Nội dung bài viết trình bày về tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn của các base schiff (được tổng hợp từ 5-bromosalicyaldehyd) và các dẫn chất amin tương ứng, khả năng gắn kết ở mức độ phân tử của các chất tổng hợp với enzym FabH của staphylocoocus aureus được minh họa bằng nghiên cứu ‘docking’.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ BASE SCHIFF VÀ DẪN CHẤT AMIN TƯƠNG ỨNG Huỳnh Thị Ngọc Phương*, Trần Ngọc Châu*, Lê Nguyễn Hồng Huyên*, Nguyễn Thị Thu Thủy* TÓM TẮT Giới thiệu: Base Schiff nhóm hợp chất có tác dụng kháng khuẩn tốt với chế ức chế enzym FabH, enzym cần thiết cho trình tổng hợp acid béo vi khuẩn Mục tiêu: Tổng hợp thử hoạt tính kháng khuẩn base Schiff (được tổng hợp từ 5bromosalicyaldehyd) dẫn chất amin tương ứng Khả gắn kết mức độ phân tử chất tổng hợp với enzym FabH Staphylocoocus aureus minh họa nghiên cứu ‘docking’ Phương pháp: Các base Schiff tổng hợp phản ứng ngưng tụ 5-bromosalicyaldehyd amin bậc Sau tiến hành khử hóa NaBH4 để thu dẫn chất amin Hoạt tính kháng khuẩn khảo sát phương pháp pha lỗng thạch Nghiên cứu mơ hình phân tử khả gắn kết chất FabH thực phần mềm FlexX3 Kết quả: base Schiff dẫn chất amin tương ứng tổng hợp thử hoạt tính kháng khuẩn chủng S aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Các chất tổng hợp cho hoạt tính tốt vi khuẩn gram (+) so với vi khuẩn gram (-) Các base Schiff có hoạt tính yếu amin Chất có hoạt tính kháng khuẩn tốt có nhóm Fluor cấu trúc Nghiên cứu mơ hình phân tử khả gắn kết FabH dẫn chất amin có hoạt tính kháng khuẩn tốt cho thấy amin hình thành tương tác kỵ nước với số acid amin vùng gắn kết FabH Kết luận: Dẫn chất amin có hoạt tính kháng khuẩn tốt base Schiff Sự diện nhóm Fluor giúp tăng hoạt tính kháng khuẩn chất Cấu trúc amin với vùng khơng gian kỵ nước đóng vai trò quan trọng việc gắn kết với enzym FabH Từ khóa: base Schiff, dẫn chất amin, kháng khuẩn, docking, FabH ABSTRACT SYNTHESIS AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SOME SCHIFF BASES AND CORRESPONDING AMINE DERIVATIVES Huynh Thi Ngoc Phuong, Tran Ngoc Chau, Le Nguyen Hong Huyen, Nguyen Thi Thu Thuy * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 347 - 352 Background: Schiff bases have been reported as potential antibacterial agents and inhibitors of FabH which is the essential enzyme of the fatty acid biosynthesis of bacteria Objectives: Synthesis and antibacterial activity study of two structure groups: Schiff bases synthesized from 5-bromosalicylaldehyd and corresponding amine derivatives The binding affinity in molecular level of synthesized compounds and Staphylococcus aureus-FabH is investigated by using docking study Methods: Schiff bases were synthesized by condensation between 5-bromosalicylaldehyde and the primary amines Amine derivatives were synthesized from Schiff bases by using reducing agent NaBH4 Agar dilution method was used to evaluate antibacterial activities of the synthesized compounds Docking ligands into the active site of FabH protein of Staphylococcus aureus was carried out by FlexX3 * Bộ mơn Hóa Dược - Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Hùynh Thị Ngọc Phương ĐT: 0908772118 Email: ngocphuonghuynhthi@gmail.com Chuyên Đề Dược Học 347 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Results: Schiff bases and corresponding amines were synthesized and tested antibacterial activity against S aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa The synthesized compounds exhibit more potent antibacterial activities against two Gram positive bacteria than two Gram negative ones Schiff bases showed weaker antibacterial activities than the corresponding amine derivatives The most potent antibacterial compounds contain Fluor atoms in their structures Docking simulation the two most potent amines into Staphylococcus aureus-FabH showed that these amines may form the hydrophobic interaction with many amino acids of the active site of FabH Conclusions: Amines showed more potent antibacterial activity than Schiff bases The present of Fluor in structure could enhance the antibacterial activity obviously The hydrophobic structures of two those amines are important for binding conformation with the assumed target S aureus - FabH Keywords: Schiff bases, amine derivatives, antibacterial activity, docking study, FabH vi khuẩn, tiến hành docking ĐẶT VẤN ĐỀ dẫn chất có tác dụng kháng khuẩn tốt Base Schiff nhóm hợp chất có tác protein Staphylococcus aureus-FabH tải từ dụng sinh học đa dạng kháng Plamodium ngân hàng liệu protein – PDB (13) falciparum (6), kháng khuẩn (1,2,3) kháng nấm, kháng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU virus (9), kháng ung thư, chống co giật, chống oxy hóa (10,11), … Nguyên liệu Trong tổng hợp hữu cơ, base Schiff chất trung gian để tổng hợp nhóm dẫn chất khác phức chất base Schiff - kim loại hay dẫn chất urê với phenylisocyanat báo cáo có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn(4,5) Gần base Schiff từ halogen salicylaldehyd 5-fluorosalicylaldehyd 5clorosalicylaldehyd tổng hợp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn (7,8) Tất nguyên liệu tổng hợp mua từ công ty Acros organics, Merck, Aldrich, Fisher chemical, sử dụng trực tiếp không tinh chế lại Xác định nhiệt độ nóng chảy máy Stuart SMP10 với nhiệt kế không hiệu chỉnh Phổ IR đo máy FTIR 8101 (SHIMADZU) Phổ 1H-NMR ghi máy Bruker (500 MHz) 25oC với chuẩn nội TMS (tetra methyl silan) Phương pháp tổng hợp Trong đề tài tập trung nghiên cứu tổng hợp số base Schiff từ 5bromosalicylaldehyd, đồng thời khử hóa base Schiff để tạo amin tương ứng Các chất tổng hợp thử nghiệm sinh học để so sánh sơ hoạt tính kháng khuẩn hai nhóm cấu trúc (base Schiff amin tương ứng) Các amin tổng hợp đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu cho việc tổng hợp dẫn chất urê dự kiến có tác dụng kháng khuẩn mạnh Các base Schiff tổng hợp phản ứng ngưng tụ 5-bromosalicylaldehyd amin thơm bậc (hình 1): Hòa tan 5bromosalicylaldehyd amin (tỉ lệ 1:1,2) riêng rẽ lượng tối thiểu ethanol trước phối hợp Phối hợp nguyên liệu vào bình cầu 25 ml, thêm vài giọt acid acetic băng làm xúc tác đun 50 oC, theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng, dung môi khai triển toluen – dicloromethan (10:1) đến thấy hết aldehyd Sản phẩm kết tủa lọc tinh chế phương pháp kết tinh lại ethanol Ngồi để tìm hiểu gắn kết mức độ phân tử chất tổng hợp đích tác động giả định enzym FabH, enzym tối cần thiết cho tổng hợp acid béo Các dẫn chất amin tổng hợp từ base Schiff phản ứng khử hóa NaBH4 (h, H4’); 7,55 (d, J=2,5 Hz, 1H, H3); 7,51 (s, 1H, H5’); 7,49 (dd, J=8,8; Hz, 1H, H5); 7,45-7,43 (m, 1H, H6’); 6,95 (d, J=8,5 Hz, 1H, H6) 4-Bromo-2-(((3’-cloro-4’-fluorophenyl)imino) methyl)phenol (BS7) Hiệu suất: 83,5% Điểm chảy: 138-139 oC IR (KBr, ν cm-1): 1620,1 (υC=N); 1276,8 (δO-H); 