Sàng lọc vi nấm cho taxol nội sinh trên cây thông đỏ (taxus wallichiana, taxaceae)

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SÀNG LỌC VI NẤM CHO TAXOL NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (TAXUS WALLICHIANA, TAXACEAE) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: DS Hà Vi Tp Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SÀNG LỌC VI NẤM CHO TAXOL NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (TAXUS WALLICHIANA, TAXACEAE) Mã số: Chủ nhiệm đề tài Hà Vi Tp Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2018 Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu đề tài đơn vị phối hợp Ngơ Nguyễn Lan Vy Lê Quang Hạnh Thƣ Trần Ngọc Tân Vũ Thanh Thảo MỤC LỤC CHƢƠNG MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 2.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc ngồi 2.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 10 2.3 Tính cấp thiết đề tài 11 2.4 Mục tiêu đề tài 11 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 12 3.2 Nội dung nghiên cứu 12 3.2.1 Ly trích endophytes từ Thơng đỏ dài 12 3.2.2 Sàng lọc vi nấm nội sinh cho paclitaxel PCR 15 3.2.3 Phản ứng PCR sàng lọc sơ vi nấm nội sinh 17 3.2.4 Nuôi cấy định tính taxol dịch ni cấy 18 3.2.5 Định tính paclitaxel dịch nuôi cấy endophyte 18 CHƢƠNG KẾT QUẢ 21 4.1 Phân lập định danh endophyte từ Thông đỏ dài 21 4.2 Kết sàng lọc chủng endophytes cho paclitaxel PCR 21 4.2.1 Thăm dò điều kiện PCR ADN Taxus chinensis 21 4.2.2 Khảo sát diện gene Ts, Dbat, Bapt vi nấm 23 4.3 Định tính paclitaxel sắc ký lớp mỏng 29 4.3.1 Sơ chế dịch nuôi cấy endophyte 29 4.3.2 Định tính paclitaxel sắc kí lớp mỏng 29 4.4 Định tính Paclitaxel HPLC 31 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1 KẾT LUẬN 32 5.2 KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 35 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Quy trình xử lý mẫu 13 Hình 3.2 Quy trình ly trích endophyte 15 Hình 4.1 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi Ts, Bapt 22 Hình 4.2 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi Dbat 22 Hình 4.3 Khảo sát nồng độ Mg2+ với mồi Dbat 22 Hình 4.4 PCR gene Ts nấm lần 23 Hình 4.5 PCR gene Ts nấm lần 23 Hình 4.6 PCR gene Dbat nấm lần 24 Hình 4.7 PCR gene Dbat nấm lần 24 Hình 4.8 PCR gene Bapt nấm lần 25 Hình 4.9 PCR gene Bapt nấm lần 25 Hình 4.10 Khảo sát lại điều kiện PCR với mồi Ts, gắn mồi 55 oC 26 Hình 4.11 Khảo sát lại điều kiện PCR với mồi Ts, gắn mồi 57 oC 27 Hình 4.12 Khảo sát lại diện gene Ts nấm 28 Hình 4.13 Sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi chloroform-acetonitrile 7:3 29 Hình 4.14 Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi ethylacetate-isopropanol 95:5 30 Hình 4.15 Sắc ký đồ HPLC dịch chiết methanol Pestalotiopsis C81-3 V62-2 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số endophyte thƣờng gặp chi Taxus Bảng 2.2 Danh mục mồi đƣợc công bố báo 10 Bảng 3.1 Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 µl 17 Bảng 3.2 Chƣơng trình nhiệt PCR 18 Bảng 3.3 Chƣơng trình rửa giải chọn 20 Bảng 4.1 Tóm tắt kết PCR 28 CHƢƠNG MỞ ĐẦU Vi nấm nội sinh (endophytic fungi) đƣợc định nghĩa vi nấm sống phần hay trọn đời mô khỏe mạnh ký chủ thực vật không gây bệnh cho Chúng tạo thành hệ vi sinh vật quan trọng Vi nấm nội sinh thực vật đƣợc tìm thấy có mặt riêng biệt đến hàng ngàn nấm nội sinh đƣợc phát tự nhiên Trong hai thập kỷ qua, nhiều hợp chất sinh học có tác động kháng khuẩn, diệt trùng, độc tế bào, kháng ung thƣ đƣợc tìm thấy từ nấm nội sinh, chúng đƣợc xem nguồn cho hợp chất có tác dụng sinh học quan trọng [1], [5] Taxol chất có