẫu dò FRET Hình 1.14 Hệ thống Gene Xpert Hình 1.15 Bản đồ đánh giá tỷ lệ nhiễm HIV ở trường hợp lao lao tái phát năm 2013 Hình 2.1 Thử nghiệm Niacin Hình 2.2 Thử nghiệm khử Nitrate Hình 2.3 Hình ảnh kháng sinh đồ lao theo phương pháp tỷ lệ Hình 2.4 Hình ảnh minh họa đọc kết kháng sinh đồ theo phương pháp tỷ lệ Hình 2.5 Giao diện ứng dụng Primer3 Hình 2.6 Trình tự đoạn gen rpoB đăng ký ngân hàng gen NCBI Hình 2.7 Các cặp mồi đặc hiệu cho gen rpoB thiết kế Primer3 Hình 2.8 Trình tự nhân gen rpoB vị trí gắn mẫu dò Hình 2.9 Trình tự nhân gen katG vị trí gắn mẫu dò Hình 2.10 Giao diện hệ thống “Dữ liệu đột biến kháng thuốc chống lao” Hình 3.1 Đột biến gen katG các codon 200 (AAACAG), 203 (ACC GCG), 215 (GATGTT) các chủng kháng INH + STM/EMB Hình 3.2 Đột biến gen katG các codon 315 (AGCACC), 317 (ATT GTG), 328 (TGGCGT), 329 (GATGGC) các chủng kháng INH + STM/EMB Hình 3.3 Đột biến gen katG các codon 349 (GGCGTG), 350 (GCG AGC) các chủng kháng INH + STM/EMB Trang 18 18 20 27 28 30 32 34 35 37 39 51 51 52 52 57 58 59 60 60 67 85 85 85 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 So sánh các đoạn gen rpoB các chủng đa kháng chủng H37Rv So sánh các đoạn gen katG các chủng kháng INH chủng H37Rv Khuẩn lạc M tuberculosis môi trường nuôi cấy Sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoB cặp mồi rpoB-F rpoB-R Sản phẩm PCR nhân đoạn gen katG cặp mồi katG-F katG-R 89 90 91 91 91 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1 Biểu đồ 1.2 Biểu đồ 1.3 Biểu đồ 3.1 Biểu đồ 3.2 Trang Đánh giá xu hướng tử vong bệnh lao giai đoạn 1990 – 2013 10 dự báo tỷ lệ tử vong bệnh lao giai đoạn 2014 – 2015 Số lượng lưu hành bệnh lao Việt Nam (trên 100.000 dân) 12 Tỷ lệ tử vong bệnh lao Việt Nam (trên 100.000 dân) 12 Phân bố theo giới 72 Phân bố vi khuẩn lao theo nhóm tuổi vùng cư trú 75 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 2.4 Bảng 2.5 Bảng 2.6 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Đánh giá tình hình bệnh lao Việt Nam, 2013 Kết phát bệnh nhân lao năm 2014 Việt Nam Đánh giá tình hình lao đa kháng thuốc Việt Nam, 2013 Thang đọc kết theo CTCLQG-Bộ Y tế Tỷ lệ kháng thuốc tiêu chuẩn đối với số thuốc kháng lao Kết tách chiết ADN số chủng lao đa kháng Kết tách chiết ADN số chủng lao đơn kháng Trình tự tham khảo các cặp mồi rpoB katG Các primer dùng để phát khuếch đại gen rpoB katG Phân bố theo nhóm tuổi Phân bố theo địa phương Phân bố theo loại bệnh phẩm Phân bố theo yếu tố khác Phân bố vi khuẩn lao theo tuổi vùng cư trú Tỷ lệ đề kháng thuốc chống lao dòng thứ Các kiểu hình kháng thuốc Kết giải trình tự phát đột biến gen rpoB Kết xác định trình tự gen rpoB các chủng đa kháng Đặc điểm đột biến gen rpoB ở các chủng lao kháng RIF Trang 12 13 19 49 53 54 54 56 60 72 73 73 74 74 75 76 77 77 79 Bảng 3.11 Tần số các đột biến ở các codon gen rpoB các chủng lao kháng RIF Bảng 3.12 Tần số các đột biến các codon khác đoạn gen rpoB Bảng 3.13 Kết giải trình tự phát đột biến gen katG Bảng 3.14 Kết xác định trình tự gen katG Bảng 3.15 Liên quan vị trí đột biến gen katG đến kháng INH Bảng 3.16 Tần số các đột biến ở các codon gen katG các chủng lao kháng INH Bảng 3.17 Các kiểu đột biến xảy đoạn gen katG liên quan đặc tính kháng thuốc chống lao Bảng 3.18 Sự phân bố kháng thuốc theo tiền sử dùng thuốc kháng lao Bảng 3.19 Sự phân bố kháng thuốc RIF theo tiền sử dùng thuốc kháng lao Bảng 3.20 Sự phân bố kháng thuốc INH theo tiền sử dùng thuốc kháng lao Bảng 3.21 Sự phân bố kháng thuốc EMB theo tiền sử dùng thuốc kháng lao Bảng 3.22 Sự phân bố kháng thuốc STM theo tiền sử dùng thuốc kháng lao Bảng 3.23 Sự phân bố kháng thuốc theo vùng cư trú bệnh nhân Bảng 3.24 Sự phân bố kháng thuốc theo nhóm tuổi trên/dưới 60 tuổi Bảng 3.25 Sự phân bố kháng