Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng acetylcholinesterase của một số dẫn chất benzohydrazid

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT BENZOHYDRAZID Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Huỳnh Thị Ngọc Phương Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT BENZOHYDRAZID Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Huỳnh Thị Ngọc Phương Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI: - Huỳnh Thị Ngọc Phương (1) Huỳnh Ngọc Trinh(2) Lê Thị Hoài Thảo (2) Lê Tuấn(1) Trần Kiên(1) - (1) (2) Bộ mơn Hóa Dược – Khoa Dược – ĐHYD TpHCM Bộ môn Dược Lý – Khoa Dược – ĐHYD TpHCM Mục lục I MỞ ĐẦU tr II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU tr II.1 Nguyên liệu tr II.2 Phương pháp tr - Tổng hợp hóa học tr - Thử nghiệm sinh học tr - Docking……………………………………………………………………………………… tr11 III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………………………………………… tr11 III.1 Kết quả……………………………………………… tr11 - Tổng hợp hóa học tr11 - Thử nghiệm kháng AChE in vitro tr15 - Docking……………………………………………… ………………………………… tr17 III.2 Bàn luận………………………………………………………………………… tr18 IV KẾT LUẬN tr19 V TÀI LIỆU THAM KHẢO tr19 Danh mục hình bảng Hình Sơ đồ tổng hợp HDZ 01-08…………………………………………………….tr Hình Sơ đồ tổng hợp HDP……………………………………………………….tr Hình Kết docking hợp chất HDP-3C HDP-3F…………………………… tr17 Bảng Hóa chất sử dụng thử nghiệm hoạt tính kháng AChE tr Bảng Thành phần phản ứng Ellman………………………………… tr Bảng Thứ tự cho thành phần thử nghiệm vào giếng ……………………… tr10 I Mở đầu Theo giả thuyết cholinergic, suy giảm trí nhớ người bệnh sa sút trí tuệ loại Alzheimer đến từ suy yếu chức hệ cholinergic não [1], [2] Các thuốc ức chế cholinesterase xem thuốc nhằm làm chậm tiến trình bệnh Alzheimer [3] Chính thế, chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) ngày trở nên thu hút nghiên cứu tồn cầu q trình khám phá thiết kế thuốc điều trị triệu chứng cho bệnh Alzheimer [4] Tuy nhiên có thuốc ức chế acetylcholinesterase (AChEI) sử dụng lâm sàng donepezil, galantamin, rivastigmin, hiệu cho việc giảm triệu chứng bệnh Alzheimer giai đoạn nhẹ tới trung bình [5] Do đó, việc tìm kiếm hoạt chất có tác dụng điều trị Alzheimer hiệu vấn đề cấp thiết Đề tài ‘Tổng hợp thử hoạt tính kháng acetylcholinesterase số dẫn chất benzohydrazid’ nhằm sàng lọc chất có khả ức chế AChE cao nhóm cấu trúc benzohydrazid, góp phần tìm thêm chất với tiềm sử dụng điều trị bệnh Alzheimer II Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu II.1 Nguyên liệu - Tổng hợp hóa học + Tất nguyên liệu tổng hợp mua từ công ty Acros organics, sử dụng trực tiếp không tinh chế lại Xác định nhiệt độ nóng chảy máy Stuart SMP10 với nhiệt kế không hiệu chỉnh + Phổ IR đo máy FTIR 8101 (SHIMADZU) Phổ 1H-NMR ghi máy Bruker (500 MHz) 25 oC với chuẩn nội TMS (tetra methyl silan) Phổ MS đo máy Shimadzu LCMS - Thử nghiệm sinh học in vitro Thiết bị: Máy vortex, Máy IMark Microplate Reader, Máy IMark