Xây dựng tiêu chuẩn cơ sơ kiểm nghiệm nicotin trong viên nén nhai hỗ trợ cai thuốc lá

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SƠ KIỂM NGHIỆM NICOTIN TRONG VIÊN NÉN NHAI HỖ TRỢ CAI THUỐC LÁ Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Ngọc Tú TP Hồ Chí Minh, 14 tháng năm 2018 MỤC LỤC Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chương ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp định tính nicotin sắc ký lớp mỏng 2.2.2 Phương pháp định lượng nicotin sắc ký hiệu cao 2.2.3 Áp dụng quy trình cho chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin thị trường 2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm viên nén nhai nicotin chứa dược chất nicotin polacrilex Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp định tính nicotin SKLM 3.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng nicotin HPLC 3.2.1 Sơ khảo sát quy trình 3.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng 3.2.4 Tóm tắt điều kiện để khảo sát quy trình định lượng 11 3.2.5 Thẩm định quy trình định lượng nicotin HPLC 13 3.3 Áp dụng quy trình cho số chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin thị trường 27 3.4 Dự thảo tiêu chuẩn sở để kiểm tra chất lượng “Viên nén nhai nicotin polacrilex” 28 3.4.1 Yêu cầu kỹ thuật 28 3.4.2 Phương pháp thử 29 KẾT LUẬN 32 KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT DĐVN DMPM GC HPLC Dược điển Việt Nam Dung môi pha mẫu Gas Chromatography (Sắc ký khí) High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) International Conference on Harmonisation Mass Spectrometry (Khối phổ) Reverse Phase (Pha đảo) Sắc ký lớp mỏng Ultraviolet – Visable U.S Public Health Service Home United States Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) ICH MS RP SKLM UV – Vis U.S PHSH USP DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết khảo sát dung môi rã tá dược gum Bảng 3.2 Kiểm tra hiệu suất chiết nicotin Bảng 3.3 Giá trị thông số pic nicotin khảo sát pH 10 Bảng 3.4 Thông số sắc ký khảo sát tỉ lệ pha động 11 Bảng 3.5 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống quy trình định lượng nicotin 13 Bảng 3.6 Cách pha dung dịch thẩm định tính tuyến tính 17 Bảng 3.7 Số liệu thẩm định tính tuyến tính quy trình định lượng nicotin 17 Bảng 3.8 Số liệu thống kê tính tuyến tính quy trình 19 Bảng 3.9 Kết thẩm định độ quy trình định lượng nicotin .20 Bảng 3.10 Kết thẩm định độ lặp lại – mẫu chuẩn nicotin ditartrat .23 Bảng 3.11 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng nicotin 24 Bảng 3.12 Kết thẩm định độ xác trung gian – mẫu chuẩn nicotin ditartrat 25 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng nicotin 26 Bảng 3.14 Thống kê kết kiểm nghiệm viên 26 Bảng 3.15 Kết lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ứng dụng quy trình 27 Bảng 3.16 Kết áp dụng quy trình định lượng cho viên nén nhai Ohno 28 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1.SKĐ định tính nicotin chế phẩm Hình 3.2 SKĐ nicotin sơ khảo sát quy trình Hình 3.3 Phổ UV dung dịch nicotin đối chiếu Hình 3.4 SKĐ nicotin đệm pH 5,0 Hình 3.5 SKĐ nicotin đệm pH 5,5 Hình 3.6 SKĐ nicotin