thuốc theo đánh giá số lượng trực khuẩn nhuộm Ziehl-Neelsen Bảng 3.26 Sự phân bố kháng thuốc theo giới tính Bảng 3.27 Sự phân bố kháng thuốc theo kết xét nghiệm HIV Bảng 3.28 Sự phân bố đột biến gen rpoB theo tiền sử dùng thuốc kháng lao ở các chủng kháng RIF Bảng 3.29 Sự phân bố đột biến gen katG theo tiền sử dùng thuốc kháng lao ở chủng kháng INH Bảng 4.1 Tỷ lệ lao đa kháng Việt Nam 80 81 82 82 86 87 87 92 92 93 93 94 94 95 95 96 96 97 97 111 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình giải trình tự gen Sơ đồ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu Trang 64 71 MỞ ĐẦU Bệnh lao bệnh truyền nhiễm Mycobacterium tuberculosis gây Tổ chức y tế giới (WHO) khuyến cáo tình trạng khẩn cấp toàn cầu tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ tử vong cao, di chứng hậu nặng nề mặt kinh tế xã hội kèm theo Bệnh lao gia tǎng với đại dịch HIV/AIDS tình hình kháng thuốc vi khuẩn lao vấn đề đáng lo ngại Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ghi nhận có khoảng triệu người bị mắc bệnh lao năm 2013, nửa (56%) Đông Nam Á Tây Thái Bình Dương, có 1,5 triệu ca tử vong bệnh lao, 360.000 người có HIV dương tính (WHO-2014) 128 Vi khuẩn lao phân lập vào năm 1882 Streptomycin thuốc kháng lao tìm Selman Abraham Waksman năm 1944 bệnh lao bệnh gây chết người nhiều năm nước phát triển 99, 109 Từ thập niên 90 đến nay, xuất nhiều chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, khó điều trị có nguy lây lan nhanh, đe dọa hàng triệu người giới Theo WHO, năm 2013 có 480.000 ca bệnh lao đa kháng thuốc (Multidrug-resistant TB, MDR-TB) số đó, 210.000 người tử vong 128 Tỷ lệ lao đa kháng thuốc tổng số ca nhiễm lao toàn cầu 3,5% tổng số ca qua điều trị 20,5% Tỷ lệ tử vong bệnh lao 15/100.000 dân Việt Nam đứng thứ 12 22 nước có số bệnh nhân lao cao toàn cầu Năm 2013, Việt Nam ước tính có 130.000 ca nhiễm lao tương đương tỷ lệ mắc bệnh 144 ca/100.000 dân Tỷ lệ lao đa kháng thuốc tổng số ca nhiễm lao 4% tổng số ca qua điều trị 23% 128 Vấn đề vi khuẩn lao kháng thuốc nội dung cần quan tâm lớn chương trình kiểm soát bệnh lao Vi khuẩn lao đa kháng thuốc, định nghĩa kháng hai loại thuốc Rifampicin (RIF) Isoniazid (INH), ngày gia tăng Hơn nữa, WHO đưa khái niệm vi khuẩn lao kháng thuốc rộng rãi hay cực kháng (Extensive Drug Resistance TB, XDR-TB), vi 120 Vinnard C et al (2011), “Isoniazid-Resistant Tuberculosis, Taiwan, 2000– 2010”, Emerging Infectious Diseases, Vol 17, No 9, pp 1769-1770 121 Werngren J., Lisbeth Klintz, Sven E Hoffner (2006), “Evaluation of a Novel Kit for Use with the BacT/ALERT 3D System for Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, Vol 44, No 6, pp 2130-2132 122 Weyer Karin, Fuad Mirzayev, Giovanni Battista Migliori et al (2013), “Rapid molecular TB diagnosis: evidence, policy making and global implementation of Xpert MTB/RIF”, European Respiratory Journal, Vol 42, pp 252-271 123 WHO (2008), Molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) 124 WHO (2008), Anti-Tuberculosis drug resistance in the world, Fourth Global Report The WHO/IUATLD Global Project on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance 2002-2007 125 WHO (2009), Global Tuberculosis Control: EPIDEMIOLOGY, STRATEGY, FINANCING 126 WHO (2011), Global tuberculosis control: WHO report 2011 127 WHO (2013), Global tuberculosis report 2013 128 WHO (2014), Global tuberculosis report 2014 129 WHO (2012), Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) 2012 Update 130 Yang Song, Min Zhong, Yaoting Zhang, Yiwei Wang (2011), “Rapid detection of rpoB and katG genes from the sputum of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction (PCR)-direct sequencing analysis”, African Journal of Microbiology Research, Vol 