Microplate Reader, Đĩa 96 giếng Aptaca đáy bằng… Bảng Hóa chất sử dụng thử nghiệm hoạt tính kháng AChE Tên CAS Nguồn Bảo quản AChE 9000-81-1 Sigma Andrich -20 oC ATCI 1866-15-5 Sigma Andrich 2-8 oC DTNB 69-78-3 Sigma Andrich 2-8 oC Galantamine 1953-04-4 Sigma Andrich -20 oC Tris HCl 1185-53-1 Merck 20-25 oC MeOH Chemsol, Việt Nam 20-25 oC DMSO Chemsol, Việt Nam 20-25 oC EtOH Chemsol, Việt Nam 20-25 oC CHCl3 Chemsol, Việt Nam 20-25 oC Nước khử khống BM Cơng nghệ vi sinh – Khoa Dược TP HCM II.2 Phương pháp - Tổng hợp hóa học Các dẫn chất benzohydrazid HDZ 01- 08 tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ benzoylhydrazid dẫn chất aldehyd thơm dị vòng thơm, cách đun hồi lưu 60-65°C CH3COOH/CH3OH, với hiệu suất từ 80 % đến 92 % (Hình 1) Các dẫn chất ((2-benzoylhydrazono) methyl) pyridinium (HDP) tổng hợp từ hydrazon HDZ 01-03 với dẫn chất benzyl clorid cách đun hồi lưu acetonitril khan 80-90oC (Hình 2) Cấu trúc độ tinh khiết hợp chất xác định phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM), điểm chảy kỹ thuật phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối (MS) + Dẫn chất benzohydrazid Hình Sơ đồ tổng hợp HDZ 01-08 R R HDZ 01 HDZ 05 HDZ 02 HDZ 06 HDZ 03 HDZ 07 HDZ 04 HDZ 08 + Dẫn chất pyridinium benzohydrazid (HDP) Hình Sơ đồ tổng hợp HDP - Thử hoạt tính kháng acetylcholinesterase Sử dụng phương pháp đo quang Ellman đĩa 96 giếng để xác định hoạt tính kháng acetylcholinesterase (AChE) [6] + Nguyên tắc: AChE thủy phân acetylthiocholin iodid (ATCI) tạo thiocholin, tác dụng với acid 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic) (DTNB) tạo hợp chất màu vàng 5-thio-2nitrobenzoic acid (TNB) Độ hấp thụ TNB đo 415 nm tỉ lệ với hoạt tính enzym Độ hấp thu thấp chứng tỏ hợp chất TNB tạo ít, tức thiocholin tạo Điều có nghĩa AChE bị ức chế mạnh + Cách tiến hành Các dẫn chất HDZ HDP hòa tan dung môi methanol 10 % đến nồng độ 200 µM (riêng với hợp chất HDZ 06 HDZ 07 thử nghiệm 50 µM - nồng độ hịa tan tối đa hỗ trợ methanol 10 %) Nồng độ dung môi pha chế thành phần phản ứng Ellman trình bày bảng Dung dịch enzym pha loãng từ dung dịch lưu trữ 25 U/ml đệm 0,1 M Tris HCl pH trước sử dụng làm lạnh oC Các thành phần lại bảo quản oC sử dụng vòng ngày Bảng Thành phần phản ứng Ellman Thành phần Nồng độ Đệm pH 0,1 M Tris HCl Nước cất Dung môi Acetylcholinesterase 0,415 U/ml Đệm 0,1 M Tris HCl pH DTNB 3,3 mM Đệm 0,1 M Tris HCl pH mM NaHCO3 ATCI mM Nước khử khoáng Đặt đĩa 96 giếng lên băng nước đá để trì nhiệt độ giếng oC Thứ tự cho thành phần vào giếng thể bảng Ủ hỗn hợp 15 phút 25 oC, sau thêm thành phần ATCI vào giếng Một phút sau thêm ATCI, tiến hành đo độ hấp thụ giếng bước sóng 415 nm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Bảng Thứ tự cho thành phần thử nghiệm vào giếng Thành phần BE B CE C Đệm pH (µL) 150 210 150 210 DTNB (µL) 30 30 30 30 AChE (µL) 60 - 60 - HDZ/HDP/Galantamin - - 30 30 30 30 - - 30 30 30 30 (µL) Methanol 10% Ủ 15 phút 250C