đệm pH 6,0 Hình 3.7 SKĐ tỉ lệ pha động MeOH – đệm = 15:85, (a) pH 2,55; (b) pH 2,40 10 Hình 3.8 SKĐ tỉ lệ pha động MeOH – đệm = 10:90, (a) pH 2,55; (b) pH 2,40 10 Hình 3.9 SKĐ tỉ lệ pha động MeOH – đệm = 10:90, (a) pH 2,55; (b) pH 2,40 11 Hình 3.10 Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng nicotin – (a) mẫu trắng, (b) mẫu giả dược, (c) mẫu chuẩn, (d) mẫu thử, (e) so sánh SKĐ 14 Hình 3.11 Kết tinh khiết pic nicotin mẫu chuẩn 15 Hình 3.12 Kết tinh khiết pic nicotin mẫu thử 16 Hình 3.13 Biểu đồ thể tính tuyến tính quy trình phân tích .18 Thuốc nguyên nhân gây gánh nặng tử vong bệnh tật lớn thứ Việt Nam Bệnh tật tử vong liên quan đến thuốc xảy nhiều năm sau hút thuốc Việt Nam chịu gánh nặng khổng lồ sức khỏe kinh tế thuốc gây Các biện pháp dùng thuốc tổ chức y tế giới khuyến cáo sử dụng gồm có ba biện pháp: nicotin thay (miếng dán, viên nhai, ống hít); bupropion hydrochloride (viên uống), varenicilline Trong đó, nicotin sử dụng phổ biến Ở Việt Nam, số lượng chế phẩm chứa nicotin hỗ trợ cai thuốc chưa nhiều Hơn nữa, DĐVN chưa có chuyên luận nicotin, nguyên liệu lẫn thành phẩm Do đó, việc xây dựng quy trình định lượng nicotin chế phẩm viên nén nhai cần thiết Với lý nêu trên, đề tài “Xây dựng Tiêu chuẩn sở kiểm nghiệm nicotin viên nén nhai hỗ trợ cai thuốc lá” thực với mục tiêu cụ thể sau : * Xây dựng phương pháp định tính nicotin sắc ký lớp mỏng * Xây dựng thẩm định quy trình định lượng nicotin sắc ký hiệu cao * Áp dụng quy trình cho chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin thị trường * Dự thảo tiêu chuẩn sở để kiểm tra chất lượng “Viên nén nhai nicotin” CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG Viên nén nhai thử nghiệm nicotin mg công ty TNHH Hasan Dermapharm sản xuất, số lô NC 00716HS 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp định tính nicotin sắc ký lớp mỏng - Ngun tắc: Chọn dung mơi để hịa tan hoàn toàn chế phẩm Sử dụng acid để chuyển nicotin dạng muối tan nước Kiềm hóa dung dịch để đưa nicotin dạng base lắc với dung môi hữu Chấm sắc ký song song mẫu chuẩn, thử placebo - Yêu cầu: + Mẫu placebo: Khơng có vết trùng với vết mẫu đối chiếu + Vị trí vết nicotin mẫu đối chiếu mẫu thử phải tương đương - Tiến hành: Theo dược điển USP 36 + Mẫu đối chiếu: Cân lượng chuẩn tương ứng mg nicotin cho vào ống ly tâm Thêm mL cloroform siêu âm 30 phút Tiến hành ly tâm mẫu điều kiện 3000 vòng/phút phút Lấy lớp dung dịch trên, làm nguội nhiệt độ thường phút Thêm mL dung dịch acid hydrocloric 0,5 N Lắc tiến hành ly tâm điều kiện Lấy lớp chuyển vào bình lắng điều chỉnh đến pH 10 dung dịch natri hydroxyd N (dùng giấy thị vạn để kiểm tra) Thêm mL cloroform, lắc nhẹ để yên phút Lấy lớp để tiến hành chấm sắc ký + Mẫu thử: Cắt nhỏ lượng viên nhai (tương đương mg nicotin) thành lát nhỏ chuyển vào ống ly tâm Cho thêm mL cloroform siêu âm 30 phút Tiến hành ly tâm mẫu điều kiện 3000 vòng/phút phút Lấy lớp dung dịch trên, làm nguội nhiệt độ thường phút Thêm mL dung dịch acid hydrocloric 0,5 N Lắc tiến hành ly tâm điều kiện Lấy lớp chuyển vào bình lắng điều chỉnh đến pH 10 dung dịch natri hydroxyd N (dùng giấy thị vạn để kiểm tra) Thêm