5, No 26, pp 4519-4523 131 Zenteno-Cuevas R., Zenteno JC., Cuellar A et al (2009), “Mutations in rpoB and katG genes in Mycobacterium isolates from the Southeast of Mexico”, Memories of the Oswaldo Cruz Institute, Rio de Janeiro, Vol 104, No 3, pp 468-472 132 Zhang Y., Yew W W (2009), “Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Vol 13, No 11, pp 1320-1330 PHỤ LỤC Thông tin mẫu nghiên cứu Mã số: I Phần hành chính: - Họ tên bệnh nhân: - Tuổi: - Giới: Nam Nữ - Địa chỉ: - Kết xét nghiệm HIV: Âm tính Dương tính - Đã dùng thuốc kháng lao: Không Có II Mẫu bệnh phẩm: - Ngày tháng phân lập: - Loại bệnh phẩm: III Kết xét nghiệm: - Nhuộm Ziehl-Neelsen: * Âm tính: * Dương tính: 1+ 2+ 3+ - Kháng sinh đồ lao với loại thuốc kháng lao dòng thứ nhất: + Nhạy cảm: + Kháng Isoniazid (H): + Kháng Rifampicin (R): + Kháng Streptomycin (S): + Kháng Ethambutol (E): - Kết Giải trình tự: Gen Không có đột biến Có đột biến Vị trí: Vị trí: Vị trí: katG Vị trí: Vị trí: Vị trí: Vị trí: Vị trí: rpoB Vị trí: Vị trí: * Ghi chú: PHỤ LỤC MỘT SỐ QUY TRÌNH THAM KHẢO Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen (ZN) - Chuẩn bị thuốc nhuộm + Carbon fucshin đặc: Fucshin basic 1,0 g Ethanol 95% (v/v) 10,0 ml Phenol 5,0 g Nước cất 100,0 ml Fucshin basic hoà tan ethanol, phenol hoà tan nước cất Trộn dung dịch với nhau, để vài ngày lọc qua giấy loc, cho vào chai + Dung dịch acid - alcohol: HCl đặc: 8,0 ml Ethanol 95% (v/v): 97,0 ml (Nên cho axit vào cồn) + Methylene blue: Methylen blue: 8,0 g Ethanol 95% (v/v): Nước cất: 300,0 ml 1300,0 ml Potassium hydroxide (KOH): 0,13 g - Qui trình nhuộm: + Carbon fushin đặc: 10 phút Cho carbon fushin ngập tiêu cố định Tiêu đặt giá Dung lửa đèn cồn đốt phía tiêu để thuốc nhuộm bốc 10 phút không sôi + Chất tẩy màu acid-alcohol: 15 phút (tẩy nhiều lần) + Methylen blue: Rửa nước cất, để khô 20 giây Phương pháp PCR Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis cộng phát minh năm 1985 Thực chất phương pháp tạo dòng in vitro không cần diện tế bào 2.1 Nguyên tắc Tất DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn cần diện mồi chuyên biệt Mồi đoạn DNA ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn, DNA polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Phương pháp PCR hình thành dựa vào đặc tính DNA polymerase Thật vậy, ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA tổng hợp đoạn DNA nằm hai mồi Về mặt thực nghiệm, phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm ba bước: - Bước 1: Đây giai đoạn biến tính (denaturation) Ở giai đoạn này, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 94 oC - 95oC vòng 30 giây – phút - Bước 2: Đây giai đoạn lai (hybridization) gọi giai đoạn bắt cặp mồi (primer annealing) Ở giai đoạn này, nhiệt độ thấp so với Tm mồi, cho phép mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ thường dao động khoảng 40-70oC tùy thuộc Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 giây–1 phút - Bước ba: Đây giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation) Nhiệt độ phản ứng đến giai đoạn tăng lên 72oC giúp DNA polymerase hoạt động tốt Thời gian bước tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút Chu kỳ bao gồm ba bước lặp lặp lại nhiều lần lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Đây khuếch đại theo cấp số nhân 2.2 Thành phần phản ứng PCR Một phản ứng PCR V=25l gồm: 1.5mM MgCl2, 200µM loại dNTP, 0.625 unit Taq DNA polymerase, 0.25µM mồi, Taq buffer, nước cất lần 2.3 Các bước tiến hành Đối với mẫu, thực sau: 20l mix PCR pha + 5l dịch DNA tách chiết, cho vào eppendprf 0.2ml Đặt chương trình cho máy luân nhiệt hoạt động: Bước 1: 95oC phút Bước 2: 95oC 50 giây 65oC 40 giây 72oC 20 giây 72oC phút Bước 3: chu kỳ 30 chu kỳ chu