hiệu lực chuyên biệt chống ung thƣ tuyến tiền liệt, buồng trứng, phổi ung thƣ vú Taxol đƣợc chiết xuất từ vỏ Thông đỏ (Taxus brevifolia) Hiện giá thành taxol cao hiệu suất chiết từ thấp trữ lƣợng thông đỏ tự nhiên giới hạn Từ Strobel G cs., 1993 [12], [14] phát Taxomyces andreanae phân lập từ Taxus brevifolia sản sinh hợp chất palitaxel (taxol), nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vi nấm nội sinh nhƣ nguồn cung cấp hợp chất sinh học mới, đặc biệt taxol đƣợc sản xuất endophyte phân lập từ Taxus spp Một số endophytes đƣợc phân lập từ Taxus sp thực vật khác đƣợc chứng minh cho taxol nhƣ Alternaria, Aspergillus, Botryodiplodia, Botrytis, Cladosporium, Colletotrichum, Ectostroma, Fusarium, Metarhizium, Monochaetia, Mucor, Ozonium, Papulaspora, Penicillium, Periconia, Pestalotia, Pestalotiopsis, Phyllosticta, Pithomyces, Taxomyces, Tubercularia… [8], [18] Taxol từ endophyte đƣợc chứng minh cho tác động chống phân bào nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời CHƢƠNG 2.1 TỔNG QUAN Tình hình nghiên cứu nƣớc ngồi Vào đầu năm 90, khơng có nghiên cứu cho kết phân lập nấm nội sinh từ lồi Thơng đỏ giới Đến năm 1993, sau vài nỗ lực nghiên cứu đáng kể, chủng endophyte Taxomyces andreanae đƣợc phân lập từ mạch libe bên vỏ Thông đỏ Pacific Taxus brevifolia Chủng endophyte có khả sản xuất paclitaxel hợp chất liên quan nuôi cấy môi trƣờng lỏng bán tổng hợp Paclitaxel đƣợc phát sắc ký, khối phổ phản ứng với kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho paclitaxel [10] Sau đó, dịng nấm nội sinh TF5 thuộc Tubercularia sp., đƣợc phân lập từ Thông đỏ Taxus mairei miền Nam Trung Quốc có khả tạo paclitaxel ni cấy mơi trƣờng lỏng khoai tây đƣờng (PDB) Chúng có hoạt tính chống phân bào mạnh thử dịng tế bào ung thƣ P388 KB Paclitaxel từ chủng endophyte thúc đẩy ổn định vi ống kích thích polymer hóa in vitro [15] Về sau, vài chủng endophyte khác đƣợc tìm thấy từ lồi Thơng đỏ giới Một số loài đƣợc phân lập phổ biến Pestalotiopsis microspora [14], [13] Bằng phƣơng pháp kiểm tra kháng thể đơn dịng chiết xuất, định tính, định lƣợng hợp chất có dịch ni cấy cho kết Pestalotiopsis có khả sản xuất paclitaxel Fusarium solani - đƣợc phân lập từ thân Taxus celebica - ni cấy mơi trƣờng lỏng sản xuất 1,6 μg/l paclitaxel môi trƣờng nuôi cấy Ngồi paclitaxel, lồi nấm cịn sản xuất đƣợc taxan, baccatin III 10 – deacetyl baccatin III – tiền chất sử dụng bán tổng hợp paclitaxel cơng nghiệp [3] Metarhizium anisopliae - 13 lồi nấm đƣợc sàng lọc từ 115 dòng nấm đƣợc phân lập từ vỏ Thông đỏ bắc Taxus chinensis - sản xuất 846,1 μg/l paclitaxel [3] Aspergillus candidus MD3 đƣợc phân lập từ vỏ thân Taxus media sản xuất 112 μg/g paclitaxel tính theo khối lƣợng khô sợi nấm [17], [19] Cladosporium cladosporioides đƣợc phân lập từ Taxus media khả sản xuất paclitaxel 10-deacetylbaccatin III nuôi cấy môi trƣờng lỏng khoai tây đƣờng (PDB) [16] Trong đó, dịng Aspergillus niger var taxi HD86 – phân lập từ Taxus cuspidata sản xuất 273,46 μg/l paclitaxel [20] Các nghiên cứu cho thấy loài endophyte có khả sản xuất paclitaxel có nguồn gốc từ lồi Thơng đỏ giới chủ yếu gồm: Taxomyces andreanae, Pestalotiopsis microspora, Truncatella sp.,… M Caruso cộng tiến hành nghiên cứu khả sản xuất taxane endophyte dạng vi nấm Actinomyces phân lập từ số chủng Taxus baccata Taxus brevifolia miền Bắc nƣớc Ý Khi nuôi cấy môi trƣờng khác nhau, khả sản xuất taxan vi sinh vật endophyte thay đổi Một số chủng endophyte nhƣ Alternaria đƣợc phân lập từ lõi thân có khả sản xuất taxane mơi trƣờng CYB MIDB, Fusarium phù hợp với môi trƣờng CYB, chi Phoma sp phát triển