Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu kết quả tinh chế các nơ-rô-tốc-xin 5,7,9,13 và 19 bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp trực tiếp từ nọc thô, không qua bước lọc gel và bước đầu xác định cấu trúc bậc 1.
28(2): 44-49 Tạp chí Sinh học 6-2006 Tách, làm bớc đầu xác định cấu trúc số Tốc-xin từ nọc bò cạp Việt Nam Lychas mucronatus Hoàng Ngọc Anh Viện Hóa học Đặng Trần Hoàng, Trơng Nam Hải Viện Công nghệ sinh học Fournier A National Institute of scientific Research Pointe-Claire, Canada ë ViÖt Nam, cã mét số loài bọ cạp thuộc họ Buthudae, Scorpionidae Chaerilidae [1-5] Những nghiên cứu cho thấy hai tỉnh Bình Phớc Bình Dơng có loài bò cạp Lychas mucronatus v Heterometrus petersii petersii Khi nghiên cứu nọc bò cạp loài L mucronatus, xác định đợc có hai nhóm tốc-xin với khối lợng phân tử 35005000 6000-8000 Da [6] Từ nọc bò cạp này, tách làm bảy tốc-xin ngắn (Mr = 3500-5000 Da); tốc-xin có tác dụng ức chế dây thần kinh bị kích thích Trong số tốc-xin đó, xác định đợc cấu trúc bậc cđa tèc-xin 14 [7], víi tr×nh tù nh− sau: VSIGIKCDPSIDLCEGQCRIRYFTGYCSGDTC HCS Trong nghiên cứu này, trình bày kết tinh chế nơ-rô-tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 phơng pháp sắc ký lỏng cao áp trực tiÕp tõ näc th«, kh«ng qua b−íc läc qua gel bớc đầu xác định cấu trúc bậc chúng I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Bò cạp nâu (L mucronatus) đợc thu thập tỉnh Bình Phớc, tháng 5-6 hai năm 2003 2004 Bò cạp đợc nuôi chậu nhựa có phủ cỏ, khô; thức ăn chúng côn trùng Nọc bò cạp đợc thu xung điện, đem làm khô CaCl2 khan giữ nhiệt độ -20oC dùng Để tách chiết làm tốc-xin, sử dụng hóa chất hãng Merck 44 Phơng pháp - Tách, làm xác định trình tự axit amin tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 Sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) đợc tiến hành máy phân tích Beckman system gold máy điều chÕ Flonged MOD col (Mü) víi cét Phenomenex Jupiter (250 ì 35 mm, 15 àm, 300 A) C18; tốc độ rửa cột 20 ml/phút Cột sắc ký đợc rửa gradient tuyến tính dung dịch sau: A 0,06% TFA n−íc vµ B lµ 0,06% TFA 55% axêtonitrin nớc Chơng trình rửa cột: 050% B thời gian 90 phút sau 50100% B thêi gian 90 Ho¹t tÝnh sinh häc cđa phân đoạn tốcxin tách đợc thử lên động mạch giống chuột bạch C57BL/6 máy xác định mức độ co Động mạch chuột đợc ngâm dung dÞch sinh lý: g (10 mM) dextroza, 4,2 g (25 mM) NaHCO3, 13,8 g (120 mM) NaCl, 10 ml (4,7 mM) KCL, 10 ml (1,2 mM) K2PO4, 10 ml (2,4 mM) MgSO4, ml (2,5 mM) CaCl2, 2000 ml n−íc lµ thĨ tÝch ci cïng cđa dung dịch sinh lý Khối lợng phân tử tốc-xin đợc xác định máy Mass-spectrum Voyager (Mỹ) Để xác định số lợng gốc xystein phân tử, protein đợc khử hóa an-kin hóa theo quy trình sau: protein (30 àg) đợc hòa ml ®Öm 0,6 M Tris-HCl pH = 8,6 cã chøa M guanidin hydroclorit Thêm vào dung dịch 30 àl -mercaptoetanon giữ khí acgon nhiệt độ phòng Sau đó, thêm vào 0,3 ml 500 mM iodoaxêtat, quấy giữ tối nhiệt ®é 37oC giê ®Ó ankin hãa protein ®· khử Quá trình làm muối protein S-an-kin hóa đợc tiến hành sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cột C8 II Kết thảo luận Thu mẫu lấy nọc loài bò cạp nâu L mucronatus Bò cạp phân bố nhiều miỊn Nam n−íc ta, ®ã chđ u ë vïng Đông Nam tỉnh Đắc Nông Việc bắt bò cạp thờng đợc tiến hành vào đầu mùa ma (từ tháng đến đầu tháng 7); mùa sinh sản chúng Đầu mùa ma năm 2003, tiến hành bắt bò cạp nâu miền Nam mang Hà Nội nuôi lấy nọc; khí hậu khác nên bò cạp chết nhanh, mùa đó, từ 1300 bò cạp lấy đợc 450 mg nọc, mà nọc không đợc tốt (lợng cặn không tan nớc chiếm 10%) việc tách tốc-xin gặp nhiều khó khăn Do kết nh nên mùa ma năm 2004, định bắt lợng bò cạp nhiều lên lấy nọc chỗ để tăng số lơng nọc thu đợc Chúng tiến hành khảo sát bò cạp tỉnh Đắc Nông, Tây Ninh, Bà RịaVũng Tàu Bình Phớc Kết cho thấy tỉnh Đắc Nông, có nhiều bò cạp đen H petersii petersii (hình 2), vùng Đông Nam có nhiều bò cạp nâu L mucronatus (hình 1) Hình Bò cạp nâu L mucronatus Trong loài bò cạp này, quan tâm đến nọc bò cạp nâu dựa vào kết khảo sát này, tổ chức bắt đợc khoảng 4000 bò cạp nâu tỉnh Bình Phớc, nuôi lấy nọc bò cạp thành phố Hồ Chí Minh Việc nuôi bò cạp thành phố Hồ Chí Minh phù hợp với khí hậu nên bò cạp sống phát triển tốt, giúp cho việc thu đợc lợng nọc cần thiết Sau tháng nuôi lấy nọc, thu đợc 1000 mg nọc khô với chất lợng tốt Hình Bò cạp đen H petersii petersii Tách, làm khảo sát đặc tính tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 Trong nghiên cứu này, trình bày phơng pháp tách, làm tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 nọc bò cạp nâu trực tiếp từ nọc thô sắc ký lỏng cao áp, sau dùng khối phổ để định hớng tách tốc-xin quan tâm Trớc đây, tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 đợc tách từ đỉnh (sau lọc qua gel), khảo sát hoạt tính lên dây thần kinh ếch xác định khối lợng phân tử chúng tơng ứng lµ: 4316 Da, 4054 Da, 4948 Da, 4133 Da vµ 3958 Da [6], nhng trình tự axit amin cha đợc xác định Trong nghiên cứu này, dựa vào khối lợng phân tử tốc-xin biết, tiến hành tách tốc-xin từ nọc thô phơng pháp sắc ký lỏng cao áp sử dụng khối phổ để định hớng phân đoạn cần làm sạch; phơng pháp làm tăng hiệu tách tốc-xin lên 45 Sử dụng 600 mg, số 1000 mg nọc bò cạp thô thu đợc vào tháng 5-6 năm 2004, phơng pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) cột C18, tách loạt protein đợc trình bày hình Hình Sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) nọc thô bò cạp nâu L mucronatus cột C18 Các tốc-xin quan tâm nằm vùng đợc đánh giấu mũi tên Đo khối phổ phân đoạn tách cho thấy tốc-xin mà quan tâm nằm vùng đợc đánh dấu mũi tên sắc ký đồ (hình 3) Khảo sát tác dụng phân đoạn lên động mạch cổ chuột cho thấy chúng làm co động mạch chuột; điều nói lên tốc-xin tác dụng lên kênh thần kinh chúng nơ-rô-tốc-xin, phù hợp với nghiên cứu trớc tốc-xin Để thu đợc tốc-xin sạch, phân đoạn tách đợc đem đông khô chạy lại sắc ký lỏng cao áp cột C18 phân tích điều chế, tùy thuộc vào lợng phân đoạn thu đợc Sau vài lần chạy sắc ký lỏng cao áp kết hợp với khối phổ để định hớng, tốc-xin đợc tách xác định khối lợng phân tử nh trình bày hình 4-8 4326 Hình Sắc ký đồ HPLC khối phổ tốc-xin (Mr = 4326) 4060 Hình Sắc ký đồ HPLC khèi phỉ cđa tèc-xin (Mr = 4060) 46 4914 Hình Sắc ký đồ HPLC khối phổ tốc-xin (Mr = 4914) 4138 Hình Sắc ký ®å HPLC vµ khèi phỉ cđa tèc-xin13 (Mr= 4138) 3965 Hình Sắc ký đồ HPLC khối phổ tốc-xin 19 (Mr = 3965) Việc so sánh khối lợng phân tử tốc-xin đợc tách với khối lơng phân tử tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 đợc tách trớc cho thấy chóng lµ mét Nh− vËy, bá qua b−íc läc qua gel, kết hợp hai phơng pháp sắc ký lỏng cao áp khối phổ, từ 600 mg nọc thô, tách, làm khảo sát đặc tính tốc-xin Bằng cách này, nâng cao hiệu tinh tốc-xin nọc bò cạp; trớc đây, để thực công việc này, phải sử dụng 2000 mg nọc thô [6] 47 Xác định có mặt cầu đisunphít phân tử tốc-xin tách Để xác định cấu trúc bậc tốcxin nhận đợc, phải tiến hành khử hóa an-kin hóa chúng để giải phóng cầu đisunphít Vì vậy, tiến hành khử hóa an-kin hóa tốc-xin nh mô tả phần phơng pháp kết đợc trình bày phần báo Đây bớc đầu việc xác định cấu trúc chúng Kết khử an-kin hóa c¸c tèc-xin cho thÊy : - Tèc-xin cã khèi lợng phân tử 4326 Da; sau khử hóa an-kin hóa, có khối lợng phân tử 4684 Da, tăng lên 356 Da, tơng đơng với nhóm C2H4NO (Mr = 58 Da; 356 : 58 = 6,14) gắn