ATCI (µL) Đo độ hấp thu (Abs) bước sóng 415 nm + Tính tốn kết Phần trăm ức chế AChE tính tốn dựa vào cơng thức % ức chế = Trong (ABE -AB )-(ACE -AC ) ×100 % (ABE -AB ) ABE: Độ hấp thu giếng chứa mẫu trắng có enzym AB: Độ hấp thu giếng chứa mẫu trắng khơng có enzym ACE: Độ hấp thu giếng chứa hợp chất có enzym AC: Độ hấp thu giếng chứa hợp chất khơng có enzym Kết % ức chế AChE trình bày dạng (giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn) lần thử nghiệm + Xác định IC50 hợp chất có tiềm Kết sàng lọc tác động kháng AChE cho phép chọn chất có tiềm để xác định IC50 (nồng độ chất khảo sát gây ức chế 50% hoạt tính enzym AChE) Mỗi chất pha loãng thành dãy nồng độ sử dụng phương pháp đo quang để xác định % 10 ức chế AChE nồng độ tương ứng Sau đó, phương trình hồi qui tuyến tính thiết lập để mô tả liên quan lgC với phần trăm ức chế AChE (% ức chế = a×lgC + b) Giá trị IC50 nội suy công thức đây: IC50 =10 50-b a - Phương pháp docking Docking thực phần mềm Autodock Vina 1.1.2 (The Scripps Research Institute, USA) mơ hình đồng kết tinh galanthamin enzym acetylcholinesterase loài cá đuối điện Tetronarce californica (PDB ID : 1DX6) Cấu trúc 2D hoạt chất chuẩn bị phần mềm ChemBio Draw 11.02 (PerkinElmer, USA) sau chuyển sang dạng 3D tối thiểu hóa lượng phần mềm ChemBio 3D 11.2 (PerkinElmer, USA) Phần mềm Open Babel 2.3.2 (Đại học Pittsburgh, USA) sử dụng để chuyển đổi file cấu trúc chất sang dạng file *.pdbqt dùng cho Autodock Vina Cấu trúc tính thể enzyme AChE tải từ ngân hàng liệu RCSB Protein Data Bank (rcsb.org) chuẩn bị phần mềm Autodock Tool 1.5.6 (The Scripps Research Institute, USA) Thuật toán docking thực khơng gian có kích thước 40 x 40 x 40 Å (tâm nằm tọa độ 5-62-62) quanh túi gắn kết galanthamine với giá trị Exhaustiveness 32 Kết docking phân tích Autodock Tool 1.5.6 Chimera 1.6.2 (UCSF, USA).[7-8] III Kết bàn luận III.1 Kết - Tổng hợp hóa học DẪN CHẤT BENZOHYDRAZID HDZ 01: (E)-N’-(pyridin-2-ylmethylen)benzohydrazid C13H11N3O Ptl: 225,25 Hiệu suất: 70%, tinh thể dạng kim, màu vàng Điểm chảy: 60 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 300 IR (υ cm-1 ): 3459,11 (N-H amid); 3063,94 – 3021,52 (C-H thơm); 1660,04 (C =O amid); 1562,77 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,05 (s, 1H); 8,63 (d, J = Hz, 1H); 8,49 (s, 1H, CH=N); 8,00 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,94 – 7,88 (m, 3H); 7,63 (t, J = Hz, 1H); 7,56 (t, J = 7,25 Hz, 2H); 7,44 -7,41 (m, 1H) LC-MS: m/z 248 [M+Na]+ ; 224 [M-H]- 11 HDZ 02: (E)-N’-((pyridin-3-yl)methylen)benzohydrazid C13H11N3O Ptl: 225,25 Hiệu suất: 88%, tinh thể dạng kim, màu vàng Điểm chảy: 158 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 299 IR (υ cm-1 ): 3468,59 (N-H amid); 3225,25 – 3055,60 (C-H thơm); 1657,64 (C=O amid); 1572,00 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,00 (s, 1H); 8,87 (s, 1H); 8,62 (d, J = 3,5 Hz, 1H); 8,52 (s, 1H, CH=N); 8,16 