mL cloroform, lắc nhẹ để yên phút Lấy lớp để tiến hành chấm sắc ký + Mẫu placebo: Chuyển 2177,3 mg placebo vào ống ly tâm Thêm mL cloroform siêu âm 30 phút Tiến hành ly tâm mẫu điều kiện 3000 vòng/phút phút Lấy lớp dung dịch trên, làm nguội nhiệt độ thường ic 0,5 N Lắc tiến hành ly tâm điều kiện Chuyển lớp vào bình lắng điều chỉnh đến pH 10 dung dịch natri hydroxyd N (dùng giấy thị vạn để kiểm tra) Thêm mL cloroform, lắc nhẹ để yên phút Lấy lớp để tiến hành chấm sắc ký ➢ Chấm 10 µL dung dịch đối chiếu dung dịch thử Vết chấm mẫu cách mặt sắc ký 1,5 cm ➢ Hệ dung môi: Cloroform – aceton – diethylamin (40: 5: 5) ➢ Tiến hành chạy sắc ký đến đường di chuyển dung môi tối thiểu khoảng cm Để khơ soi đèn UV, bước sóng 254 nm 2.2.2 Phương pháp định lượng nicotin sắc ký hiệu cao 2.2.2.1 Sơ khảo sát quy trình - Điều kiện sắc ký: Cột nhồi pha tĩnh C18 (250 x 4,6 mm; µm) + Pha động: A-B = 15:85 + Dung môi A: Methanol + Dung môi B: Đệm citrat phosphat (Cách pha đệm: cân 5,02 g NaH2PO4 6,20 g vào 500 mL nước, khuấy đều) + Thể tích tiêm: 20 µL + Tốc độ dịng: 0,7 mL/phút + Detector UV: λmax = 260 nm - Quy trình xử lý mẫu: + Pha dung mơi pha mẫu (DMPM): Đệm citrat phosphat + Mẫu chuẩn: cân xác khoảng 24,5 mg nicotin ditartrat cho vào bình định mức 50 mL Hòa tan DMPM bổ sung vừa tới vạch Tiếp tục pha loãng mL dung dịch bình định mức 20 mL Lọc qua đầu lọc 0,45 µm + Mẫu thử: Cho viên vào cốc 250 mL, thêm 50 mL hexan, khuấy từ (tốc độ 450 vòng/phút) đến tan chất gum Tiếp tục thêm xác 50 mL DMPM khuấy thêm khoảng 25 phút Cho dung dịch vào phễu chiết, ổn định khoảng 20 phút Lấy lớp lọc thơ qua giấy lọc, sau lọc qua đầu lọc 0,45 µm - Bước 1: Hịa tan chất gum để giải phóng nicotin vào dung dịch dung mơi phân cực trung bình đến phân cực Tiến hành khảo sát với hexan ethyl acetat Ghi nhận khả thời gian hòa tan gum dung dịch - Bước 2: Giải phóng nicotin tác nhân acid Ghi nhận hiệu suất chiết 2.2.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sắc ký Ảnh hưởng pH dung dịch đệm - Nicotin base hai bậc với giá trị pKa1 = 3,12 (vòng pyridin) pKa2 = 8,02 (vịng pyrolidin) nên pH có ảnh hưởng lớn đến tỉ lệ ion hóa Ở pH 7,0 – 7,5, có 25% nicotin dạng trung hịa Ở pH 2,5 – 3,0; nicotin tồn hai dạng proton hóa bậc bậc; dạng proton hóa bậc khoảng từ 19-43%.[6] - Bên cạnh đó, có nghiên cứu cho thấy khoảng pH 5,0 – 6,0, nicotin tồn chủ yếu dạng proton hóa bậc - Do vậy, tiến hành ảnh hưởng hai vùng pH sau: + Khảo sát ảnh hưởng pH 5,0; 5,5; 6,0: pha đệm citrat phosphat, điều chỉnh đến pH cần thiết dung dịch NaOH 2M + Khảo sát pH < 2,5: pha đệm citrat phosphat, điều chỉnh đến pH 2,4 acid percloric.[7] - Ghi nhận số liệu Đánh giá dựa hình dạng pic, diện tích pic, hệ số kéo đuôi số đĩa lý thuyết Ảnh hưởng bước sóng hấp thu Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng quan trọng định tới độ nhạy phép phân tích Do phương pháp phân tích HPLC sử dụng đầu dị detector UV-Vis cố định bước sóng, cần khảo sát điều kiện nhằm chọn bước sóng tối ưu để phân tích Tiến hành qt phổ chuẩn nicotin để tìm bước sóng hấp thu cực đại Ảnh hưởng tỉ lệ pha động - Tiến hành khảo sát tỉ lệ sau: + MeOH – đệm = 15:85 + MeOH – đệm = 10:90 + MeOH – đệm = 5:95 - Ghi nhận số liệu Đánh giá dựa hình dạng pic, diện tích pic, hệ số kéo Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 2.34 SKĐ thẩm định độ xác trung gian – mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học YKết Dượcquả TP.Hồ Chí Minh đồng khối lượng Khối lượng viên (mg) m1 = 1105,3 m6 = 1106,4 m11 = 1109,6 m16 = 1103,9 m2 = 1107,2 m7 = 1113,2 m12 = 1105,6 m17 = 1102,5 m3 = 1102,4 m8 = 1104,1 m13 = 1110,2 m18 = 1107,3 m4 = 1101,7 m9 = 1099,5 m14 = 1112,8 m19 = 1108,7 m5 = 1109,7 m10 = 1106,3 m15 = 1102,3 m20 = 1109,9 Khối lượng viên trung bình: 1106,46 mg %RSD = 0,34% Khoảng giá trị giới hạn: 1051,12 mg – 1161,77 mg PL 2.35 Thực nghiệm đồng hàm lượng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PL 3.1 SKĐ tương thích hệ thống – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.2 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 2.2 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.4 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.5 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.6 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.7 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.8 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.9 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.10 SKĐ mẫu – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 3.11 SKĐ mẫu 10 – ứng dụng quy trình định lượng nicotin Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Anna El Tahchy, Michel Boisbrun, Agata Ptak (2010), "New method for the study of Amaryllidaceae alkaloid biosynthesis using biotransformation of deuterium-labeled precursor in tissue cultures",Biochimica Polinica, 57(1), pp.75-82 [2] Hoang-Yen T Nguyen, Bach-Hue T Vo, Jose Bernad Lac-Thuy H Nguyen, Mohamad Alaeddine, Agnes Coste (2013), "Extracts of Crinum latifolium inhibit the cell viability of mouse lymph oma cell line EL4 and induce activation of anti-tumour activity of macrophages in vitro",Journal of Ethnopharmacology, 149, pp 75-83 [3] Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014), "Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid flavonoid cho trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)", Luận án Tiến sĩ Dược học, Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM [4] Shibnath Ghosal, Kulwant S Saini, Sushma (1985), "Crinum alkaloids: their chemistry and biology",Phytochemistry, 24(10), pp 2141-2156 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... trên, đề tài ? ?Xây dựng Tiêu chuẩn sở kiểm nghiệm nicotin viên nén nhai hỗ trợ cai thuốc lá? ?? thực với mục tiêu cụ thể sau : * Xây dựng phương pháp định tính nicotin sắc ký lớp mỏng * Xây dựng thẩm... cho chế phẩm viên nén nhai chứa nicotin thị trường Áp dụng quy trình cho số viên nén nhai thị trường 2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm viên nén nhai nicotin chứa dược chất nicotin polacrilex... hàm lượng nicotin chế phẩm viên nén nhai, góp phần kiểm sốt nhanh chất lượng chế phẩm có chứa nicotintrên thị trường - Xây dựng tiêu chuẩn sở cho viên nén nhai nicotin chứa dược chất nicotin polacrilex