Nghiên cứu thành phần hóa học lá phù dung (hibiscus mutabilis l )

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC LÁ PHÙ DUNG (Hibiscus mutabilis L.) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS Trần Thị Vân Anh Tp Hồ Chí Minh, 3/2019 THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học Phù dung (Hibicus mutabilis L.) - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: TS Trần Thị Vân Anh Email: ttvananh@ump.edu.vn Điện thoại: 0918852989 - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): BM Dược liệu - Thời gian thực hiện: 01/07/2018 -01/07/2019 Mục tiêu: Phân lập xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết từ Phù dung Nội dung chính: - Thu thập mẫu nguyên liệu - Chiết cao toàn phần phương pháp chiết ngấm kiệt - Phân tách phân đoạn cao phương pháp phân bố lỏng-lỏng - Phân tách, phân lập chất tinh khiết phương pháp sắc kí - Xác định cấu trúc chất phân lập Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ) Từ phân đoạn cao dichloromethane ethyl acetat cao chiết phù dung phân lập hợp chất xác định scopoletin, acid vanilic, 3,4 dehydrotheaspiron.Trong hợp chất scopoletin 3,4-dehydrotheaspiron lần đầu báo cáo phân lập từ Phù dung H.mutabilis Các hợp chất phân lập tiền đề cho thử nghiệm dược lý tiêu chuân hóa dược liệu DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Trần Thị Vân Anh Nguyễn Thị Phương Trúc i MỤC LỤC MỞ ĐẦU TỔNG QUAN CÂY PHÙ DUNG 2.1 Đặc điểm thực vật 2.2 Thành phần hóa học 2.3 Tác dụng dược lý 2.4 Công dụng dân gian ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Sơ phân tích thành phần hóa học 3.2.2 Chiết xuất phân tách phân đoạn 3.2.3 Phương pháp phân lập 10 3.2.4 Xác định cấu trúc 11 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 12 4.1 Khảo sát mẫu nguyên liệu 12 4.1.1 Khảo sát vi học 12 4.1.2 Xác định độ tinh khiết 15 4.1.3 Sơ phân tích thành phần hóa học 16 4.2 Chiết xuất phân lập 17 4.2.1 Chiết xuất 17 4.2.2 Phân tách cao DCM (Muta-B) 19 4.3 Xác định cấu trúc 25 4.3.1 Xác định cấu trúc chất PD1 25 4.3.2 Xác định cấu trúc chất PD2 26 4.3.3 Xác định cấu trúc chất PD3 28 BÀN LUẬN 30 ii MỞ ĐẦU Hiện nay, giới có xu hướng quay thiên nhiên việc tìm phương thuốc phòng bệnh, cải thiện sức khỏe điều trị bệnh mãn tính Rất nhiều thuốc dân gian tìm thấy vườn nhà có công dụng không thua loại thuốc tổng hợp Cây Phù dung (Hibiscus mutabilis L.) họ Bông (Malvacaea) mọc hoang trồng nhiều nơi để làm cảnh Cây cịn có nhiều tên khác, "mộc phù dung", "mộc liên", "cự sương", "sương giáng", "túy tửu phù dung", "đại diệp phù dung", "địa phù dung", "thủy phù dung", "thất tinh" Phù dung có hoa thay đổi màu sắc vào thời điểm khác ngày nên thường trồng làm cảnh Ngoài vỏ thân Phù dung dùng để bện thừng, dệt vải làm giấy; đặc biệt hoa tươi khô dùng để làm thuốc Theo kinh nghiệm dân gian, hoa Phù dung dùng chữa mụn nhọt, sung tấy, kinh nguyệt không Ở Trung Quốc, hoa Phù dung dùng giải nhiệt giải độc, chữa ho lâu ngày, thuốc giảm đau chữa vết bỏng… Tuy nhiên đề tài nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng dược lý Phù dung cịn Nhằm góp phần đánh giá tác dụng thuốc dân gian sở khoa học, thực đề tài " Nghiên cứu thành phần hoá học Phù dung (Hibiscus mutabilis L.)" với mục tiêu: Khảo sát thành phần hoá học