1259,4 (υC-F); 800,4 (υC-Cl); 628,8 (υC-Br) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 12,78 (s, 1H, OH); 8,50 (s, 1H, CH=N); 7,52 (d, J=2,5 Hz, 1H, H3); 7,47 (dd, J=8,8; 2,5 Hz, 1H, H5); 7,35 (dd, J=6,5; 2,5 Hz, 1H, H6’); 7,21 (t, J=9 Hz, 1H, H5’); 7,18-7,15 (m, 1H, H2’); 6,93 (d, J=8,5 Hz, 1H, H6) Tổng hợp dẫn chất amin 4-Bromo-2-((p-tolylimino)methyl)phenol (A1) Hiệu suất: 85,6% Điểm chảy: 121-122 oC IR (KBr, ν cm-1): 3259,5 (υN-H); 2868,0 (υC-H); 1514,0 (δN-H); 1122,5 (υC-O); 817,8 (υC-C); 628,8 (υC-Br) 1HNMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,29 (dd, J=8,8; 2,5 Hz, 1H, H5); 7,25 (d, J=2,5Hz, 1H, H3); 7,06 (d, J=8 Hz, 2H, H3’, H5’); 6,77-6,75 (m, 3H, H2’, H6’, H6); 4,37 (s, 2H, CH2); 2,28 (s, 3H, CH3) 4-Bromo-2-(((4’-fluorophenyl)amino) methyl) phenol (A2) Hiệu suất: 88,2% Điểm chảy: 125-127 oC IR (KBr, ν cm-1): 3249,8 (υN-H); 2868,0 (υC-H); 1508,2 (δN-H); 1263,3 (δO-H); 1230,5 (υC-F); 1124,4 (υC-O); 628,8 (υC-Br) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,31 (dd, J =8,5; 2,5Hz, 1H, H5); 7,26 (s, 1H, H3); 6,97-6,95 (m, 2H, H3’, H5’); 6,80-6,76 (m, 3H, H2’, H6’, H6); 4,36 (s, 2H, CH2) 4-Bromo-2-(((4’-bromophenyl)amino) methyl)phenol (A3) Hiệu suất: 51,3% Điểm chảy: 87-89 oC IR (KBr, ν cm-1): 3253,7 (υN-H); 2869,9 (υC-H); 1490,9 350 (δN-H); 1124,4 (υC-O); 628,8 (υC-Br) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,33 (d, J=8,5 Hz, 2H, H3, H5); 7,31-7,27 (m, 2H, H3’, H5’); 6,76 (d, J=8,5 Hz, 1H, H6); 6,69 (d, J=8,5 Hz, 2H, H2’, H6’); 4,35 (s, 2H, CH2) 4-Bromo-2-(((4’-clorophenyl)amino)methyl) phenol (A4) Hiệu suất: 84% Điểm chảy: 91-92 oC IR (KBr, ν cm-1): 3251,8 (υN-H); 2868,0 (υC-H); 1492,8 (δN-H); 1263,3 (δO-H); 1126,4 (υC-O); 671,2 (υC-Cl); 628,8 (υCBr) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,31 (dd, J=8,3; 2,5 Hz, 1H, H5); 7,28-7,26 (m, 1H, H3); 7,217,19 (m, 2H, H3’, H5’); 6,77-6,74 (m, 3H, H2’, H6’, H6); 4,36 (s, 2H, CH2) 4-Bromo-2-((phenylamino)methyl)phenol (A5) Hiệu suất: 43,7% Điểm chảy: 115-116 oC IR (KBr, ν cm-1): 3267,2 (υN-H); 1488,9 (δN-H); 1261,4 (δO-H); 1126,4 (υC-O); 628,8 (υC-Br) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,30 (dd, J= 8,5;2 Hz, 1H, H5); 7,28-7,27 (m, 1H, H3) ; 7,26-7,24 (m, 2H, H3’, H5’) ; 6,94 (t, J=7,5 Hz, 1H, H4’); 6,84 (d, J= Hz, 2H, H2’, H6’); 6,77 (d, J=8,5 Hz, 1H, H6); 4,39 (s, 2H, CH2) 4-Bromo-2-(((3’-(trifluoromethyl)phenyl) amino)methyl)phenol (A6) Hiệu suất: 69,8% Điểm chảy: 115-117 oC IR (KBr, cm-1): 3251,8 (υN-H); 2866,0 (υC-H); 1263,3 (δOH); 1109,0 (υC-F); 628,8 (υC-Br) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,36-7,31 (m, 3H, H5’, H4’, H3); 7,15 (d, J=8 Hz, 1H, H6); 7,03 (s, 1H, H2’); 6,95 (dd, J=8; Hz, 1H, H5); 6,78 (d, J=9Hz, 1H, H6’), 4,40 (s, 2H, CH2) 4-Bromo-2-(((3’-cloro-4’-fluorophenyl) amino)methyl)phenol (A7) Hiệu suất: 81,7% Điểm chảy: 131-132 oC IR (KBr, ν cm-1): 3253,7 (υN-H); 2866,0 (υC-H); 1500,5 (δN-H); 1261,4 (δO-H); 1224,7 (υC-F); 1120,6 (υC-O); 759,9 (υC-Cl); 628,8 (υC-Br) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,32 (dd, J=8,5; 2,5 Hz, 1H, H5); 7,28 (d, J= 2,5 Hz, 1H, H3); 7,02 (t, J=9 Hz, 1H, H5’); 6,85 (dd, J=6; 2,5 Hz, 1H, H6’); 6,77 (d, J=8,5 Hz, 1H, H6); 6,67-6,64 (m, 1H, H2’); Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 4,33 (s, 2H, CH2) Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Kết giá trị MIC hai chủng vi khuẩn gram dương (S aureus B subtilis) hai