kỳ Phương pháp điện di gel agarose 3.1 Nguyên tắc Nguyên tắc phương pháp dựa đặc tính cấu trúc nucleic acid Đó đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường, chúng di chuyển hướng cực dương Sự phát quan sát mắt thường đèn UV nhờ phát màu ethidium bromide gắn xen DNA Sự di chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào hình dạng tỷ số điện tích/ khối lượng, nhờ chất khác tách thành vết riêng phát nhiều cách khác Tuy nhiên, hầu hết phân tử DNA có hình dạng tỷ số điện tích/khối lượng không tách điện di thông thường, mà phải dùng kỹ thuật điện di gel Gel làm agarose hay polyacrylamid có lỗ dây polymer agarose hay polyacrylamid đan với tạo thành, điện di, phân tử DNA phải chui qua lỗ để đến điện cực, phân tử DNA nhỏ di chuyển nhanh phân tử lớn hơn, nhờ ta tách DNA theo kích thước phân tử Tốc độ điện di DNA qua gel tùy thuộc vào bốn thông số chính:  Kích thước phân tử DNA – thông số định Phân tử DNA sợi đôi duỗi thẳng di chuyển với tốc độ tỷ lệ nghịch với logarit trọng lượng phân tử chúng  Hình dạng DNA, dạng tồn DNA dạng siêu xoắn, dạng vòng dạng thẳng có trọng lượng phân tử thành phần di chuyển qua gel với tốc độ khác  Nồng độ gel xác định tốc độ di chuyển hiệu phân tách phân tử DNA, di chuyển phân tử DNA tỉ lệ nghịch với nồng độ gel  Điện sử dụng - điện thấp, tốc độ di chuyển tỷ lệ với điện sử dụng 3.2 Hóa chất dùng cho điện di  Gel agarose 2%  Dung dịch TAE 50X (242g Tris-base, 57.1ml glacial acetic acid, 100ml EDTA 0.5M, pH 8.0)  Dung dịch nạp mẫu 6X (40% glycerol, 0.25% bromophenol blue)  Ethidium bromide (10mg/ml)  Thang chuẩn Gel agarose 2%: cân 2g agarose hoà tan dung dịch TAE 1X cho đủ 100ml; đun cho tan agarose hoàn toàn, để nguội đến 60oC, thêm 5l ethidium bromide; lắc cho tan đều, đổ gel vào giá có lắp sẵn lược Chờ đến gel khô, lấy gel khỏi giá, gỡ bỏ lược, bảo quản 4oC đến sử dụng 3.3 Tiến hành Cho 3l dung dịch nạp mẫu + 7l sản phẩm PCR mẫu vào giếng Điện di 50 vol 5-10 phút, sau tăng lên 75 vol 25-30 phút Chuyển gel lên bàn đèn tử ngoại máy đọc Gel-Doc (Bio-Rad); quan sát, chụp hình, ghi nhận kết so với thang chuẩn PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU TT Họ tên bệnh nhân Địa Ngày xét Giới Tuổi Nữ 25 Phú Mỹ, Phú Vang, TT Huế 18/02/2008 nghiệm Trương Thị Bảo V Hồ D Nam 78 Phú Hải, Phong Điền, TT Huế 27/02/2008 Tạ Hồng H Nam 65 An Cựu, TP Huế 10/03/2008 Hoàng Đ Nam 85 Ngô Quyền, TP Huế 04/03/2008 Lê Viết X Nam 52 Thủy Bằng, TT Huế 07/03/2008 Huỳnh K Nam 86 An Cựu, TP Huế 06/03/2008 Trần Thị C Nữ 57 Thuận An, TT Huế 21/03/2008 Nguyễn Văn D Nam 80 Lệ Thủy, Quảng Bình 21/03/2008 Phạm Văn T Nam 85 Vỹ Dạ, TP Huế 21/03/2008 10 Nguyễn Đ Nam 41 F3 TX Đông Hà, Quảng Trị 11/03/2008 11 Đặng Văn V Nam 46 Quảng Trạch, Quảng Bình 04/03/2008 12 Hồ Quang L Nam 34 Hương Sơ, TP Huế 31/03/2008 13 Tôn Thất S Nam 50 29.Đ.B.P, F Trường An, TP Huế 17/03/2008 14 Đỗ Thị M Nữ 32 28.T.T.Hiệp, F Đúc TP Huế 01/04/2008 15 Nguyễn Văn M Nam 45 Phong Hòa, P Điền, TT Huế 07/04/2008 16 Nguyễn Thị L Nữ 77 Vinh Thái, Phú Vang, TT Huế 08/04/2008 17 Hoàng Thị L Nữ 35 Phú An, Phú Vang, TT Huế 23/04/2008 18 Lê Thị C Nữ 51 Thuận An, Phú Vang, TT Huế 23/04/2008 19 Hà Thị Lệ H Nữ 18 Lệ Thủy, Quảng Bình 02/05/2008 20 Huỳnh Văn V Nam 50 Hương Sơ, TP Huế 28/04/2008 21 Nguyễn Văn P Nam 38 Tuyên Hóa, Quảng Bình 05/05/2008 22 Nguyễn Văn L Nam 43 CT Dệt may T Dương, TT Huế 12/05/2008 23 Mai Quang N Nam 33 Gio Linh, Quảng Trị 29/04/2008 24 Nguyễn T Nam 70 Lệ Thủy, Quảng Bình 06/05/2008 25 Trần Nhơn P Nam 21 Thị Trấn Sịa, TT Huế 16/05/2008 26 Nguyễn Thị L Nữ 38 TT Phú Bài, TT Huế 20/05/2008 TT Họ tên bệnh nhân Giới Tuổi Địa Ngày xét nghiệm 27 Thái Văn T Nam 70 Tuyên Hóa, Quảng Bình 15/07/2008 28 Trương Văn K Nam 53 CTY Xây Dựng TT Huế 