Phù dung Phân lập xác định cấu trúc hoá học hợp chất từ Phù dung làm sở cho việc tiêu chuẩn hóa khảo sát tác dụng dược lý TỔNG QUAN CÂY PHÙ DUNG 2.1 Đặc điểm thực vật Tên Việt Nam: Phù dung, phù dung thân mộc, mộc phù dung, địa phù dung, phù dung núi, hoa phù dung, mộc liên Tên khoa học: Hibiscus mutabilis L Phù dung nhỡ, có cành mang lơng ngắn hình Lá cánh, phía cuống hình tim, mép có cưa, đường kính đạt tới 15 cm, mặt có nhiều lơng hơn, thuỳ hình cạnh ngắn có gân Hoa lớn, đẹp, đơn độc tụ nhiều hoa, nở vào buổi sáng, có màu trắng, chiều ngả màu hồng đỏ (do có chất anthocyanosid) Quả hình cầu, có lơng màu nhạt Hạt hình trứng, có nếp nhăn nhỏ mang lơng dài [3] Phù dung có nguồn gốc Trung Quốc trồng nhiều Nhật Bản nhiều nước Châu Á (Philipin, Ấn Độ… ) Cây trồng Việt Nam nhập từ Trung Quốc có mặt rải rác khắp địa phương miền Bắc, từ đồng đến vùng núi cao 1500 m Cây Phù dung mọc hoang trồng khắp nơi Việt Nam để làm cảnh Hình Tồn hoa Hibiscus mutabilis L 2.2 Thành phần hóa học Theo tài liệu thu thập, thành phần hóa học Phù dung flavonoid Theo nghiên cứu Ishikura, flavonol glycoside (3-sambubioside, isoquercitrin, hyperin , quercetin 3-a-L-arabinosid (guaijaverin) avicularin) phân tách từ dịch chiết ethyl acetat, glycosid chuyển màu vàng NH3 tối Error! Reference source not found Nhóm acid hữu Các acid hữu như: acid salicylic, acid amin tìm thấy Phù dung.[15] Hạt phù dung chứa chất dầu gồm thành phần acid vernolic (5,9 %) steculic (7,3 %) acid malvalic (14,0 %) Error! Reference source not found Các flavonoid phenolic Nghiên cứu Vandara H.brave cộng (năm 2010) thành phần hoá học H.mutabillis có quercetin (0,170 %), β-sitosterol (1,160%), β-carotene (0,116 %) [15] Trong hoa có hyperin, guaijaverin, kaempferol, quercetin dẫn chất quercetin-3-Dxyloside , quercetin-3-sambubioside, isoquecitrin [15, 13] Năm 1982 Nariyuki Ishikura phân tích flavonoid từ cánh hoa màu hồng H.mutabillis là: quercetin 3-sambubioside [13] Nghiên cứu Emiko Iwaoka cộng năm 2009 tìm thấy cấu trúc flavonoid glycoside cánh hoa đặt tên mutabiloside [7] Thân phù dung chứa naringenin-5,7-dimethyl ether,4’-β-D-xylopyranosyl-β-D- arabinopyranoside, and eriodictyol-5,7-dimethyl ether-4’-β-D- arabinopyranoside Error! Reference source not found kaempferol Quercetin R=H Hyperin R= Galactose Isoquercetin R= glucose Quercitrin R= rhamnose tiliroside Hình Cấu trúc số chất tìm thấy Phù dung 2.3 Tác dụng dược lý Tác dụng kháng viêm Năm 2010 Vandana H Brave cộng nghiên cứu tác dụng kháng viêm dịch chiết ethyl acetat Phù dung Thử nghiệm sử dụng phương pháp gây phù chân chuột carrageenan Việc đo thay đổi bàn chân chuột ghi nhận phút 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 Kết cho thấy khả giảm phù bàn chân chuột dịch chiết ethyl acetat (100 mg/kg) đạt 64,52% so với mẫu chứng nimesulide (10mg/kg) 70,22% [15] Tác dụng chống oxy hoá Nghiên cứu nhóm S.K Wong; Y.Y Lim E.W.C Chan tác dụng chống oxy hoá, kháng enzym tyrosinase kháng khuẩn từ dịch chiết methanol hoa số loài thuộc chi Hibiscus Khả chống oxy hoá hoa H mutabilis đánh giá hàm lượng phenolic toàn phần, hàm lượng anthocyanin tồn phần, hoạt tính bắt gốc tự do, khả khử sắt, khả khử ion sắt hoạt tính ức chế peroxy lipid Hàm lượng phenolic toàn phần xác định