tốt môi trƣờng AHB CYB… Các chủng Actinomyces nhƣ Micromonospora, Streptomyces chủng Kitasatospora có khả sản xuất taxan nuôi cấy môi trƣờng phù hợp nhƣ PTB, CYB, SFB [2] Bảng 2.1 Một số endophyte thƣờng gặp chi Taxus Cây chủ Taxus wallichiana Endophyte Pestalotiopsis microspora Phoma spp Paecilomyces sp Tubercularia sp Taxomyces andreanae Fusarium solani Metarhizium anisopliae Aspergillus niger Pestalotiopsis versicolor Pestalotiopsis negleta Aspergillus candidus Cladosporium cladosporioides Colletotrichum gloeosporioides Actinomyces Aspergilllus sp Colletotrichum sp Taxus mairei Taxus brevifolia Taxus celebica Taxus chinensis Taxus cuspidata Taxus media Taxus baccata Một vài nghiên cứu endophyte thực vật cho thấy dạng nấm nội sinh có khả sản xuất paclitaxel xuất số thực vật khác Một vài chủng Pestalotiopsis microspora đƣợc phân lập từ Bụt mọc miền Nam Carolina có khả sản xuất paclitaxel [6] Tƣơng tự nhƣ vậy, đáng ngạc nhiên Maguireothamnus specious có endophyte nội sinh vi nấm Sematoantlerium tepuiense sinh paclitaxel Loài địa phƣơng mọc Venzzuelan – Guyana vùng Tây Nam Venezuela [14] Hoặc paclitaxel từ chủng endophyte thực vật Periconia sp [6] Seimatoantlerium nepalense đƣợc quan tâm Kumaran cộng (2008) phân lập đƣợc vi nấm Phyllosticta citricarpa Van der Aa từ Citrus medica L (Rutaceae) bị bệnh đốm Chennai, Ấn Độ Loài nấm sản xuất lƣợng paclitaxel cao, lên tới 265 μg/l môi trƣờng MID [11] Endophyte Colletotrichum gloeosporioides phân lập từ Justicia gendarussa sản xuất đƣợc 164,3 μg/L paclitaxel nuôi cấy môi trƣờng lỏng MID Đồng thời, chất biến dƣỡng thu đƣợc từ dịch ni cấy cho hoạt tính gây độc tế bào cao [4] Các nhà khoa học chứng minh hàm lƣợng paclitaxel thay đổi đến 125 lần khác Đặc biệt có thay đổi hàm lƣợng paclitaxel loài phận vị trí phận Các endophyte đƣợc chứng minh làm tăng hàm lƣợng paclitaxel môi trƣờng nuôi cấy mô Taxus in vitro Khi nuôi cấy đồng thời Taxus chinensis Fusarium mairei làm tăng hàm lƣợng paclitaxel 38 lần hệ thống nuôi cấy Canh cấy F mairei làm tăng gấp đôi sản xuất paclitaxel môi trƣờng nuôi cấy mô Taxus cuspidata Sự thay đổi hàm lƣợng paclitaxel tùy thuộc vào lồi (cả từ sang khác loài) tuổi mùa thu hái Li Y-C cộng chứng minh thay đổi hàm lƣợng paclitaxel từ sang khác, cành sang cành khác có liên quan đến mật độ endophyte có Cơ chế tƣợng trình dịch mã gen có tác động đến giai đoạn chậm trình sinh tổng hợp paclitaxel [7] Một số tác giả xác định đƣợc mối quan hệ endophyte sản xuất paclitaxel chủ: hai sinh tổng hợp hƣởng lợi ích từ chất biến dƣỡng Endophyte có ảnh hƣởng đến hàm lƣợng paclitaxel paclitaxel có tác động diệt nấm chống lại vi nấm gây bệnh cho Endophyte tự đề kháng với paclitaxel Các kết cho thấy endophyte vi nấm kích thích chủ sản xuất chất diệt nấm mà đề kháng nhằm ngăn chặn cố định vi sinh vật cạnh tranh nhƣng mức độ giới hạn không gây hại cho endophyte [9] Bảng 2.2 Danh mục mồi đƣợc công bố báo Gene Ts Ts Dbat Độ dài amplicon Trình tự mồi Mồi xi: CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG Mồi ngƣợc: CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT Mồi xuôi: CAAACCCATGTCCAAACCCATGTCG -AATTGAGAAG Mồi ngƣợc: CAAGTTTGCATACACTCTGGAATCT Mồi xuôi: GGGAGGGTGCTCTGTTTG Mồi ngƣợc: GTTACCTGAACCACCAGAGG Dbat Mồi xuôi: ATGGCDGGVTCHACDGAN Mồi ngƣợc: RRAWGGYTTWGTKACATATT Bapt Mồi xuôi: CCTCTCTCCGCCATTGACAA Mồi ngƣợc: TCGCCATCTCTGCCATACTT 631 bp T.canadensis 632 bp Pestalotiopsis versicolor, Colletotrichum capsici 153 bp Taxus x media Khoảng 200 bp số chủng vi nấm 1546 bp Cladosporium cladosporioides MD2, 1545 bp Aspergillus candidus MD3 453 bp Taxus cuspidata Khoảng 530 bp số chủng vi nấm Ts: Taxadiene synthase Dbat: 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase Bapt: Baccatin III 3-animo-3-phenylpropanoyl transferase 2.