01/07/2008 29 Lê M Nam 80 Hải Lăng, Quảng Trị 09/07/2008 30 Dương Thị Kim C Nữ 39 220.Bạch Đằng, TP Huế 09/07/2008 31 Trần Văn V Nam 20 Phú Vang, TT Huế 23/07/2008 32 Trần Văn T Nam 25 A lưới, TT Huế 17/07/2008 33 Tôn Thất Q Nam 39 17A Ba Triệu, TP Huế 12/08/2008 34 Nguyễn Thị B Nữ 66 Q Thọ,Q Trạch, Quảng Bình 08/08/2008 35 Trần Văn H Nam 44 Phú Mậu, Phú Vang, TT Huế 22/08/2008 36 Trần Thị Thanh L Nữ 28 Thuận Thành, TP Huế 18/08/2008 37 Phan Văn H Nam 49 Quảng Trạch, Quảng Bình 18/08/2008 38 Nguyễn Xuân D Nam 29 KV 6, Kim Long, TP Huế 02/10/2008 39 Lê Văn H Nam 37 Quảng Trị 18/08/2008 40 Lê Thị Thu T Nữ 17 An Bằng, Phú Vang, TT Huế 26/08/2008 41 Hoàng Văn N Nam 62 47/7 Nhật Lệ, T.Thành, TP Huế 26/08/2008 42 Phan N Nam 78 Phú Vang, TT Huế 12/09/2008 43 Lê Quý H Nam 40 Hương Trà, TT Huế 24/09/2008 44 Phan Xuân N Nam 36 Quảng Bình 29/09/2008 45 Nguyễn Ngọc P Nam 56 Kim Long, TP Huế 10/09/2008 46 Nguyễn Thị T Nữ 54 132 Bùi Thị Xuân, TP Huế 08/09/2008 47 Trần Thị N Nữ 36 Vỹ Dạ, TP Huế 16/09/2008 48 Trần L Nam 86 TTrấn Thuận An, TT Huế 16/09/2008 49 Phan Thị X Nữ 44 Quảng Ngãi 12/09/2008 50 Hoàng Thị H Nữ 17 Hương Trà, TT Huế 19/09/2008 51 Huỳnh T Nam 32 Vinh Hải, Phú Lộc, TT Huế 30/09/2008 52 Trần Đức Đ Nam 65 Quảng Trạch, Quảng Bình 16/09/2008 53 Hồ Hữu T Nam 57 Lệ Thủy, Quảng Bình 30/09/2008 54 Bạch Thị M Nữ 77 P Xuân, Phú Vang, TT Huế 17/09/2008 TT Họ tên bệnh nhân Địa Ngày xét Giới Tuổi Nam 77 Phong Hiền, PĐiền, TT Huế 16/09/2008 nghiệm 55 Dương L 56 Nguyễn Thị H Nữ 35 P Hải, Phong Điền,TT Huế 26/09/2008 57 Dương Chí L Nam 20 Phú Vang, TT Huế 01/10/2008 58 Trần Bá T Nam 64 Q Phú, Hương Trà, TT Huế 21/10/2008 59 Đặng T Nam 28 Bình Sơn, Quảng Ngãi 01/10/2008 60 Hồ Đăng T Nam 61 Hương Thủy, TT Huế 30/09/2008 61 Nguyễn Thị Mỹ L Nữ 53 145/4 Đ.B.Phủ, TP Huế 18/08/2008 62 Lê Thanh T Nữ 85 H Sơ, Hương Trà, TT Huế 09/10/2008 63 Dương Thị L Nữ 20 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 07/10/2008 64 Nguyễn Thị L Nữ 57 Xuân 68, TP Huế 29/09/2008 65 Lê M Nam 37 H Vân, Hương Trà, TT Huế 01/10/2008 66 Nguyễn Thanh T Nam 83 T Dương, HThủy, TT Huế 16/10/2008 67 Nguyễn Thị T Nữ 64 Hương Thủy, TT Huế 14/10/2008 68 Hoàng Thị B Nữ 16 Gio Linh, Quảng Trị 16/10/2008 69 Lê Văn T Nam 62 Khu Định cư, KLong - TP Huế 21/10/2008 70 Võ Đại T Nam 56 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 10/11/2008 71 Võ Viết A Nam 55 Quảng Lợi, Q.Điền,TT Huế 07/11/2008 72 Nguyễn Văn S Nam 50 Lệ Thủy, Quảng Bình 07/11/2008 73 Trần Văn T Nam 47 Hương Thủy, TT Huế 12/11/2008 74 Phạm Thị T Nữ 56 H.Phú, Hải Lăng, Q.Trị 14/11/2008 75 Nguyễn Văn H Nam 57 Cam Tuyền, Cam Lộ, Quảng Trị 03/12/2008 76 Nguyễn Thanh Q Nam 39 Quảng Điền, TT Huế 01/12/2008 77 Nguyễn K Nam 64 Tư Nghĩa, Quảng Ngãi 28/11/2008 78 Dương Thanh H Nam 58 35/18 Ngự Bình, An Cựu, Huế 30/10/2008 79 Ngô Đức T Nam 72 Phú Vang, TT Huế 21/11/2008 80 Hồ Văn N Nam 38 Hương An, Hương Trà, TT Huế 20/11/2008 81 Võ Đại Q Nam 47 Lộc Sơn, Phú Lộc, TT Huế 26/11/2008 82 Lê Đắc D Nam 45 54/56 Hải Triều, An Cựu, Huế 28/11/2008 83 Trần Thị T Nữ 73 Khu Kiểm Huệ, TP Huế 05/12/2008 TT Họ tên bệnh nhân Địa Ngày xét Giới Tuổi Nam 30 Lộc Sơn, Lộc Bổn, TT Huế 05/12/2008 Nữ 37 1/26 Nguyễn Sinh Cung, Huế 05/12/2008 Nam 30 Hương Trà, TT Huế 05/12/2008 Nữ 23 Hương Văn, H Trà, TT Huế 10/12/2008 nghiệm 84 Lê Quang V 85 Lê Thị T 86 Lê Minh T 87 Nguyễn T Hồng P 88 Võ H Nam 58 Vinh Xuân, Phú Vang, TT Huế 17/12/2008 89 Phan Văn C Nam 34 K64 Nguyễn Công Trứ, TP Huế 23/12/2008 90 Trần Thị Q Nữ 60 Q Ngạn, Q Điền, TT Huế 15/12/2008 91 Trần Thế M Nam 58 Thuỷ Bằng, H.Thuỷ, TT Huế 10/12/2008 92 Hồ Văn C Nam 79 Phường Thuận Hoà, TP Huế 23/12/2008 93 Nguyễn Tâm C Nam 52 113/7 Điện Biên Phủ, TP Huế 13/11/2008 94 Lê Văn T Nam 23 T2 Đ Hải, Q