chủng gram âm (E coli P aeruginosa) trình bày bảng Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn sơ hai chủng vi khuẩn gram dương (S aureus B subtilis) hai chủng gram âm (E coli P aeruginosa) cho thấy tất base Schiff amin tương ứng có hoạt tính kháng khuẩn nghiêng hai chủng gram dương Bảng Giá trị MIC chất thử nghiệm vi khuẩn Hợp chất BS1 BS2 BS3 BS4 BS5 BS6 BS7 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 Nồng độ ức chế tối thiểu – MIC (µ µg/ml) Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-) S aureus B subtilis E coli P aeruginosa 48 48 192 192 96 192 48 48 96 192 192 96 96 24 12 12 12 12 12 24 24 96 6 6 - (-) >192 µg/ml Tác động gram âm đặc biệt khơng có chất hợp chất tổng hợp có tác động kháng khuẩn P aeruginosa thử nghiệm Nhìn chung base Schiff cho họat tính amin tương ứng tất chủng vi khuẩn thử nghiệm Hai base Schiff có hoạt tính tốt số BS2 BS6 (hoạt tính kháng khuẩn trung bình yếu với MIC = 48 µg/ml S aureus B subtilis); BS6 cho hoạt tính kháng E coli tốt BS2 Quan sát cấu trúc BS2 BS6, hai chứa nguyên tử F, điều cho thấy có lẽ Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học có mặt ngun tố fluor có ảnh hưởng tích cực đến tác dụng kháng khuẩn Nhóm hợp chất amin tổng hợp từ base Schiff tương ứng thể hoạt tính kháng khuẩn tốt base Schiff từ đến 32 lần hoạt tính chủ yếu thể hai chủng vi khuẩn Gram (+) (S aureus B subtilis) Có lẽ nối –C-N- thay –C=N- có vai trò quan trọng hoạt tính kháng khuẩn Hai amin A6 A7 thể hoạt tính kháng khuẩn tốt với MIC = µg/ml S aureus B subtilis Hai amin mang cấu trúc nguyên tử F, nhận xét lần gợi ý ảnh hưởng tích cực nguyên tử F hoạt tính kháng khuẩn base Schiff lẫn amin tương ứng Hình Kết 2D (trái) 3D (phải) docking hợp chất amin (trên) amin (dưới) vào vị trí tác động FabH S.aureus Mơ hình mơ tả phân tử docking Từ kết giá trị MIC chọn amin A6 A7 chất có hoạt tính kháng khuẩn cao để thực docking vào protein S aureus-FabH Kết docking minh họa hình Kết docking cho thấy hai hợp chất tạo nhiều tương tác với acid amin vị trí tác động enzym Ở A6, nguyên tử N nhóm amin tạo liên kết hydro mạnh với Aln240 (d=1,96 Å) Cấu trúc kị nước hệ thống vòng thơm chuỗi carbon tạo tương tác kỵ nước với nhiều acid amin 351 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Gly203, Leu156, Arg243, Phe207, Val206, Asn268, His238… Asn268 His238 hai acid amin quan trọng ba xúc tác (Cys112, His238, Asn268) Ở A7, nguyên tử O nhóm hydroxy nhân thơm tạo liên kết hydro mạnh với Gly203 (d=1,66 Å) Hợp chất tạo nhiều tương tác kỵ nước với Phe207, Leu156, Leu190, Asn241, Asn268… acid amin Asn268 acid amin quan trọng ba xúc tác Từ cho thấy, tính chất kỵ nước hợp chất amin ảnh hưởng đáng kể đến việc hình thành tương tác kỵ nước (Van der Waals) với acid amin ba xúc tác nói chung Asn268 nói riêng KẾT LUẬN Chúng tơi tổng hợp base Schiff từ nguyên liệu ban đầu 5bromosalicylaldehyd amin tương ứng với base Schiff Tất base Schiff amin tương ứng có hoạt tính kháng khuẩn nghiêng hai chủng gram dương Nhóm hợp chất có cấu trúc amin có hoạt tính kháng khuẩn cao base Schiff tương ứng Các base Schiff amin có tác dụng kháng khuẩn tốt thử nghiệm dẫn chất chứa Fluor, gợi ý ảnh hưởng tích cực nguyên tử halogen tác dụng kháng khuẩn nhóm hợp chất nghiên cứu Hai dẫn chất amin cho hoạt tính kháng khuẩn cao 4-bromo-2-(((3’(trifluoromethyl) phenyl)amino)methyl)phenol (A6) 4-bromo-2-(((3’-cloro-4’fluorophenyl)amino) methyl)phenol (A7) với MIC = µg/ml S aureus B subtilis Tính chất kị nước hai hợp chất amin ảnh hưởng đáng kể đến việc hình thành tương tác kị nước với acid amin ba xúc tác nói chung Asn268 nói riêng vùng tác động enzym FabH bước nghiên cứu nhằm tìm chất khởi nguồn có tác dụng kháng khuẩn tốt nhóm cấu trúc base Schiff hợp chất có cấu trúc liên quan TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 Echevarria A, Nascimento M d G., Geronimo V., et al (1999), NMR Spectroscopy, Hammett Correlations and Biological Activity of Some Schiff Bases Derived from Piperonal, J Braz Chem Soc, 10(1): 60-64 European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (2000), Determination of minimum inhibitory concentration (MICs) of antibacterial agents by agar dilution, Clinical Microbiology and Infection, 6(9):509-515 Karthikeyan MS, Prasad DJ, Poojary B, et al (2006), Synthesis and biological activity of Schiff and Mannich bases bearing 2,4dichloro-5-fluorophenyl moiety, Bioorg Med Chem, 14(22): 7482-7489 Li ZL, Li QS, Zhang HJ, et al (2011), Design, synthesis and biological evaluation of urea derivatives from ohydroxybenzylamines and phenylisocyanate as potential FabH inhibitors, Bioorg Med Chem, 19(15):4413-4420 Neelakantan MA, Esakkiammal M, Mariappan SS, et al (2010), Synthesis, Characterization and Biocidal Activities of Some Schiff Base Metal Complexes, Indian J Pharm Sci, 72(2):216-222 Rathelot P, Vanelle P, Gasquet M, et al (1995), Synthesis of novel functionalized 5-nitroquinolines and evaluation of in vitro antimalarial activity, Eur J Med Chem, 30:503-508 Shi L, Fang RQ, Zhu ZW, et al (2010), Design and synthesis of potent inhibitors of beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III (FabH) as potential antibacterial agents, Eur J Med Chem, 45(9):4358-4364 Shi L, Ge HM, Tan SH, et al (2007), Synthesis and antimicrobial activities of Schiff bases derived from 5-chloro-salicylaldehyde, Eur J Med Chem, 42(4):558-564 Sriram D, Yogeeswari P, Myneedu NS, et al (2006), Abacavir prodrugs: microwave-assisted synthesis and their evaluation of anti-HIV activities, Bioorg Med Chem Lett, 16(8):2127-2129 Tang YZ, Liu ZQ (2007) The antioxidant effect of hydroxylsubtituent Schiff bases on the free-radical-induced hemolysis of human erythrocytes, Cell biochemistry and function, 25:149-158 Varma RS, Dahiya R, Kumar S (1997), Clay catalized synthesis of imines and enamines under solvent-free conditions using microwave irradiation, Tetrahedron Letters, 38(12):2039-2042 FlexX, LeadIT 2.0.2 (2010) (BioSolveIT GmbH, Germany) Protein Database Bank-PDB (2012) http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do (truy cập ngày 18/08/2012) Ngày nhận báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 Các kết có tiền đề cho 352 Chuyên Đề Dược Học ...se Schiff Tất base Schiff amin tương ứng có hoạt tính kháng khuẩn nghiêng hai chủng gram dương Nhóm hợp chất có cấu trúc amin có hoạt tính kháng khuẩn cao base Schiff tương ứng Các base Schiff am...ng tích cực đến tác dụng kháng khuẩn Nhóm hợp chất amin tổng hợp từ base Schiff tương ứng thể hoạt tính kháng khuẩn tốt base Schiff từ đến 32 lần hoạt tính chủ yếu thể hai chủng vi khuẩn Gram (+) ...ệt khơng có chất hợp chất tổng hợp có tác động kháng khuẩn P aeruginosa thử nghiệm Nhìn chung base Schiff cho họat tính amin tương ứng tất chủng vi khuẩn thử nghiệm Hai base Schiff có hoạt tính tốt