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc Hầu hết nghiên cứu nƣớc ta dừng lại phân lập, phân loại, phân bố endophyte thực vật nói chung mà chƣa nghiên cứu sâu hoạt tính dạng endophyte Nhóm nghiên cứu TS Lê Thị Xuân, PGS.TS Lê Mai Hƣơng thăm dị khả tạo chất taxol đƣợc chuyển hóa từ Taxus wallichiana (Thơng đỏ) Việt Nam Nhóm nghiên cứu tìm kiếm phát lồi Taxus Mai Châu, Hịa Bình mọc độ cao 1.000 m tách chiết đƣợc chất gần giống với 10–deacetyl baceatin III (10-DAB) chuyển hóa thành taxol Sáu chủng nấm nội sinh đƣợc phân lập từ lớp lõi cây, đặc biệt chủng Mucor circinolloides 10 M Ts bapt 1100 bp ~600 bpt Hình 4.1 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi Ts, Bapt Nhận xét: Đối với mồi Ts Bapt, không thu đƣợc sản phẩm PCR gắn mồi 59 o C Ở nhiệt độ 57 oC, thu đƣợc sản phẩm sáng rõ (Error! Reference source not found.) Đoạn gene đƣợc khuếch đại mồi Ts dài khoảng 1100 bp, đoạn gene đƣợc khuếch đại mồi Bapt dài khoảng 600 bp M 53 55 200 bp Hình 4.2 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi Dbat M 1.5 2.5 200 bp Hình 4.3 Khảo sát nồng độ Mg2+ với mồi Dbat Nhận xét: Đối với mồi Dbat, nhiệt độ gắn mồi 53 oC cho sản phẩm sáng so với 55 o C Do vạch sản phẩm tƣơng đối mờ, nồng độ Mg2+ đƣợc khảo sát lại mức 1,5 mM, 22 2+ mM, 2,5 mM Kết nồng độ Mg mM cho sản phẩm sáng (đây nồng độ Mg2+ đƣợc dùng ban đầu) Đoạn gene đƣợc khuếch đại mồi Dbat dài khoảng 200 bp Vậy nhiệt độ gắn mồi đƣợc chọn là: 57 oC cho mồi Ts, Bapt 53 oC cho mồi Dbat 4.2.2 Khảo sát diện gene Ts, Dbat, Bapt vi nấm 17 mẫu nấm đƣợc nuôi lắc ống nghiệm với môi trƣờng PDB có bổ sung chloramphenicol đƣợc chiết ADN theo quy trình chiết ADN nấm Chất lƣợng nồng độ ADN đƣợc kiểm tra cách đo OD 260 nm 280 nm 4.2.2.1 Khảo sát diện gene Ts 17 mẫu nấm Thực phản ứng PCR với mồi Ts với nhiệt độ gắn mồi nhƣ khảo sát Kết thu đƣợc nhƣ sau: 10 1100 bp Hình 4.4 PCR gene Ts nấm lần 1: Marker 2: Taxus 3: Acremonium R61-1 4: Fusarium C62-3 5: Pestalotiopsis V81-4 6: Pestalotiopsis R81-3 7: Pestalotiopsis C81-3 8: Pestalotiopsis V72-2 9: Mucor R83-1 10: chứng âm (nƣớc Q1) 10 11 12 13 Hình 4.5 PCR gene Ts nấm lần 23 1100 bp 1: Marker 2: Taxus 3: Pestalotiopsis C62-2 4: Pestalotiopsis V62-2 5: Pestalotiopsis C71-1 6: Fusarium R63-1 7: Fusarium R71-1 8: Colletotrichum L61-4 9: Colletotrichum C62-4 10: Mucor R83-4 11: A.terreus C62-1 (1) 12: A.niger C61-2 13: chứng âm (nƣớc Q1) Nhận xét: Khơng có mẫu vi nấm cho sản phẩm PCR với mồi Ts, nhiệt độ gắn mồi 57 oC 4.2.2.2 Khảo sát diện gene Dbat 17 mẫu nấm 10 200 bp Hình 4.6 PCR gene Dbat nấm lần 1: Marker 2: Taxus 3: Acremonium R61-1 4: Fusarium C62-3 5: Pestalotiopsis V81-4 6: Pestalotiopsis R81-3 7: Pestalotiopsis C81-3 8: Pestalotiopsis V72-2 9: Mucor R83-1 10: chứng âm (nƣớc Q1) 10 11 12 13 14 500 bp 200 bp Hình 4.7 PCR gene Dbat nấm lần 1: Marker 2: Taxus 3: Pestalotiopsis C62-2 4: Pestalotiopsis V62-2 5: Pestalotiopsis C71-1 6: Fusarium R63-1 7: Fusarium R71-1 8: Colletotrichum L61-4 24 9: Colletotrichum C62-4 10: Mucor R83-4 11: A.terreus C62-1 (1) 12: A.niger C61-2 13: chứng âm (nƣớc Q1) Nhận xét: chủng Pestalotiopsis V81-4, Pestalotiopsis R81-3, Pestalotiopsis C81-3 Pestalotiopsis V62-2 cho sản phẩm khoảng 200 bp; chủng Fusarium R63-1 Fusarium R71-1 cho sản phẩm khoảng 500 bp với mồi Dbat 4.2.2.3 Khảo sát diện gene Bapt 17 mẫu nấm 10 350 bp 150 bp Hình 4.8 PCR gene Bapt nấm lần 1: Marker 2: Taxus 3: Acremonium R61-1 4: Fusarium