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,93 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,62 (t, J = Hz, 1H); 7,55 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,51 (dd, J = Hz, 1H) LC-MS: m/z 248 [M+Na]+; 224 [M-H]- HDZ 03: (E)-N’-((pyridin-4-yl)methylen)benzohydrazid C13H11N3O Ptl: 225,25 Hiệu suất: 80%, bột màu trắng Điểm chảy: 177 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 297 IR (υ cm-1 ): 3260,28 (N-H amid); 3051,46 (C-H thơm); 1650,27 (C=O amide); 1552,21 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,11 (s, 1H); 8,66 (d, J = 4,5 Hz, 2H); 8,46 (s, 1H, CH=N); 7,94 (d, J = Hz, 2H); 7,67 (s, 2H); 7,63 (t, J = 7,25 Hz, 1H); 7,56 (t, J = 7,5 Hz, 2H) LCMS: m/z 248 [M+Na]+; 224 [M-H]HDZ 04: (E)-N’-(thiophen-2-ylmethylen)benzohydrazid C12H10N2OS Ptl: 230,29 Hiệu suất: 85%, bột màu xanh Điểm chảy: 139 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 318 IR (υ cm-1 ): 3252,30 (N-H amide); 3088,35 – 3070,40 (C-H thơm); 1642,48 (C=O amide); 1553,43 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 11,79 (s, 1H, NH); 8,67 (s, 1H, CH=N); 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,68 (d, J = Hz, 1H); 7,59 (d, J = Hz, 1H); 7,54 (t, J = 7,25 Hz, 2H); 7,47 (d, J = Hz, 1H); 7,16 (t, J = Hz, 1H) LC-MS: m/z 253 [M+Na]+; 229 [M-H]- HDZ 05: (E)-N’-(4-(dimethylamino)benzyliden)benzohydrazid C16H17N3O Ptl: 267,33 Hiệu suất: 90%, bột màu xanh Điểm chảy: 158 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 357 IR (υ cm-1 ): 3243,75 (N-H amid); 3057,73 – 3030,02 (C-H thơm); 1649,93 (C=O amid); 1519,88 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 11,52 (s, 1H); 8,32 (s, 1H, CH=N); 7,90 (d, J = Hz, 2H); 7,57 – 7,50 (m, 5H); 6,77 (d, J = 8,5 Hz, 2H); 2,98 (s, 6H, 2CH3) LC-MS: m/z 290 [M+Na]+; 266 [M-H]- HDZ 06: (E)-N’-(2-(trifluoromethyl)benzyliden)benzohydrazid C15H11F3N2O Ptl: 292,26 Hiệu suất: 80%, tinh thể hình kim, khơng màu Điểm chảy: 128 ± oC UV-Vis (λ max nm, 12 MeOH): 297 IR (υ cm-1 ): 3190,60 (N-H amid); 3031,13 (C-H thơm); 1651,24 (C=O amid); 1555,17 (C=N) H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,16 (s, 1H); 8,86 (s, 1H, CH=N); 8,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,95 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 7,82 (m, 2H); 7,66 (m, 2H); 7,56 (t, J = 7,25 Hz, 2H) LC-MS: m/z 315 [M+Na]+; 291 [M-H]HDZ 07: (E)-N’-(2-chloro-6-fluorobenzyliden)benzohydrazid C14H10ClFN2O Ptl: 276,70 Hiệu suất: 80%, bột trắng Điểm chảy: 146 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 291 IR (υ cm-1 ): 3172,51 (N-H amide); 3049,35 – 3026,06 (C-H thơm); 1650,67 (C=O amide); 1555,06 (C=N); 691,90 (C-Cl) 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,06 (s, 1H); 8,72 (s, 1H, CH=N); 7,94 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 7,61 (m, 5H); 7,36 (t, J = Hz, 1H) LC-MS: m/z 299 [M+Na]+; 275 [M-H]HDZ 08: (E)-N’-(2-hydroxybenzyliden)benzohydrazid C14H12N2O2 Ptl: 240,26 Hiệu suất: 