phương pháp Folin-Ciocalteu với chất chuẩn acid gallic, kết tính tương đương theo số mg acid gallic 100 g mẫu nguyên liệu Lượng phenol toàn phần Phù dung 861 ± 92 mg acid gallic/100 g hoa 495 ± 23 mg acid gallic/100 g Hàm lượng anthocyanin xác định phương pháp vi sai pH Lượng anthocyanin tồn phần tính tương đương với mg cyanidin-3-glucoside 100 g mẫu nguyên liệu Lượng anthocyanin toàn phần hoa H mutabilis 16 ± mg cyanidin-3-glucoside/ 100 g Hoạt tính bắt gốc tự xác định thuốc thử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Mức độ đánh giá IC50 dùng acid ascorbic (mg/100 g) làm chất đối chiếu Hoạt tính bắt gốc tự H mutabilis 877 ± 137 mg acid ascorbic/100 g, hoa 562 ± 37 mg acid ascorbic/100 g Khả khử sắt thực với thuốc thử kali ferricyanid biểu thị kết mg acid GAE/g Hoạt tính phương pháp FRAP hoa H mutabilis 2,4 ± 0,1 mg GAE/g Khả kết hợp với ion sắt đánh giá thử nghiệm ferrous-ferrouzin Lá H mutabilis cho khả kết hợp với ion sắt tăng dần theo nồng độ đạt hoạt tính tối đa 60% sử dụng nồng độ 7,5 mg/ml H mutabilis Hoạt tính ức chế peroxy hố lipid xác định thử nghiệm làm đổi màu β-carotene Hoạt tính chống oxy hoá cao khả bảo vệ màu β-carotene lớn có đơn vị tính AOA (hoạt tính chống oxy hố) Nghiên cứu cho thấy với nồng độ mg/ml khả ức chế peroxy hoá H mutabilis 24 % Trong nghiên cứu xếp loại H mutabilis thuộc lồi chi Hibiscus có tác dụng chống oxy hoá mạnh hoa Error! Reference source not found Tác dụng chống dị ứng Năm 2009 nghiên cứu nhóm tác giả Emiko Iwaoka, Hisae Oku, Yumi Takahashi, Kyoko Ishiguro chứng minh tác dụng ngăn ngừa dị ứng từ quercetin dẫn chất từ dịch chiết methanol cánh hoa H mutabilis Phương pháp sử dụng thử nghiệm in vivo giám sát giảm lưu lượng máu tĩnh mạch đuôi chuột sau gây tăng nhạy cảm lysozyme lòng trắng trứng (HEL) Lưu lượng máu chuột nhạy cảm HEL (nhóm chứng) bị giảm đáng kể xuống khoảng 70% so với lưu lượng máu chuột bình thường vào ngày thứ Do đó, giai đoạn dị ứng đo cách chủ động dễ dàng cách theo dõi lưu lượng máu Sự giảm lưu lượng máu coi co lại mạch máu ngoại biên tăng độ nhớt máu, khơng thấy quan hệ với huyết áp Mặc dù kháng thể kháng HEL IgE tăng đáng kể sau bị gây nhạy cảm HEL, khơng có gia tăng đáng kể số lượng bạch cầu Do đó, giảm lưu lượng máu phản ánh trình khởi đầu phản ứng dị ứng Dịch chiết methanol cánh hoa (liều 200 mg/kg) hòa tan nước cho chuột gây nhạy cảm uống vào ngày (ngày bắt đầu; trước thử nhạy cảm), ngày 3, Khơng có thuốc thử ảnh hưởng đến lưu lượng máu Các phép đo lưu lượng máu thực ngày ngày Các tính tốn thống kê xác định so với nhóm chứng nhóm chuột bị gây nhạy không uống thuốc Kết cho thấy dịch chiết methanol cánh hoa H mutabilis ngăn ngừa giảm lưu lượng máu đuôi chuột sau ngày Các hoạt chất có khả kháng dị ứng cánh hoa H mutabilis dẫn chất quercetin chất đặt tên mutabiloside Error! Reference source not found Một số tác dụng dược lý khác Cao cồn Muta 300 gr Thêm nước Phân bố P.ether Dịch cồn nước Cao P.ether 40 gr (Muta-A) Phân bố dicloromethan Dịch cồn nước Cao DCM 7,5 gr (Muta-B) Phân bố ethylacetat Dịch cồn nước Cao EtOAc 9,5 gr (Muta-C) Phân bố butanol Dịch cồn nước Cao BuOH 73 gr (Muta-D) Cao nước 115 gr (Muta-E) Hình 3.7 Sơ đồ phân tách cao từ Phù dung 4.2.2 Phân tách cao DCM (Muta-B) Phân tách cao