C62-3 5: Pestalotiopsis V81-4 6: Pestalotiopsis R81-3 7: Pestalotiopsis C81-3 8: Pestalotiopsis V72-2 9: Mucor R83-1 10: chứng âm (nƣớc Q1) 10 11 12 13 14 1000 bp 800 bp 350 bp 150 bp Hình 4.9 PCR gene Bapt nấm lần 1: Marker 2: Taxus 3: Pestalotiopsis C62-2 4: Pestalotiopsis V62-2 5: Pestalotiopsis C71-1 6: Fusarium R63-1 7: Fusarium R71-1 8: Colletotrichum L61-4 9: Colletotrichum C62-4 10: Mucor R83-4 11: A.terreus C62-1 (1) 12: A.niger C61-2 13: chứng âm (nƣớc Q1) Nhận xét: Các chủng Pestalotiopsis V81-4, Pestalotiopsis R81-3, Pestalotiopsis C62-2, Pestalotiopsis V62-2, Pestalotiopsis C71-1 cho vạch sản phẩm 150 bp 350 bp Các 25 chủng Pestalotiopsis C81-3, Pestalotiopsis V72-2 cho vạch sản phẩm 150 Chủng A terreus cho sản phẩm 1000 bp, chủng A niger cho sản phẩm 800 bp 4.2.2.4 Khảo sát lại điều kiện PCR mồi Ts vi nấm Con đƣờng sinh tổng hợp hợp paclitaxel phải trải qua bƣớc xúc tác enzyme Ts trƣớc, qua nhiều bƣớc trung gian, sau đến bƣớc xúc tác Dbat, Bapt Nếu mẫu nấm cho sản phẩm PCR với mồi Dbat Bapt, nhƣng không cho sản phẩm với mồi Ts, khả sản phẩm đƣợc khuếch đại thực chất khơng liên quan đến sinh tổng hợp paclitaxel, có liên quan chủng vi nấm nhiều khả khơng sản xuất đƣợc paclitaxel, khơng có chất cho enzyme Dbat, Bapt Một khả khác âm tính giả PCR với mồi Ts, điều kiện phản ứng khơng thích hợp, nên chúng tơi tiến hành khảo sát lại điều kiện PCR yếu tố đƣợc thay đổi nhiệt độ gắn mồi (giảm từ 57 oC xuống 55 oC), nồng độ Mg2+ nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng Mẫu nấm đƣợc lựa chọn cho thử nghiệm Pestalotiopsis V62-2 Mẫu nấm cho sản phẩm PCR với mồi Dbat, Bapt, nên cho sản phẩm với mồi Ts điều kiện PCR đƣợc điều chỉnh thích hợp Hình 4.10 Khảo sát lại điều kiện PCR với mồi Ts, gắn mồi 55 oC 1: Taxus, Mg2+ 2,0 mM 2: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 1,5 mM 3: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 2,0 mM 4: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 2,5 mM 5: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 3,0 mM 6: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 2,0 mM nhƣng lƣợng ADN ½ so với giếng 2,3,4,5 (khoảng 100 ng/25 µl) Phản ứng PCR đƣợc thực với nhiệt độ gắn mồi 55 oC Giếng ADN Taxus chinensis, giếng đến ADN Pestalotiopsis V62-2 Nồng độ ADN giếng 26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh đƣợc giữ nguyên so với thử nghiệm trƣớc, khoảng 100 ng/25 µl Nồng độ ADN từ giếng đến đƣợc tăng lên gấp đơi, khoảng 200 ng/25 µl Nhận xét: Ở điều kiện PCR dùng mồi Ts, nhiệt độ gắn mồi 55 oC, nồng độ Mg2+ 2,0 mM, nồng độ ADN 200 ng/25 µl, sản phẩm thu đƣợc cho vạch sáng rõ nhất, gồm vạch vạch phụ mờ vạch Ở điều kiện tƣơng tự nhƣng nồng độ ADN 100 ng/25 µl, khơng quan sát đƣợc vạch Điều gợi ý nguyên nhân làm cho phản ứng PCR mồi Ts lần thử nghiệm trƣớc âm tính nồng độ ADN khơng thích hợp Thí nghiệm sau đƣợc thực nhằm kiểm tra giả thuyết vừa nêu Hình 4.11 Khảo sát lại điều kiện PCR với mồi Ts, gắn mồi 57 oC 1: Taxus, nồng độ Mg2+ 2,0 mM 2: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 1,5 mM 3: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 2,0 mM 4: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 2,5 mM 5: Pestalotiopsis V62-2, Mg2+ 3,0 mM 6: Chứng âm (nƣớc Q1) Phản ứng PCR đƣợc thực với nhiệt độ gắn mồi 57 oC, nồng độ ADN tham gia phản ứng 200 ng /25 µl, nồng độ Mg2+ đƣợc thay đổi từ 1,5-3,0 mM Vạch sản phẩm sáng rõ giếng 4, ứng với nồng độ Mg2+ 2,5 mM Nhƣ vậy, nguyên nhân gây âm tính phản ứng PCR với mồi Ts thử nghiệm trƣớc nồng độ ADN thấp 4.2.2.5 Khảo sát lại diện gene Ts mẫu nấm Tiến hành PCR lại với