90%, bột màu xanh Điểm chảy: 137 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 285, 296, 327 IR (υ cm-1 ): 3268,94 (N-H amide); 3056,55 (C-H thơm); 1673,61 (C=O amide); 1538,04 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 12,10 (s, 1H) ; 11,30 (s, 1H) ; 8,65 (s, 1H, CH=N) ; 7,95 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,63 (t, J = 7,5; Hz, 1H); 7,56 – 7,53 (m, 3H); 7,32 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 6,95 (m, 2H) LC-MS: m/z 263 [M+Na]+; 239 [M-H]DẪN CHẤT ((2-BENZOYLHYDRAZONO) METHYL) PYRIDINIUM HDP-1F: (E)-2-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-(4-fluorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17ClFN3O, Ptl: 369,82 Hiệu suất: 70%, tinh thể dạng kim, màu vàng Điểm chảy: 80 ± 1oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 336 IR (υ cm-1 ): 3527,27 (N-H amid); 3030,77 2981,87 (C-H thơm); 1679,20 (C=O amid); 1553,61 (C=N); 1142,79 (C-F) 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,08 (d, J = Hz, 1H); 8,95 (s, 1H, CH=N); 8,84 (s, 1H); 8,69 (t, J = 8Hz, 1H); 8,17 (m, 1H); 8,01 (d, J = Hz, 2H); 7,70 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,59 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,42 (d, J = 4,5 Hz, 2H); 7,25 – 7,21 (m, 2H); 6,11 (s, 2H, CH2) LC-MS: m/z 334 [M-Cl]+ HDP-2F: (E)-3-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-(4-fluorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17ClFN3O, Ptl: 369,82 Hiệu suất: 65%, bột màu trắng Điểm chảy: 205 ± 1oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 301 IR (υ cm-1 ): 3459,34 (N-H amide); 3058,39 -3009,85 (C-H thơm); 1678,09 (C=O amid); 1509,26 (C=N); 1151,95 (C-F) 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 13 9,70 (s, 1H); 9,05 (d, J = Hz, 1H); 9,98 (d, J = Hz, 1H); 8,56 (s, 1H, CH=N); 8,19 (t, J = 8; 6,5 Hz, 1H); 8,02 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,68 (m, 3H); 7,59 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 7,27 (t, J = 8,5 ; Hz, 2H); 5,90 (s, 2H, CH2) LC-MS: m/z 334 [M-Cl]+ HDP-2M: (E)-3-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-(2-methylbenzyl) pyridinium chlorid C21H20ClN3O, Ptl: 365,86 Hiệu suất: 65%, tinh thể dạng kim, màu trắng Điểm chảy: 215 ± 1oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 300 IR (υ cm-1 ): 3418,59 (N-H amid); 3072,02 (C-H thơm); 1666,29 (C=O amide); 1557,39 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,57 (s, 1H); 9,02 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 8,87 (d, J = Hz, 1H); 8,58 (s, 1H, CH=N); 8,19 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 8,01 (d, J = Hz, 2H); 7,68 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,59 (t, J = ; 7,5 Hz, 2H); 7,45 (m, 1H); 7,39 (m, 3H); 5,98 (s, 2H, CH2); 2,40 (s, 3H, CH3) LC-MS: m/z 330 [M-Cl]+ HDP-2C: (E)-3-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-(2-chlorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17Cl2N3O, Ptl: 