B SKC nhanh Điều kiện sắc kí: - Cột thuỷ tinh 30 x 3,5 cm - Silica gel: hạt vừa (40-63 µm) 70 g - Mẫu: 7,5 g cao Muta-B - Phương pháp nạp mẫu: nạp mẫu khô 19 - Dung môi: DCM, DCM-EtOAc (80:20) – (50:50) - Tốc độ dịng: 2,5 ml/phút - Thể tích hứng: 50 ml/ chai - SKLM theo dõi: hệ dung môi n-Hx-EtOAc (30:70) - Thuốc thử phát hiện: VS Kết sắc kí cột phân tách phân đoạn Muta-B trình bày Bảng Hình Bảng Kết sắc ký cột nhanh phân đoạn cao B Ký hiệu DCM – EtOAc (% EtOAc) Các ống Khối lượng Ghi dạng dầu Muta-B.1 1-5 2,5 g Muta-B.2 - 14 711 mg Muta-B.3 10 15 - 21 451 mg Muta-B.4 15 22 - 26 213 mg Muta-B.5 20 27 - 32 152 mg Muta-B.6 25 33 - 49 536 mg Hx-EtOAc (3:7) UV254 TP UV365 TP Hình Hình sắc ký phân đoạn cao B Nhận xét: Sau phân tách sắc kí cột nhanh cao B thu phân đoạn Phân đoạn B.2 B.3 có vết diện cao B có khối lượng tương đối nên tiếp tục phân tách tiếp Phân đoạn B.5 sạch, có vết cản quang UV254 màu nâu với thuốc thử VS nên tiến hành tinh chế tiếp để thu chất tinh khiết Tiến hành phân tích phân đoạn: B.2, B.3, B.5 Phân đoạn B.2: Tiến hành sắc ký rây phân tử phân tách phân đoạn B.2 (711 mg) với dung môi khai triển MeOH, kết cột trình bày Bảng Hình 20 Bảng Kết chạy sắc ký rây phân tử B.2 Ký hiệu Các ống Khối lượng Muta-B.2.1 -8 427 mg Muta-B.2.2 - 10 53 mg Muta-B.2.3 11 16 mg Muta-B.2.4 12 - hết 3,9 mg Hx-EtOAc (3:7) Hình Kết tinh chế phân đoạn B.2 SK rây phân tử Phân đoạn B.3: Tiến hành sắc ký rây phân tử phân tách phân đoạn B.3 (451 mg) với pha động MeOH Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng hệ dung mơi n-Hx-EtOAc (3:7) Kết trình bày Bảng hình 10 Hx-EtOAc (3:7) Hình 10 Hình sắc ký phân đoạn Muta-B.3 21 Bảng Kết phân đoạn B.3 Ký hiệu Các ống Khối lượng Muta-B.3.1 - 12 326 mg Muta-B.3.2 13 - 14 29 mg Muta-B.3.3 15 mg Muta-B.3.4 16 - 18 mg Muta-B.3.5 19 - hết 17 mg Nhận xét: Trong phân đoạn B.2 B.3 sau tinh chế Sephadex, hai phân đoạn B.2.2 B.3.2 có khối lượng tương đối cho vết tương đồng kiểm tra SKLM (hai vết tắt quang UV245, cho màu xanh đậm UV365 xuất vết màu với TT FeCl3) trình bày hình 11 Hai phân đoạn gộp chung đặt tên B.I Hx-EtOAc (3:7) Hình 11 Hình so sánh Muta-B.2.2 Muta-B.3.2 Phân đoạn B.I tiếp tục tinh chế sắc ký rây phân tử với pha động DCM-MeOH (80:20) Kết tinh chế trình bày Bảng Hình 12 22 Hx-EtOAc (3:7) Hình 12 Hình tổng hợp phân đoạn B.I qua cột Sephadex Bảng Kết phân đoạn sắc ký rây phân tử B.I Ký hiệu Các ống Khối lượng Ký hiệu Các ống Khối lượng Muta-B.I.1 - 22 15,5 mg Muta-B.I.5 35 - 43 63,11 mg Muta-B.I.2 23 - 27 10,8 mg Muta-B.I.6 44 - 47 12 mg Muta-B.I.3 28 - 30 13 mg Muta-B.I.7 48 - hết 25 mg Muta-B.I.4 31 - 34 10,4 mg Muta-B.I.5 35 - 43 63,11 mg Nhận xét: Phân đoạn B.I.3 B.I.6 có thành phần đơn giản gồm 1-2 vết Phân đoạn B.I.3 tinh chế qua cột silicagel nhỏ với hệ dung môi CHCl3-EtOAc (7: 3) thu phân đoạn có kết tinh hình kim bay dung môi Phân đoạn kiểm tra tinh khiết SKLM với hệ dung môi cho vết nên đặt tên PD1 (2 mg) Phân đoạn B.I.6 bay dung môi xuất kết tinh, lọc rửa tinh thể kiểm tra tinh khiết thu chất PD2 (10 mg) Phân đoạn Muta-B.5 Phân đoạn B.5 tinh chế qua cột Sephadex với dung môi DCM-MeOH (8:2) thu phân đoạn phân đoạn B.5.2 có vết Kết phân tích phân đoạn B.5 trình bày Bảng Hình 13 Bảng Kết phân đoạn B.5 Ký hiệu Các ống