Điền, TT Huế 18/11/2008 95 Hồ C Nam 52 Phú Hoà, TT Huế 11/11/2008 96 Nguyễn Thị L Nữ 79 Sơn Tịnh, Quảng Ngãi 20/11/2008 97 Đoàn Đ Nam 60 4/29 Đào D Anh, P.Bình, Huế 31/12/2008 98 Nguyễn Văn L Nam 45 Huyện Phú Lộc, TT Huế 23/12/2008 99 Trần T Nam 73 Huyện Phú Vang, TT Huế 30/12/2008 100 Lê Thị L Nữ 29 Phường Phú Hậu, TP Huế 09/01/2009 101 Trần Thị K Nữ 78 Bố Trạch, Quảng Bình 06/01/2009 102 Trần Đình T Nam 47 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 20/01/2009 103 Nguyễn Thị L Nữ 76 43/20 Lương Y, Th Lộc, Huế 03/02/2009 104 Phan Đình H Nam 76 Thuỷ An, Quảng Điền, TT Huế 05/02/2009 105 Đỗ S Nam 70 Huyện Núi Thành, Quảng Nam 04/02/2009 106 Nguyễn Duy X Nam 69 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 12/02/2009 107 Lê Văn T Nam 79 Hương Hồ, H Trà, TT Huế 16/02/2009 108 Trần Xuân S Nam 52 Tổ 11, F Phú Bình, TP Huế 02/02/2009 109 Trần Văn T Nam 41 Xã Hương Xuân, H trà, TT Huế 20/02/2009 Họ tên bệnh nhân Tuổi 110 Trần Hoài N Nam 33 76 Lê Ngô Cát, Huế 17/02/2009 111 Huỳnh Văn P Nam 42 120 Lê Duẩn, Huế 25/02/2009 Nữ 60 Phường An Cựu, Huế 16/02/2009 113 Lê Văn Đ Nam 57 H.Thượng, Hải Lăng, Quảng Trị 05/03/2009 114 Trần Trọng T Nam 36 Phú Dương, Phú Vang, TT Huế 10/03/2009 115 Lê Hữu U Nam 62 Bố Trạch, Quảng Bình 17/03/2009 116 Hồ Thị K Nữ 26 T Long, Nam Đông, TT Huế 23/02/2009 117 Nguyễn Thị N Nữ 36 Huyện Phú Lộc, TT Huế 25/03/2009 118 Lê Thị Hoàng A Nữ 16 Thị Xã Quảng Trị 13/03/2009 119 Hoàng Thị D Nữ 65 Quảng Bình 18/03/2009 120 Lê Ngọc H Nữ 25 Xuân Ninh,Q Ninh,Quảng Bình 25/03/2009 121 Trinh Đình M Nam 22 Phong Điền, TT Huế 18/03/2009 122 Hà Văn L Nam 37 Kiệt 47 T.Gióng, Tây Lộc, Huế 20/03/2009 123 Đỗ Thị K Nữ 54 Phong Điền, TT Huế 03/04/2009 Nam 44 Quảng Trạch, Quảng Bình 27/03/2009 125 Phạm Thị M Nữ 34 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 03/04/2009 126 Nguyễn Thị N Nữ 60 Phong Điền - TT Huế 14/03/2009 127 Lê Văn T Nam 36 Phú Nhuận, TP Huế 15/04/2009 128 Nam 32 Phú Hoà, TP Huế 17/04/2009 Nữ 60 Tuyên Hoá, Quảng Bình 16/04/2009 130 Phạm Văn L Nam 46 Phú Vang, TT Huế 14/04/2009 131 Lê Quang B Nam 27 Phú Vang, TT Huế 24/04/2009 132 Lê Thị T Nữ 32 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 08/04/2009 133 Nguyễn Thị Thuý H Nữ 34 Tứ Hạ, Hương Trà, TT Huế 29/04/2009 134 Đặng T Thanh N Nữ 26 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 21/04/2009 112 Châu Thị C 124 Nguyễn Văn T Hoàng H 129 Trần Thị T Địa Ngày xét Giới TT nghiệm Họ tên bệnh nhân Tuổi 135 Lê Minh N Nam 65 Phước Vĩnh, TP Huế 08/05/2009 136 Lương Minh H Nam 24 Trại giam Bình Điền, TT Huế 07/05/2009 Nữ 26 TP Quảng Ngãi 29/04/2009 Nam 64 Phú Dương, Phú Vang, TT Huế 28/04/2009 139 Võ Thị S Nữ 27 Phú Vang, TT Huế 28/04/2009 140 Phạm Thị T Nữ 28 Phú Vang, TT Huế 28/04/2009 141 Phạm C Nam 70 Lộc Bổn, Phú Lộc, TT Huế 28/04/2009 142 Lê D Nam 40 Tp Quảng Trị 05/06/2009 143 Phan K Nam 70 H.Thuỷ, Phú Vang, TT Huế 22/06/2009 144 Hồ Văn H Nam 45 14/ Phan Đình Phùng, TP Huế 19/05/2009 Nữ 22 P.Phú Hiệp, TP Huế 14/05/2009 146 Hà Thúc L Nam 19 Hương Trà, TT Huế 12/06/2009 147 Phạm Thị L Nữ 73 Phú Vang, TT Huế 04/06/2009 148 Vương Hưng S Nam 27 Hương Trà, TT Huế 09/06/2009 149 Phùng Hữu C Nam 56 Hương Trà, TT Huế 05/06/2009 150 Nguyễn Văn L Nam 58 Quảng Trạch, Quảng Bình 27/05/2009 151 Phạm Văn P Nam 23 Quảng Trạch, Quảng Bình 12/06/2009 152 Nguyễn M Nam 71 Phú Vang, TT Huế 25/06/2009 153 Lê Thị Ngọc L Nữ 35 Hương Trà, TT Huế 02/07/2009 154 Trần Thị Kim A Nữ 25 Hướng Hoá, Quảng Trị 12/06/2009 155 Lê Thị Tú T Nữ 38 TP Quảng Trị 18/06/2009 156 Đào Thị Y Nữ 20 Phú Mỹ, Phú Vang, TT Huế 30/06/2009 157 Nguyễn Văn C Nam 54 Thuỷ Xuân, TP Huế 01/07/2009 158 Lê Văn H Nam 63 A Lưới, TT Huế 08/07/2009 159 Nguyễn Văn M Nam 69 Phường Vĩnh Ninh-TP Huế 19/06/2009 