vào gốc xystein Nh vậy, phân tử tốc-xin có gốc xystein tạo thành cầu đisunphít - Tốc-xin có khối lợng phân tử 4058 Da; sau khử hóa an-kin hóa, có khối lợng phân tử 4423 Da, tăng lên 351 Da, tơng đơng với nhãm C2H4NO (Mr = 58 Da; 351 : 58 = 6,05) gắn vào gốc xystein Nh vậy, ph©n tư cđa tèc-xin cã gèc xystein tạo thành cầu đisunphít - Tốc-xin có khối lợng phân tử 4916 Da; sau khử hóa an-kin hóa, có khối lợng phân tử 5330 Da, tăng lên 413 Da, tơng đơng với nhóm C2H4NO (Mr = 58 Da; 413 : 58 = 7,1) gắn vào gốc xystein Nh vậy, phân tử tốc-xin có gốc xystein nhng tạo thành cầu đisunphít - Tốc-xin 13 có khối lợng phân tử 4138 Da; sau khử hóa an-kin hóa, có khối lợng phân tử 4490 Da, tăng lên 356 Da, tơng đơng víi nhãm C2H4NO (Mr = 58 Da; 356 : 58 = 6,14) gắn vào gốc xystein Nh vËy, ph©n tư cđa tèc-xin 13 cã gèc xystein tạo thành cầu đisunphít - Tốc-xin 19 có khối lợng phân tử 3965 Da; sau khử hóa an-kin hóa, có khối lợng phân tử 4314 Da, tăng lên 348 Da, tơng đơng 48 với nhóm C2H4NO (Mr = 58 Da; 348 : 58 = 6) gắn vào gốc xystein Nh vậy, qua khử hóa an-kin hóa, xác định đợc phân tử tốc-xin 19 có xystein tạo thành cầu đisunphít Nh vậy, việc khử hóa an-kin hóa cho thấy phân tử tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 có cầu đisunphít, giống nh cấu trúc nơ-rô-tốc-xin ngắn nọc bò cạp III KÕt ln Sư dơng 600 mg, 1000 mg nọc thu đợc loài bò cạp nâu Lychas mucronatus, phơng pháp sắc ký lỏng cao áp phối hợp với khối phổ vào khối lợng phân tử biết tốc-xin, tách làm tốc-xin 5, 7, 9, 13 19 từ nọc thô loi bò cạp Kết qủa khử hóa an-kin hóa tốcxin cho thấy, phân tử chúng, có cầu đisunphít; tính chất đặc trng cho tính chất cấu trúc nơ-rô-tốc-xin nọc bò cạp Tài liệu tham khảo Lourenco W R., 1994: Biogeographica, 70: 155-160 M’Barek S et al., 2003: J Biol Chem., 278: 31095-31104 Possani L D et al., 1999: Eur J Biochem., 264: 287-300 Gordon D et al., 2003: Eur J Biochem., 270: 2663-2670 Debin J A et al., 1993: Am J Physiol., 264 (Cell Physiol.33), C361-C369 Hoang N A et al., 2001: Bulletin Experimental Biology and Medicine, 132: 398400 Hoang N A et al., 2003: Applied Biochemistry and Microbiology, 39: 122-126 Isolation, purification and preliminary structural determination of the toxins from scorpion Lychas mucronatus Hoang Ngoc Anh, Dang Tran Hoang, Truong Nam Hai, Fournier A Summary Our study has showed that the scorpion species H petersii petersii was abundant in the Dacnong province, but the scorpion one L mucronatus many distributed in the Tayninh, Binhphuoc and Baria-Vungtau provinces Five neurotoxins were isolated, purified and identified from the venom of L mucronatus by using the RP-HPLC on C18 column and Mass-Spectrum These isolated toxins had molecular masses as: 4326 Da, 4060 Da, 4914 Da, 4138 Da and 3965 Da respectively, that were similar to the molecular masses of the known toxins 5, 7, 9, 13 and 19 [6] The structural determination of these toxins showed that in their molecules, there were three disulfide bridges what were typical for the short scorpion neurotoxins Ngµy nhËn bµi: 4-2-2005 49 ... Thu mẫu lấy nọc loài bò cạp nâu L mucronatus Bò cạp phân bố nhiều miền Nam nớc ta, chủ yếu vùng Đông Nam tỉnh Đắc Nông Việc bắt bò cạp thờng đợc tiến hành vào đầu mùa ma (từ tháng đến đầu tháng... nhiều bò cạp đen H petersii petersii (hình 2), vùng Đông Nam có nhiều bò cạp nâu L mucronatus (hình 1) Hình Bò cạp nâu L mucronatus Trong loài bò cạp này, quan tâm đến nọc bò cạp nâu dựa vào kết... sinh sản chúng Đầu mùa ma năm 2003, tiến hành bắt bò cạp nâu miền Nam mang Hà Nội nuôi lấy nọc; khí hậu khác nên bò cạp chết nhanh, mùa đó, từ 1300 bò cạp lấy đợc 450 mg nọc, mà nọc không đợc