Khối lượng Muta-B 5.1 1-8 4,4 mg Muta-B.5.2 - 10 35 mg Muta-B 5.3 11 - 16 1,5 mg Muta-B.5.4 17 - 19 3,5 mg 23 Hx-EtOAc (3:7) Hình 13 Hình phân đoạn B.5 Phân đoạn B5.2 tiếp tục tinh chế qua cột silicagel dung môi DCM-EtOAc (7:3) thu chất tinh khiết kiểm tra SKLM, kí hiệu PD3 (3 mg) Như vậy, từ phân đoạn cao DCM (Muta-B) kĩ thuật sắc kí cột nhanh tinh chế qua cột rậy phân tử, cột silicagel phân lập chất PD1 (2 mg), PD2 (10 mg), PD3 (3 mg) Sơ đồ phân lập trình bày sơ đồ 1.; sắc kí tổng hợp chất phân lập trình bày Hình 14 Sơ đồ Sơ đồ phân tách cao Muta-B 24 CHCl3-MeOH (8:2) EtOAc bão hịa nước Hx-EtOAc (3:7) Hình 14 Hình tổng hợp chất phân lập từ cao B Nhận xét: Kết SKLM hệ khai triển khác cho thấy chất PD1 PD2 PD3 cho vết Trên bảng mỏng nhúng thuốc thử DPPH cho thấy PD1 PD2 làm màu DPPH, chứng tỏ PD1 PD2 có tác dụng chống oxy hóa 4.3 Xác định cấu trúc 4.3.1 Xác định cấu trúc chất PD1 PD1 chất kết tinh màu vàng nhạt, phát huỳnh quang xanh UV 254 nm UV 365 nm, không lên màu với thuốc thử VS thuốc thử FeCl3 Tan CHCl3, MeOH, EtOAc Phổ UV cho đỉnh hấp thu 210 nm, 296 nm, 343,6 nm Dự đốn PD1 coumarin Phổ ESI - MS (negative mode) cho mảnh [M-H]- = 191 gợi ý PD1 có số khối 192 CTPT dự đoán C10H8O4 (Ω = 7) Phổ 1H-NMR cho thấy hai tín hiệu doublet δH 6,28 (1H, d, J = 9,5 Hz) 7,59 (1H,d, J = 9,5 Hz) đặc trưng cho hai proton vòng pyron coumarin Hai proton thơm 25 6,92 (1H, s) 6,84 (1H, s) cho thấy vòng benzen bị vị trí C-6 C-7, đồng thời có tín hiệu δH 3,95 (3H, s) cho thấy nhóm methoxy Phổ 13C-NMR có tín hiệu 10 carbon có tín hiệu δC 161.5 tương ứng với nhóm carbonyl Phân tích liệu phổ 2D-NMR (HSQC, HMBC) xác định nhóm -OCH3 gắn vào C-6 C-7 có gắn nhóm hydroxy Vậy cấu trúc PD1 đề nghị scopoletin, coumarin phổ biến tự nhiên So sánh giá trị phổ PD1 với tài liệu tham khảo Error! Reference source not found., số liệu tương đồng (Bảng 10) Như xác định PD1 scopoletin Bảng 10 Dữ liệu phổ PD1 (CDCl3, 125/500 MHz) scopoletin (CD3OD 400 MHz) C δC (ppm) 10 _-OCH3 161,4 113,3 143,2 107,6 144,2 150,3 103,2 149,8 111,5 56,43 δH (ppm), phân đỉnh, J (Hz) 6,26, d (9,5) 7,59, d (9,5) 6,84 s 6,92 s 3,95, 3H, s Sopoletin [28] δC 164,1 112,6 146,1 109,9 147,1 152,9 103,9 151,4 112,6 56,8 ΔH, m, J (Hz) 6,21 d (9,6) 7,86 d (9,5) 7,13 s 6,78 s 3,81 s Hình 15 Cấu trúc chất PD1 (scopoletin) 4.3.2 Xác định cấu trúc chất PD2 PD2 chất kết tinh không màu, tắt quang với UV254, màu nâu với thuốc thử VS, PD2 Tan CHCl3, tan MeOH EtOAc, Phổ UV cho đỉnh hấp thu 216nm, 260 nm, 292 nm 26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phổ ESI - MS (negative mode) cho mảnh [M-H]- = 167 gợi ý PD2 có số khối 168 , CTPT dự đốn C8H8O4 với độ bất bão hịa Ω = Phổ 13C-NMR PD2 cho tín hiệu có tín hiệu δC 170,0 nhóm -COOH, tín hiệu δC 56,4 nhóm -OCH3; tín hiệu cịn lại carbon nhân thơm tín hiệu δC 152,6 148,6 cho thấy carbon nối với oxi Sơ xác định PD2 có vịng benzene với nhóm -OH, -OCH3, -COOH Phổ 1H-NMR PD2 có tín hiệu proton nhân thơm δH 6,86 (d, J=10 Hz) δH 7,58 7,57 Phân tích phổ 2D-NMR xác định vị trí gắn nhóm : -COOH C-1, -OCH3 C-3 -OH C-4 Cấu trúc PD2 dự đoán acid vanillic So sánh liệu phổ PD2 với tài liệu tham khảo Error! Reference source not found xác định PD2 acid vanillic (Bảng 11) Bảng 11 Dữ liệu phổ chất PD2 (MeOD, 