386,28 Hiệu suất: 60%, bột màu xanh Điểm chảy: 220 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 300 IR (υ cm-1 ): 3349,35 (N-H amide); 3076,59 (C-H thơm); 1687,80 (C=O amid); 1563,08 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,63 (s, 1H); 9,03 (d, J = Hz, 1H); 8,99 (d, J = Hz, 1H); 8,60 (s, 1H, CH=N); 8,20 (dd, J = 6,5 Hz, 1H); 8,02 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,70 (m, 2H); 7,61 (m, 5H); 6,07 (s, 2H, CH2) LC-MS: m/z 350 [MCl]+ HDP-3F: (E)-4-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-(4-fluorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17ClFN3O, Ptl: 369,82 Hiệu suất: 75%, bột màu xanh Điểm chảy: 207 ± oC UVVis (λ max nm, MeOH): 334 IR (υ cm-1 ): 3446,35 (N-H amid); 3026,47 (C-H thơm); 1672,30 (C=O amide); 1556,54 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,05 (d, J = Hz, 2H); 8,55 (s, 1H, CH=N); 8,49 (s, 2H); 8,02 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,70 (m, 1H); 7,63 (m, 4H); 7,27 (m, 2H); 5,83 (s, 2H, CH2) LC-MS: m/z 334 [M-Cl]+ HDP-3M: (E)-4-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-(2-methylbenzyl) pyridinium chlorid C21H20ClN3O, Ptl: 365,86 Hiệu suất: 61%, bột màu trắng Điểm chảy: 215 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 335 IR (υ cm-1 ): 3324,46 (N-H amid); 3043,57 (C-H thơm); 1688,90 (C=O amid); 1550,91 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 8,92 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 8,58(s, 1H, CH=N) ; 8,48 (s, 2H); 8,03 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,69 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 14 7,60 (t, J = 8; 7,5 Hz, 2H); 7,45 (m, 1H); 7,38 (m, 3H); 5,92 (s, 2H, CH 2); 2,37 (s, 3H, CH3) LC-MS: m/z 330 [M-Cl]+ HDP-3C: (E)-4-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-(2-chlorobenzyl) pyridinium chlorid C20H17Cl2N3O, Ptl: 386,28 Hiệu suất: 63%, bột màu xanh Điểm chảy: 198 ± oC UV-Vis (λ max nm, MeOH): 335 IR (υ cm-1 ): 3340,53 (N-H amid); 3043,81 (C-H thơm); 1688,09 (C=O amid); 1551,11 (C=N) 1H-NMR (500 MHz, MeOD): 9,01 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 8,58 (s, 1H, CH=N) ; 8,49 (s, 2H); 8,03 (d, J = Hz, 2H); 7,68 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,61 – 7,52 (m, 5H); 5,99 (s, 2H, CH2) LC-MS: m/z 350 [M-Cl]+ - Kết thử kháng acetylcholinestrerase + Kết sàng lọc hoạt tính kháng AchE Bảng Phần trăm ức chế AChE dẫn chất HDZ HDP Chất % ức chế Chất % ức chế HDP 1F 63,4 ± 2,5 % HDZ 01 6,9 ± 1,9 % HDP 2F 89,9 ± 0,8 % HDZ 02 15,6 ± 1,9 % HDP 2M 89,2 ± 1,0 % HDZ 03 16,7 ± 0,9 % HDP 2C 96,0 ± 0,8 % HDZ 04 7,8 ± 1,5 % HDP 3F 97,0 ± 2,9 % HDZ 05 13,7 ± 0,7 % HDP 3M 98,1 ± 3,1 % HDZ 06* HDP 3C 12,9 ± 1,8 % 101,7 ± 0,6 HDZ % 07* 7,2 ± 1,5 % HDZ 08 9,6 ± 1,8 % *Thử nghiệm 50 µM - nồng độ hòa tan tối đa hỗ trợ methanol 10% Phần trăm ức chế AChE dẫn chất HDP HDZ nồng độ 200 µM nồng độ hòa tan tối đa hỗ trợ methanol 10% trình bày bảng