137 Huỳnh Đỗ Tường V 138 Phan T 145 Phan T Hồng H Địa Ngày xét Giới TT nghiệm Họ tên bệnh nhân Tuổi Nam 55 Phú Vang, TT Huế 07/05/2009 161 Hà Thị Diệu N Nữ 44 Phú Hậu, Phú Vang, TT Huế 30/06/2009 162 Ng Lương Hạ H Nữ 23 Phú Lộc, TT Huế 07/07/2009 163 Lê Anh Đ Nam 35 Phú Lộc, TT Huế 07/07/2009 164 Nguyễn Ích T Nam 35 Hương Trà, TT Huế 30/07/2009 165 Trương Thị D Nữ 48 Hương Trà, TT Huế 07/07/2009 166 Đỗ L Nam 47 Phú Quốc, Kiên Giang 30/07/2009 167 Nguyễn Văn T Nam 34 TP Quảng Trị 09/07/2009 168 Nguyễn Xuân H Nam 41 Kim Long, TP Huế 09/07/2009 169 Dương Đình M Nam 56 Lộc Sơn, Phú Lộc, TT Huế 21/07/2009 170 Nguyễn Đại T Nam 36 K36 Nguyễn Công Trứ, TP Huế 30/07/2009 Nữ 29 Phú Lộc, TT Huế 17/08/2009 172 Cao Văn G Nam 26 Quảng Ninh, Quảng Bình 31/07/2009 173 Lê P Nam 41 K.Sanh, Hướng Hoá,Quảng Trị 04/08/2009 Nữ 52 TP Quảng Trị 20/08/2009 175 Hồ Thanh S Nam 60 Phú Vang, TT Huế 12/08/2009 176 Văn Trọng Đ Nam 47 Phong Điền, TT Huế 30/07/2009 177 Nguyễn Thanh H Nam 29 Phú Vang, TT Huế 13/08/2009 178 Phạm D Nam 72 Phú Vang, TT Huế 12/08/2009 179 Cao Viết N Nam 24 Hương Trà, TT Huế 12/08/2009 180 Lê Tiến A Nam 52 Quảng Trạch, Quảng Bình 20/08/2009 181 Võ Xuân T Nam 30 P Phú Hội, TP Huế 14/08/2009 182 Trần Viết T Nam 26 A Lưới, TT Huế 21/08/2009 183 Trương Viết T Nam 64 Phú Vang, TT Huế 13/08/2009 184 Huỳnh Thị Đ Nữ 52 Phú Vang, TT Huế 26/08/2009 160 Lê Tương Viết T 171 Võ Thị H 174 Võ Thị L Địa Ngày xét Giới TT nghiệm Họ tên bệnh nhân Tuổi Nam 35 P Phú Hội, TP Huế 17/08/2009 Nữ 24 H.Văn, Hương Trà, TT Huế 10/09/2009 187 Đỗ Kỳ P Nam 36 Phú Vang, TT Huế 19/08/2009 188 Nguyễn Đăng D Nam 40 Hương An, Hương Trà, TT Huế 25/08/2009 189 Trương Q Nam 78 Huyện Phú Lộc, TT Huế 09/09/2009 190 Nguyễn Đắc Anh M Nam 32 Phường An Cựu, TP Huế 03/09/2009 191 Trần Hồng T Nam 47 Huyện Phú Lộc, TT Huế 09/08/2009 Nữ 15 Huyện Phú Vang, TT Huế 19/08/2009 Nam 15M Quảng Bình 04/09/2009 Nữ 55 Phường Thuận Lộc, TP Huế 20/08/2009 195 Ngô C Nam 39 Lộc Thủy, Phú Lộc, TT Huế 04/09/2009 196 Nguyễn Tấn S Nam 45 Thủy Dương, H Thủy, TT Huế 15/09/2009 197 Huỳnh Kim T Nam 41 Phường Phú Hậu, TP Huế 16/09/2009 198 Lê Văn Q Nam 51 Quảng Bình 16/09/2009 199 Nguyễn Văn T Nam 26 F Tây Lộc, TP Huế 08/09/2009 200 Lữ Thị Mỹ T Nữ 17 Huyện Phú Vang, TT Huế 09/09/2009 201 Nguyễn Thị M Nữ 26 Huyện Phú Vang, TT Huế 23/09/2009 202 Trần Thị Thu K Nữ 49 Huyện Phú Vang, TT Huế 18/09/2009 203 Trần Bá C Nam 24 Thủy Dương, H Thủy, TT Huế 09/09/2009 204 Trương Viết H Nam 55 Huyện Phú Vang, TT Huế 16/09/2009 205 Nguyễn Hữu H Nam 30 Huyện Phú Vang, TT Huế 21/09/2009 206 Trần Viết L Nam 73 Huyện Phú Vang, TT Huế 16/10/2009 207 Trần Văn C Nam 51 Phong Điền, TT Huế 14/10/2009 208 Võ Thị H Nữ 25 Phú Lộc, TT Huế 20/10/2009 209 Lê Thị A Nữ 22 Phú Lộc, TT Huế 20/10/2009 185 Nguyễn Văn T 186 Phạm Thị Hiền N 192 Nguyễn Thị Thu H 193 Nguyễn Ngọc T 194 Nguyễn Thị L Địa Ngày xét Giới TT nghiệm Họ tên bệnh nhân Tuổi Nam 63 An Hoà, TP Huế 15/10/2009 211 Lê T Thuỷ X Nữ 28 Phú Lộc, TT Huế 13/10/2009 212 Trần Văn T Nam 30 Huyện Phú Vang, TT Huế 22/10/2009 213 Lê Văn T Nam 69 Quảng Trạch, Quảng Bình 13/10/2009 Nữ 49 19/125 An Dương Vương, Huế 01/10/2009 210 Nguyễn S 214 Nguyễn Thị H Xác nhận khoa Vi sinh Địa Ngày xét Giới TT nghiệm Xác nhận Bệnh viện Trung ương Huế [...]