125/500 MHz) acid vanillic (DMSO-d6, 125/500 MHz) C δC (ppm) -OCH3 -COOH 123,1 113,8 148,6 152,6 115,4 125,2 56,4 170,0 δH (ppm), phân đỉnh, J (Hz) 7,57 m 6,86 d (10,0) 7,58 m 3,91 s Acid vanillic [15] δC (ppm) 124,1 116,5 151,4 147,5 114,6 122,9 55,2 167,6 δH (ppm), phân đỉnh, J (Hz) 7,58 d (2,0 Hz) 6,82 d (8,5 Hz) 7,54 dd (8,5 2,0 Hz) 3,89 s Tương tác HMBC Hình 16 Cấu trúc chất PD2 (acid vanilic) 27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 4.3.3 Xác định cấu trúc chất PD3 Chất PD3 dạng chất lỏng không màu, tan CH3Cl, khơng tan MeOH, tan EtOAc Tắt quang UV254, không xuất vết UV365, cho màu nâu vơi thuốc thử VS không lên màu với thuốc thử FeCl3 10% Phổ UV chất PD3 có đỉnh hấp thu 191 nm, 240 nm Phổ khối ESI-MS positive PD3 cho đỉnh [M+H]+ 207,53 m/z suy khối lượng phân tử PD3 206 Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy hợp chất có 13 carbon với carbon bậc IV , carbon bậc III, carbon bậc II carbon bậc I Phổ khối kết hợp với phổ 13C-NMR suy công thức phân tử PD3 C13H18O2 , với độ bất bão hòa Ω = Phổ 13C-NMR cho thấy diện nối đôi (δc 162,6 ;126,9; 135,7 129,0) nhóm carbonyl (δc 197,8) Phổ 13H-NMR có proton gắn với carbon nối đơi (δH 5,82; 5,81 5.90), tín hiệu proton nhóm -CH3 có tín hiệu dạng doublet (1,30 (3H, d, J= 6.4 Hz) 1.02 (3H, s); 1.09 (3H, s) 1.91 (3H, s)) Phổ HMBC cho thấy nhóm -CH3 với tín hiệu proton doublet (H 1,30 (3H, d, J=6,4 Hz) gắn với -CH (δc 68,06, δH 4,40) Phân tích phổ chiều COSY cho thấy tín hiệu proton δH 4.40 tương tác với δH 5,82 (proton C nối đơi) Phổ HMBC có tương tác proton δH 4.40 với carbon δc 79.21 cho thấy có cầu nối -C-OC công thức cấu tạo Với độ bất hịa Ω = 5, PD3 có nối đơi nhóm carbonyl, cấu trúc PD3 có vịng Proton nhóm -CH3 ( H 1,02(s); 1,09(s) 1,91(s)) proton -CH2 (H 2.44 (d, J= 17.0 Hz 2.24 (d, J= 17.0 Hz) có tương tác với carbon bậc IV (δC 79.21), proton C mang nối đôi (H 5.90 5.82) xác định carbon chung vịng Phân tích liệu phổ 1D 2D NMR kết hợp so sánh với liệu tài liệu tham khảo Error! Reference source not found xác định cấu trúc PD3 3,4 dehydrotheaspiron (Bảng 12) 28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng 12 Dữ liệu phổ 13C – NMR (125 MHz) 1H–NMR (500 MHz) PD3 đo CDCl3 C δC (ppm) 68,0 135,7 129,0 79,2 162,6 126,9 197,9 49,7 10 11 12 13 14 41,1 23,7 24,0 22,9 18,8 δH (ppm), phân đỉnh, J (Hz) 4,40 d (5,9) 5,83 d (7,0) 5,81 d (15,5) 5,90 s 2,44, d (17,0); 2,24, d (17,0) 1,30 d (6,4) 1,02 s 1,09 s 1,91 s 3,4 dehydrotheaspiron [43] δC δH (ppm), phân đỉnh, J (Hz) (ppm) 67,9 4,13 dq (0,9; 6,0) 135,7 5,87 dd (6,0; 15,5) 128,8 5,78 dd (0,9; 15,5) 79,0 163,1 126,8 5,90 s 198,2 49,7 2.24 d (17,1); 2,46 d (17,1) 41,1 23.7 1,30 d (6.0) (3H) 24.0 1,00 s (3H) 22.9 1,08 s (3H) 18.9 1,90 s (3H) Tương tác HMBC Hình 17 Cấu trúc chất PD4 số tương tác HMBC quan trọng 29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BÀN LUẬN Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật cho thấy có diện nhóm hợp chất, tannin, flavonoid, acid hữu tương tự báo cáo sơ thành phần hóa thực vật báo cáo trước Error! Reference source not found Sự diện chất đóng vai trị định cho hoạt tính sinh học Phù dung hợp chất phân lập từ phân đoạn DCM phù dung là: scopoletin (PD1), acid vanilic (PD2), 3,4-dehydrotheaspiron (PD3) Scopoletin (PD1) chất thuộc nhóm coumarin đơn giản thường tìm thấy Chất tìm thấy lần rễ khoai lang Ipomoea batatas (họ Convonvulaceae) Thử nghiệm in vitro liều 1-50 µg/ml, scopoletin ức chế giải phóng prostaglandin E2 (PGE2) ức chế biểu enzyme liên quan nó, cyclooxygenase (COX-2) phụ thuộc nồng độ Ở liều 100, 200 400 µg / ml, ức chế gia tăng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người cách gây việc bắt giữ chu kỳ tế bào tăng apoptosis Ngoài scopoletin chứng minh nhiều tác dụng hệ tim mạch Theo tài liệu tìm thấy được, lần scopoletin báo cáo tìm thấy Phù dung [8] Acid vanilic (PD2) acid phenolic thường thấy cỏ, có tiền chất acid protocatechuic Hiện chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng sinh học cuả acid vanillic Theo tài liệu tìm được, nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa kháng viêm acid vanillic không cho tác dụng rõ rệt Error! Reference source not found Tuy nhiên kết thử với thuốc thử DPPH, hợp chất thể tính chống oxi hóa rõ 3,4-dehydrotheaspiron (PD3) phân lập lần từ loài Juniperus brevifolia (họ Cupressaceae)Error! Reference source not found Hợp chất tác dụng độc tế bào dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), tế bào ung thư phổi (A549) tế bào ung thư vú (MCF-7) khơng có tác dụng kháng khuẩn Trong nghiên cứu khác, chất 3,4-dehydrotheaspiron phân lập từ loài Laumoniera bruceadepha (họ Simaroubaceae) thể tác dụng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum 3D7 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh nhiên tác dụng kháng viêm chưa thấy báo cáo đề cập đến hợp chất Theo tài liệu thu thập, lần hợp chất phân lập từ loài H.multibilis họ Malvacea Error! Reference source not found Hiện giới cịn tài liệu nghiên cứu thành phần hóa học từ Phù dung Việt Nam chưa có báo cáo Nghiên cứu khẳng định thêm nghiên cứu trước đồng thời góp phần phân tích thành phần hóa học có Phù dung Việt Nam Việc xác định hợp chất phân lập lần đầu Phù dung đóng góp có ý nghĩa cho thành phần hóa học Phù dung Việt Nam Kết luận Đề nghị Kết luận Đề tài thực đầy đủ nội dung đăng kí: - Thu thập mẫu nguyên liệu, định danh - Chiết cao toàn phần, cao phân đoạn - Phân lập xác định chất tinh khiết từ phân đoạn DCM Đề tài cần tiếp tục thực vấn đề sau: - Nghiên cứu thành phần hóa học cao EtOAc (cao C), cao n-BuOH ( cao D) - Thử tác dụng sinh học chất phân lập mơ hình kháng viêm in vitro 31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Bộ môn Dược liệu, Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh (2011), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr 26 – 42 Đỗ Huy Bích (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 524-526 Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt nam (II), Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Võ Văn Chi (1991), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo dục Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học- Hà Nội, tr 108-109 Tiếng Anh Deepak Kumar, Hemanth Kumar, J R Vedasiromoni and Bikas C Pal, "Bio-assay guiđe isolation of α-glucosidase inbibitory constituent from Hibiscus mutabilis leaves", Phytochem Anal (2011) Emiko Iwaoka, Hisae Oku, Yumi Takahashi, And Kyoko Ishiguro "Allergy-preventive effects of Hibiscus mutabilis ‘versicolor’ and a novel allergy-preventive flavonoid glycoside", Biol Pharm Bull 32(3) 509—512 (2009) G J Benoit Gnonlonfin , Ambaliou Sanni & Leon Brimer “Review Scopoletin – A Coumarin Phytoalexin with Medicinal Properties”, (2012) Critical Reviews in Plant Sciences, 31:1, 47-56 Hiroshi Morita,Reika Mori, Jun Deguchi, Shiori Oshimi, Yusuke Hirasawa, Wiwied Ekasari, Aty Widyawaruyanti, A Hamid A Hadi “Antiplasmodial decarboxyportentol acetate and 3,4-dehydrotheaspirone from Laumoniera bruceadelpha” (2012), J Nat Med (2012) 66:571–575 PD3 10 Ignacio Hernández-Chávez, Luis W Torres-Tapia, Paulino Simá-Polanco, Roberto Cedillo-Rivera,Rosa Moo-Puc, and Sergio R Peraza-Sánchez, “Antigiardial Activity of Cupania dentata Bark and its Constituents”,(2011), J Mex Chem Soc 2012, 56(2), 105108 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 11 Laila M Moujir a, Ana M.L Seca b, Liliana Araujo a, Artur M.S Silva c,⁎, M Carmo Barreto.” A new natural spiro heterocyclic compound and the cytotoxic activity of the secondary metabolites from Juniperus brevifolia leave”, (2011), Fitoterapia 82 (2011) 225–229 PD3 12 Meraiyebu, A B c.s (2013) “Anti-inflammatory Activity of Methanolic Extract of Hibiscus sabdariffa on Carrageenan Induced Inflammation in Wistar Rat”, International Journal of Pharmaceutical Science Invention (IJPSI), 2(3), tr 22–24 13 Nariyuki Ishikura (1982) "Flavonol Glycosides in the Flowers of Hibiscus mutabilis f versicolor", Agricultural and Biological Chemistry, 46:6, 1705-1706 14 Sang Wook Chang, Ki Hyun Kim, Il Kyun Lee, Sang Un Choi, Shi Yong Ryu, and Kang Ro Lee “Phytochemical Constituents of Bistorta manshuriensis”, (2009) Natural Product Sciences 15(4) : 234-240 15 Vandana H Barve, S N Hiremath, Shashikant R Pattan and S C Pal, " Phytochemical and Pharmacological Evaluation of Hibiscus mutabilis leaves", J Chem Pharm Res., 2010, 2(1): 300-309 16 Mungole A, Chaturvedi A “Determination of antioxidant activity of Hibiscus sabdariffa L and Rumex nepalensis Spreng” International Journal of Pharma and Bio Sciences 2011;2:120-127 17 George Papadopoulos, Dimltrios Boskou, ( 1991), “Antioxidant Effect of Natural Phenols on Olive Oil”, The Journal of the American Oil Chemists' Society Vol 68, No (September 1991) 18 Raut D N, Patil T B, Chaudhari S R, Pal S C, Mandal S C " Antimitotic Effect of Ethanol Fraction of Hibiscus mutabilis Leaf and Flowers", Research in Pharmacy 4(5): 16-18, 2014 19 S.K Wong, Y.Y Lim and E.W.C Chan, "Evaluation of Antioxidant, anti-tyrosinase and Antibacterial Activevities of Hibiscus Selected species", Ethnobotanical Leaflets 14: 781-96 2010 33 ... thực đề tài " Nghiên cứu thành phần hoá học Phù dung (Hibiscus mutabilis L. )" với mục tiêu: Khảo sát thành phần hoá học Phù dung Phân l? ??p xác định cấu trúc hố học hợp chất từ Phù dung l? ?m sở cho... Cây Phù dung mọc hoang trồng khắp nơi Việt Nam để l? ?m cảnh Hình Tồn hoa Hibiscus mutabilis L 2.2 Thành phần hóa học Theo tài liệu thu thập, thành phần hóa học Phù dung flavonoid Theo nghiên cứu. .. cao dung môi chiết nước 4.1.3 Sơ phân tích thành phần hóa học Kết phân tích sơ thành phần hóa học Phù dung trình bày Bảng Nhận xét: Theo kết khảo sát sơ thành phần hóa học, Phù dung có thành phần