Kết cho thấy tất dẫn chất HDP có khả ức chế AChE cao, nồng độ 200 µM có phần trăm ức chế AChE lớn 50% Trong dẫn chất HDZ có phần trăm ức chế AChE thấp 50%, tối đa 16,7% 15 Do chúng tơi tiến hành xác định giá trị IC50 dẫn chất HDP so sánh với IC50 galantamin + Xác định IC50 dẫn chất HDP Dãy nồng độ phần trăm ức chế AChE tương ứng để xác định giá trị IC50 dẫn chất HDP chất đối chiếu galantamin trình bày bảng Bảng Xác định IC50 dẫn chất HDP galantamin Chất IC50 Dãy nồng độ % ức chế tương ứng (µM) Nồng HDP 1F 90,398 % ức chế 12,943 25 12,5 độ 0,8 0,3 1,7 0,7 2,0 40 20 10 2,5 2,152 0,450 80,8 ± 63,3 ± 52,3 ± 42,9 ± 25,6 ± độ 1,4 1,9 0,8 1,3 2,6 40 20 10 2,5 (µM) % ức chế 70,3 ± 63,7 ± 46,0 ± 25,5 ± 17,9 ± 1,3 1,9 1,8 2,2 1,0 (µM) 10 2,5 1,25 0,625 % ức chế 77,5 ± 67,6 ± 52,6 ± 38,0 ± 28,1 ± độ 1,4 0,9 0,6 1,9 2,2 (µM) 0,5 0,25 0,125 % ức chế 76,6 ± 65,4 ± 54,0 ± 41,8 ± 21,6 ± Nồng HDP 3F 50 66,4 ± 51,9 ± 36,2 ± 25,5 ± 13,0 ± % ức chế Nồng HDP 2C 100 (µM) 8,551 Nồng HDP 2M 200 (µM) Nồng HDP 2F độ độ 1,7 16 1,3 1,2 0,9 2,9 Nồng HDP 3M 0,992 (µM) % ức chế 81,5 ± 60,6 ± 48,5 ± 38,6 ± 21,7 ± 0,288 0,5 0,25 1,4 0,2 0,9 2,7 (µM) 0,5 0,25 0,125 % ức chế 83,2 ± 75,1 ± 57,3 ± 51,1 ± 33,0 ± độ 1,1 1,7 1,7 2,6 2,0 (µM) 2,121 1,061 0,530 0,265 0,133 % ức chế 69,3 ± 56,2 ± 46,5 ± 32,4 ± 19,6 ± Nồng Galantamin 0,711 2,1 Nồng HDP 3C độ độ 1,0 1,7 1,0 2,0 0,3 Trong dẫn chất HDP, có chất với IC50 nhỏ µM HDP 3F, HDP 3M HDP 3C Trong có chất với giá trị IC50 nhỏ chất đối chiếu galatamin (IC50 = 0,711 µM), HDP 3F (IC50 = 0,450 µM) HDP 3C (IC50 = 0,288 µM) Như vậy, chất HDP 3C có hoạt tính kháng AChE cao dẫn chất HDP khả ức chế AChE cao gấp 2,5 lần galantamin - Kết docking: Điểm số docking: 3C: -10,7; 3F: -10,6; 3M: -10,4 Qui trình docking thực chất HDP thể khả ức chế AChE tốt qua phương pháp đo quang Ellman giếng, HDP 3F, HDP 3M, HDP 3C Hình Kết docking hợp chất HDP-3C HDP-3F 17 III.2 Bàn luận - Tổng hợp hóa học Các benzohydrazid tổng hợp dễ dàng với hiệu suất từ 80 đến 92 % Ngoại lệ, việc tổng hợp HDZ 01 khó khăn với thời gian phản ứng kéo dài khoảng 24 tiếng so với 30 phút hydrazon khác, điều vị trí nguyên tử nitơ nhân pyridin (meta- so với nhóm aldehyd) Một khoảng giá trị pH thích hợp quan trọng trình tổng hợp hydrazon, pH thích hợp khoảng từ đến Đối với dẫn chất ((2-benzoylhydrazono) methyl) pyridinium, việc tổng hợp dẫn chất có nhân pyridin-2-yl khó khăn Thời gian phản ứng khoảng 15 tiếng so với tiếng dẫn chất chứa nhân pyridin-3-yl pyridin-4-yl Hơn vết nguyên liệu rõ mỏng Hiệu ứng khơng gian ngun nhân diện nhóm cồng kềnh gần nguyên tử nitơ nhân pyridin Dung môi khan cần thiết để thu hiệu suất tổng hợp cao - Liên quan cấu trúc – hoạt tính Các dẫn chất benzoylhydrazon phải pyridinium hóa có tác dụng ức chế acetylcholinesterase đặc biệt tác dụng mạnh đáng kể dẫn chất 4-((2benzoylhydrazono)methyl)-1-benzyl-pyridium (HDP 3C, 3M, 3F) Một nhóm halogen vị trí nhóm benzyl dường cần thiết để có hoạt