mồi Ts mẫu ADN vi nấm Pestalotiopsis V81-4, Pestalotiopsis R81-3, Pestalotiopsis C81-3, Pestalotiopsis V62-2 (4 mẫu cho sản phẩm PCR với mồi Dbat, Bapt) Phản ứng PCR đƣợc thực với nồng độ ADN đƣợc tăng lên khoảng 200 ng /25 µl, nhiệt độ gắn mồi 57 oC 27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 800 bp 600 bp Hình 4.12 Khảo sát lại diện gene Ts nấm 1: Marker 2: Pestalotiopsis V62-2 3: Pestalotiopsis V81-4 4: Pestalotiopsis R81-3 5: Pestalotiopsis C81-3 6: Chứng âm (nƣớc Q1) Nhận xét: Cả mẫu ADN vi nấm cho sản phẩm PCR với mồi Ts, bao gồm vạch Vạch sáng vị trí 800 bp, vạch mờ vị trí 600-700 bp Kết luận: kết sàng lọc chủng endophyte cho paclitaxel bảng 4.4 cho thấy 4/17 chủng cho sản phẩm PCR dƣơng tính với cặp mồi Dbat, Bapt Ts gồm Pestalotiopsis V81-4, Pestalotiopsis R81-3, Pestalotiopsis C81-3, Pestalotiopsis V62-2 Chúng chọn ngẫu nhiên chủng C81-3 V62-2 để thử nghiệm qui trình sàng lọc Bảng 4.1 Tóm tắt kết PCR Chủng Acremonium R61-1 A niger C61-2 A terreus C62-1 (1) Colletotrichum L61-4 Colletotrichum C62-4 Fusarium C62-3 Fusarium R63-1 Fusarium R71-1 Mucor R83-1 Mucor R83-4 Pestalotiopsis V72-2 Pestalotiopsis C62-2 Pestalotiopsis V62-2 (*) Pestalotiopsis C71-1 Pestalotiopsis C81-3 (*) Pestalotiopsis R81-3 (*) Pestalotiopsis V81-4 (*) Mồi Ts + + + + Mồi Dbat + + + + + + Mồi Bapt + + + + + + + + + (*): mẫu nấm đƣợc PCR với mồi Ts lại, điều kiện phản ứng mô tả mục 4.2.2.5 28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 4.3 Định tính paclitaxel sắc ký lớp mỏng Triển khai sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi: - Hệ dung môi chloroform-acetonitrile : - Hệ dung môi ethyl acetate-iso-propanol 95 : Tiến hành song song với paclitaxel chuẩn Phát thuốc thử vanillin-sulfuric %, hơ nóng nhẹ mỏng 4.3.1 Sơ chế dịch nuôi cấy endophyte mẫu Pestalotiopsis V62-2 Pestalotiopsis C81-3 đƣợc nuôi chiết theo mô tả mục 4.4.2.3 Sau quay, cắn đƣợc hịa tan 10 ml methanol ml dung dịch methanol đƣợc sơ chế sắc kí lớp mỏng, hệ dung mơi chloroform-methanol 7:1 Lớp silicagel tƣơng ứng với vị trí paclitaxel chuẩn đƣợc cạo rửa giải với 10 ml methanol 4.3.2 Định tính paclitaxel sắc kí lớp mỏng Dung dịch methanol đƣợc đƣa lên mỏng, triển khai sắc kí với hệ dung mơi chloroform-acetonitrile 7:3 ethylacetate-isopropanol 95:5, song song với paclitaxel chuẩn Phun thuốc thử vanillin sulphuric 1% Hình 4.13 Sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi chloroform-acetonitrile 7:3 (T: 10 µl paclitaxel chuẩn, Rf = 0,36; C: 20 µl Pestalotiopsis C81-3; V: 20 µl Pestalotiopsis V62-2; T + C: 10 µl paclitaxel chuẩn + 20 µl Pestalotiopsis C81-3; T + V: 10 µl paclitaxel chuẩn + 20 µl Pestalotiopsis V62-2) 29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh T C T TC V TV paclitaxel Hình 4.14 Sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi ethylacetate-isopropanol 95:5 (T: 10 µl paclitaxel chuẩn, Rf = 0,67; C: 20 µl Pestalotiopsis C81-3; V: 20 µl Pestalotiopsis V62-2; T + C: 10 µl paclitaxel chuẩn + 20 µl Pestalotiopsis C81-3; T + V: 10 µl paclitaxel chuẩn + 20 µl Pestalotiopsis V62-2) Nhận xét: Ở vị trí ngang paclitaxel chuẩn (Rf = 0,67) có vết mờ màu xanh mẫu nấm, nhƣng triển khai sắc kí với hệ dung mơi khác nhƣ hình 4.13 khơng có vết màu xanh vị trí tƣơng ứng paclitaxel chuẩn Điều đƣợc kiểm tra HPLC kết chắn chủng Pestalotiopsis thử nghiệm cho paclitaxel với hàm lƣợng thấp không cho paclitaxel 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 4.4 Định tính Paclitaxel HPLC Chuẩn paclitaxel Chuẩn 10 DAB C81-3 V62-2 Hình 4.16 Sắc ký đồ HPLC dịch chiết methanol Pestalotiopsis C81-3 V62-2 Nhận xét: mẫu