... tài nghiên cứu: Sự đột biến kháng Rifampicin và Isoniazid của Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Bệnh viện Trung ương Huế để thực hiện các mục tiêu cụ thể sau đây: 1 Xác định tỷ lệ đề kháng các thuốc kháng lao dòng thứ nhất (Rifampicin, Isoniazid, Streptomycin và Ethambutol) của các chủng M tuberculosis phân lập được tại Bệnh viện Trung ương Huế bẳng phương pháp nuôi cấy và kháng sinh đồ kinh... lực với kháng sinh nên bỏ qua tác động của kháng sinh - Tạo ra enzym: Các enzym do gen đề kháng tạo ra có thể biến đổi hoặc phá huỷ cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh Một số gen kháng thuốc: - Vi khuẩn kháng Rifampicin đột biến ở gen rpo B mã hoá tổng hợp ARN polymerase - Vi khuẩn kháng Isoniazid đột biến ở gen kat G, inh A, ahp C… - Vi khuẩn kháng Streptomycin và các Aminoglycosid: đột biến ở... , ’ và ) Các tiểu đơn vị này được mã hóa bởi các gen rpoA, rpoB, rpoC và rpoD RIF gắn lên tiểu đơn vị  của ARN polymerase, ức chế quá trình phiên mã và bằng cách này RIF giết chết vi khuẩn Nhiều nghiên cứu về gen rpoB ở các chủng M tuberculosis kháng RIF xác định rằng có nhiều đột biến khác nhau và đột biến khuyết trên gen này Tổng cộng có 69 đột biến đơn; 3 đột biến chèn; 16 đột biến khuyết và 38... RFLP) Sự kiện và tính lan truyền của đột biến này trong các chủng M tuberculosis lâm sàng kháng INH thay đổi đáng kể phụ thuộc vào vùng địa lý và thành phần dân 23 tộc của những cá nhân bị nhiễm Do đó sàng lọc sự thay đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh cho việc phát hiện các chủng lao M tuberculosis kháng Isoniazid, cung cấp tính lan rộng cao của đột biến. .. được thiết lập từ một vùng địa lý xác định Đột biến thay thế S315T trên gen katG cũng thường đi kèm với biểu hiện của protein alkyl hydroperoxide reductase (ahpC) Sự biến đổi của 5 nucleotide khác đã được xác định ở vùng promoter của gen ahpC, dẫn tới biểu hiện quá mức của ahpC và đề kháng INH Đột biến xảy ra trên gen inhA sẽ dẫn tới kháng ngay từ đầu với INH và ethionamide (ETH) Sáu vị trí đột biến trong... điểm chính để phát hiện kháng thuốc RIF là sự đột biến trên đoạn gen rpoB trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao Bằng phát hiện kháng RIF cũng có thể xác định được tính kháng đa thuốc bởi vì các chủng kháng RIF phần lớn là đa kháng thuốc Đối với INH, sự kháng thuốc thường được gây ra bởi đa dạng đột biến trong 4 gen (katG, inhA, kasA và ahpC), trong đó phần lớn (60-70%) các đột biến nằm trên gen katG... polymerase Một vài nghiên cứu đã ghi nhận một số đột biến ở ngoài vùng này ở các chủng MTB kháng Rifampicin Đột biến A191C ở chủng Rv2629 đã được mô tả lần đầu tiên bởi Wang và cộng sự 47, 71, 90, 103, 132 1.3.2.3 Cơ chế kháng thuốc Isoniazid Isoniazid là một trong những thuốc đầu tiên được chọn trong điều trị lao Thuốc đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại Mycobacterium tuberculosis và các Mycobacterium. .. trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này và đã có nhiều kết quả có giá trị Việc tìm hiểu để có thể áp dụng, phát triển được những kỹ thuật này ở Huế, nhất là kỹ thuật giải trình tự (sequencing) sẽ giúp xác định nhanh và chính xác vi khuẩn lao kháng RIF và INH, đồng thời xác định được đặc điểm đột biến kháng RIF và INH của các chủng M tuberculosis phân lập được tại Huế, từ đó tiếp tục phát triển các nghiên... synthase và ahpC mã hoá cho alkylhydroperoxide reductase Mặc dù thế, gần 5-10% các chủng M tuberculosis kháng INH không có một đột biến có thể xác định Một tỷ lệ ít hơn các chủng kháng INH liên quan đến đột biến gen furA, iniA, iniB và iniC Tính kháng INH ở mức cao có liên quan đến lâm sàng chủ yếu là do các đột biến thêm đoạn/ mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/ vô nghĩa bên trong gen katG Đối với sự. .. trúc của gen inhA liên quan đến kháng INH đã được xác định là Ile16Thr, Ile21Thr, Ile21Val, Ile47Thr, Val78Ala và Ile95Pro Tuy nhiên các đột biến này ít gặp Các nghiên cứu cũng cho thấy khoảng 70-80% các chủng kháng INH có sự đột biến ở gen katG và inhA Đột biến xảy ra trên gen kasA dẫn tới sự đề kháng yếu với INH, mà thường gặp ở các vị trí codon 66 (GAT-AAT), codon 269 (GGT-AGT), codon 312 (GGCAGC) và