tính ức chế AChE tốt (HDP 3C) Các nhận xét mối quan hệ cấu trúc tương quan với kết docking Theo đó, chất HDP 3C, HDP 3M HDP 3F nằm gọn túi xúc tác AChE Sự gắn kết chất khảo sát với AChE thực tương tác nhân thơm với acid amin trung tâm xúc tác, Trp84, Glu199, Phe330 vị trí anion thứ cấp đóng vai trị giúp định hướng chất vào túi xúc tác Phần lớn lượng ổn định 18 chất đến từ vùng Ngoài cịn có Trp279 vùng ngoại biên với chức noncholinergic phát gần (hình thành mảng β-amyloid) Theo kết này, phần benzyl (nhân thơm C) HDP 3C tương tác với Trp84, nhóm Clo tương tác với Trp 84 Ngồi ra, vịng pyridin (nhân thơm B) thể tương tác với Phe330 phần Tyr334, nhân thơm A tương tác chủ yếu với Trp279 Điểm số docking HDP 3C thấp -10,7, chất có IC50 thấp chất thử nghiệm Với HDP 3F HDP 3M, vịng C có tương tác với Trp84, nhiên, tương tác vòng B với Phe330 vòng A với Trp279 so với HDP 3C IV Kết luận Sự thêm vào nhóm ammonium bậc thơng qua q trình benzyl hóa nitrogen pyridinohydrazon giúp làm tăng hoạt tính kháng acetylcholinesterase, đặc biệt tác dụng mạnh đáng kể nhóm dẫn chất 4-((2-benzoylhydrazono)methyl)-1-benzyl-pyridium Kết tìm database reaxys ngày 6/6/2018, chất HDP 3C HDP 3F chất chưa công bố Điều hứa hẹn hai chất trở thành chất AChEI có tiềm để phát triển thành thuốc V Tài liệu tham khảo EK P (1986), "The cholinergic hypothesis ten years on", Br Med Bull., 42(1), 63-69 GL W (2006), "Neuropathologic changes in Alzheimer's disease: potential targets for treatment", J Clin Psychiatry, 67(3), 3-7 Bierer LM1 et al (1995), "Neurochemical correlates of dementia severity in Alzheimer's disease: relative importance of the cholinergic deficits", J Neurochem, 64(2), 749-760 Benzi G et al (1998), "Is there a rationale for the use of acetylcholinesterase inhibitors in the therapy of Alzheimer's disease?", European Journal of Pharmacology, 346(1), 1-13 Fallarero A et al (2008), "Inhibition of acetylcholinesterase by coumarins: The case of coumarin 106", Pharmacological Research, 58(3–4), 215-221 Ellman G L et al (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity", Biochemical Pharmacology, (2), 88-95 19 O Trott, A J Olson (2010) AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading, Journal of Computational Chemistry (31) 455-461 O’Boyle, N M.; Banck, M.; James, C A.; Morley, C.; Vandermeersch, T.; Hutchison, G R Open Babel (2011) An Open Chemical Toolbox Journal of Cheminformatics, 3, 33 20 ... HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT BENZOHYDRAZID Mã số: Chủ nhiệm đề tài:... việc tìm kiếm hoạt chất có tác dụng điều trị Alzheimer hiệu vấn đề cấp thiết Đề tài ? ?Tổng hợp thử hoạt tính kháng acetylcholinesterase số dẫn chất benzohydrazid? ?? nhằm sàng lọc chất có khả ức... Hình Sơ đồ tổng hợp HDZ 01-08 R R HDZ 01 HDZ 05 HDZ 02 HDZ 06 HDZ 03 HDZ 07 HDZ 04 HDZ 08 + Dẫn chất pyridinium benzohydrazid (HDP) Hình Sơ đồ tổng hợp HDP - Thử hoạt tính kháng acetylcholinesterase