thử có peak không thời gian lƣu với peak 10-DAB paclitaxel đối chiếu Các peak mẫu thử có điểm cực đại phổ UV không phù hợp với cực đại phổ UV chất đối chiếu Kết điều kiện ni cấy chủng Pestalotiopsis C81-3 V62-2 chƣa phù hợp gene chịu trách nhiệm qui trình sinh tổng hợp paclitaxel khơng đƣợc biểu môi trƣờng nuôi cấy không thỏa điều kiện cần thiết 31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CHƢƠNG 5.1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Từ thông đỏ dài phân lập đƣợc 86 chủng vi nấm nội sinh 53/86 chủng đƣợc định danh đến mức loài Chủng chiếm tỉ lệ cao thông đỏ dài Pestalotiopsis Từ 17 chủng endophyte đƣợc sàng lọc sơ khả cho paclitaxel PCR, có mẫu cho sản phẩm khuếch đại với mồi Ts, Dbat, Bapt, bao gồm Pestalotiopsis V62-2, Pestalotiopsis V81-4, Pestalotiopsis R81-3, Pestalotiopsis C81-3 Chứng tỏ chủng có chứa gen chịu trách nhiệm qui trình sinh tổng hợp paclitaxel thông đỏ dài - Đã nuôi cấy chủng Pestalotiopsis V62-2 Pestalotiopsis C81-3 để chiết định tính paclitaxel phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng HPLC - Kết định tính chƣa phát paclitaxel dịch chiết chủng vi nấm với phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng HPLC điều kiện thí nghiệm nhƣ mơ tả 5.2 KIẾN NGHỊ Để hồn chỉnh qui trình sàng lọc endophyte phân lập từ Thông đỏ dài cho paclitaxel cần dị tìm thêm điều kiện ni cấy vi nấm thích hợp để enzym chịu trách nhiệm qui trình sinh tổng hợp paclitaxel thể hoạt tính 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 17 Atta-ur-Rahman (2000) Natural products chemistry – Bioactive Natural Products (part E) Vol 24: Elsevier Caruso, M, AL Colombo, L Fedeli, et al (2000) Isolation of endophytic fungi and actinomycetes taxane producers Annals of Microbiology 50(1): p 3-14 Chakravarthi, BVSK, Prasanta Das, Kalpana Surendranath, et al (2008) Production of paclitaxel by Fusarium solani isolated from Taxus celebica Journal of biosciences 33(2): p 259 Gangadevi, V and J Muthumary (2008) Isolation of Colletotrichum gloeosporioides, a novel endophytic taxol-producing fungus from the leaves of a medicinal plant, Justicia gendarussa Mycologia Balcanica 5: p 1-4 Joseph, Baby and R Mini Priya (2011) Bioactive Compounds from Endophytes and their Potential in American Journal of biochemistry and Molecular biology 1: p 291309 Li, Jia-yao, Gary Strobel, Rajinder Sidhu, et al (1996) Endophytic taxol-producing fungi from bald cypress, Taxodium distichum Microbiology 142(8): p 2223-2226 Li, Yong-Cheng, Wen-Yi Tao and Long Cheng (2009) Paclitaxel production using co-culture of Taxus suspension cells and paclitaxel-producing endophytic fungi in a co-bioreactor Applied microbiology and biotechnology 83(2): p 233 Soliman, Sameh SM and Manish N Raizada (2013) Interactions between cohabitating fungi elicit synthesis of Taxol from an endophytic fungus in host Taxus plants Frontiers in microbiology 4: p Soliman, Sameh SM, Christopher P Trobacher, Rong Tsao, et al (2013) A fungal endophyte induces transcription of genes encoding a redundant fungicide pathway in its host plant BMC plant biology 13(1): p 93 Sonaimuthu, Visalakchi and Muthumary Johnpaul (2010) Taxol (anticancer drug) producing endophytic fungi: an overview International Journal of Pharma and Bio Sciences 1(3): p 1-9 Sonaimuthu, Visalakchi and Muthumary Johnpaul (2010) Taxol (anticancer drug) producing endophytic fungi: an overview International Journal of Pharma and Bio Sciences 1(3) Strobel, G A, W M Hess, E Ford, et al (1996) Taxol from fungal endophytes and the issue of biodiversity Journal of Industrial Microbiology 17(5-6): p 417-423 Strobel, Gary A (2002) Microbial gifts from rain forests1 Canadian Journal of plant pathology 24(1): p 14-20 Strobel, Gary, Xianshu Yang, Joe Sears, et al (1996) Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallachiana Microbiology 142(2): p 435-440 Wang, Jianfeng, Guiling Li, Huaying Lu, et al (2000) Taxol from Tubercularia sp strain TF5, an endophytic fungus of Taxus mairei FEMS Microbiology Letters 193(2): p 249-253 Zhang, Peng, Peng-Peng Zhou and Long-Jiang Yu (2009) An endophytic taxolproducing fungus from Taxus media, Cladosporium cladosporioides MD2 Current microbiology 59(3): p 227 Zhang, Peng, Peng-Peng Zhou and Long-Jiang Yu (2009) An endophytic taxolproducing fungus from Taxus x media, Aspergillus candidus MD3 FEMS microbiology letters 293(2): p 155-159 33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 18 19 20 Zhao, J, L Zhou, J Wang, et al (2010) Endophytic fungi for producing bioactive compounds originally from their host plants Curr Res, Technol Educ Trop Appl Microbiol Microbial Biotechnol 1: p 567-576 Zhao, K, W Ping, Q Li, et al (2009) Aspergillus niger var taxi, a new species variant of taxol‐producing fungus isolated from Taxus cuspidata in China Journal of applied microbiology 107(4): p 227-232 Zhao, K, W Ping, Q Li, et al (2009) Aspergillus niger var taxi, a new species variant of taxol‐producing fungus isolated from Taxus cuspidata in China Journal of applied microbiology 107(4): p 1202-1207 34 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Môi trƣờng nuôi cấy vi nấm Mơi trường PDA Cơng thức cho lít mơi trƣờng: Khoai tây 200 g Dextrose 15 g Agar 20 g Nƣớc cất vđ lít Mơi trường PDB bổ sung Chloramphenicol Cơng thức cho lít mơi trƣờng: Khoai tây 200 g Dextrose 15 g Nƣớc cất vđ lít Chloramphenicol 50 mg/ml ml Mơi trường M1D Cơng thức cho lít mơi trƣờng: Ca(NO3)2 0,28 g KNO3 0,08 g KCl 0,06 g MgSO4 0,36 g NaH2PO4.H2O Sucrose 0,02 g 30 g Ammonium Tartrate 5,00 g (*) Soytone 1,00 g (*) Yeast extract 0,25 g FeCl3.6H2O 2,0 mg MnSO4 5,0 mg ZnSO4.7H2O 2,5 mg H3BO31,4 mg KI 0,7 mg pH đƣợc điều chỉnh đến 5-6, dung dịch HCl 0,1M 35 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh (*): Do điều kiện thí nghiệm, ammonium tartrate đƣợc thay ammonium citrat tribasic (4,40 g/l), soytone đƣợc thay bột đậu không béo (1,5 g/l) PHỤ LỤC 2: Đặc điểm chủng vi nấm Pestalotiopsis V62-2 Pestalotiopsis C81-3 Hình Đặc điểm khóm nấm (14 ngày) bảo tử Pestalotiopsis V62-2 Hình Đặc điểm khóm nấm (14 ngày) bảo tử Pestalotiopsis C81-3 Trên môi trƣờng PDA, tốc độ tăng trƣởng Pestalotiopsis chậm Khóm nấm dạng sợi rạp, màu trắng Sau 2-3 tuần bề mặt khóm bắt đầu xuất giọt tiết màu nâu (mẫu V62-2) đen (mẫu C81-3), sắc tố vàng nâu đƣợc tiết vào môi trƣờng Bào tử xuất hiện, tập trung thành vùng dày đặc Bào tử hình thoi, có khoảng tế bào, vách trơn, có vách ngăn, tế bào sẫm màu, phận phụ có nhánh Hình Bào tử dày đặc lẫn sợi nấm (mẫu Pestalotiopsis C81-3) 36 ... chung: Sàng lọc vi nấm cho taxol nội sinh Thông đỏ (Taxus wallichiana, Taxaceae)  Mục tiêu cụ thể: Phân lập định danh hệ nấm nội sinh Thông đỏ Sàng lọc chủng mang gen mã hóa cho enzyme chu trình sinh. .. TRƢỜNG SÀNG LỌC VI NẤM CHO TAXOL NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (TAXUS WALLICHIANA, TAXACEAE) Mã số: Chủ nhiệm đề tài Hà Vi Tp Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2018 Danh sách thành vi? ?n tham... ĐẦU Vi nấm nội sinh (endophytic fungi) đƣợc định nghĩa vi nấm sống phần hay trọn đời mô khỏe mạnh ký chủ thực vật không gây bệnh cho Chúng tạo thành hệ vi sinh vật quan trọng Vi nấm nội sinh