Nghiên cứu điều chế cao định chuẩn từ lá cây lá đắng (vernonia amygdalina del asteraceae)

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN HÙNG ANH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐỊNH CHUẨN TỪ LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del Asteraceae) Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN HÙNG ANH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐỊNH CHUẨN TỪ LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del Asteraceae) Ngành: Công nghệ dược phẩm Bào chế thuốc Mã số: 8720202 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trần Anh Vũ PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người viết lời cam đoan Nguyễn Hùng Anh ii TÓM TẮT Luận văn Thạc sĩ Dược học Khóa 2016 – 2018 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐỊNH CHUẨN TỪ LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del Asteraceae) Nguyễn Hùng Anh Thầy hướng dẫn: PGS.TS Trần Anh Vũ, PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy Mở đầu Những năm gần đây, Lá đắng người dân sử dụng nhiều để hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường cho kết khả quan Có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu chứng minh Lá đắng có tác dụng hạ glucose huyết Tuy nhiên Việt Nam chưa có chế phẩm thuốc từ dược liệu Xuất phát từ thực tế nói trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao định chuẩn từ Lá đắng (Vernonia amygdalina Del Asteraceae)” thực với mục tiêu điều chế xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần từ Lá đắng, làm nguồn nguyên liệu để sản xuất dược phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Lá Lá đắng thu hái tỉnh Tây Ninh, Đắk Lắk An Giang vào tháng 03/2017 Phương pháp nghiên cứu: Bột Lá đắng chiết ngấm kiệt với ethanol 96% thu cao toàn phần Từ cao toàn phần tiến hành phân lập cynarosid kỹ thuật lắc phân bố, kết tinh phân đoạn, tinh chế HPLC điều chế; sử dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng chất cynarosid Xây dựng quy trình định lượng đồng thời cynarosid luteolin nguyên liệu cao HPLC Kiểm tra xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu theo quy định chung DĐVN Khảo sát tối ưu hóa quy trình điều chế cao Lá đắng có hàm lượng hoạt chất khả ức chế ɑglucosidase cao kinh tế Xây tiêu chuẩn cao đặc Lá đắng theo quy định chung DĐVN số tiêu an toàn giới hạn kim loại nặng giới hạn nhiễm khuẩn Nâng cỡ lô chiết cao Lá đắng lô (25 kg dược liệu/ lô) Kiểm tra số tiêu chất lượng để đánh giá tính ổn định quy trình Kết Từ 10 kg Lá đắng chiết 1,2 kg cao ethanol toàn phần Tiếp tục tiến hành phân lập tinh chế thu 85 mg cynarosid Xây dựng thẩm quy trình định lượng cynarosid HPLC để đánh giá chuẩn làm việc (hàm lượng đạt 96,17%) Đã xây dựng thẩm định qui trình định lượng đồng thời cynarosid luteolin nguyên liệu cao HPLC Đã xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu Lá đắng theo quy định chung DĐVN, định tính định lượng dựa vào chất điểm cynarosid luteolin Đã tìm điều kiện để điều chế cao đặc Lá đắng có hàm lượng hoạt chất khả ức chế ɑglucosidase cao kinh tế Cao điều chế phương pháp chiết xuất ngấm kiệt với dung môi ethanol 70%, tỉ lệ dịch chiết: dược liệu 6,5:1 làm khô dịch chiết tủ sấy nhiệt độ 55 oC đến cao đạt độ ẩm 12-15% Đã xây dựng phương pháp điều chế lô cao Lá đắng quy mô pilot (mỗi lô 25 kg dược liệu) Đã đánh giá lô cao tiêu cảm quan, khối lượng làm khơ, định tính định lượng tiêu đạt Đã xây dựng số tiêu để đánh giá chất lượng cho cao đặc Lá đắng cảm quan, khối lượng làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính định lượng Kết luận: Qua trình thực hiện, đề tài đạt nội dung đặt Sản phẩm cao Lá đắng đề tài sau thử tác dụng dược lý sử dụng làm nguyên liệu để bào chế số dạng thuốc theo hướng hạ glucose huyết iii THE ABSTRACT Master’s thesis of Pharmacy Academic course 2016-2018 STUDY ON PREPARATION OF STANDARDIZED CONCENTRATED EXTRACT FROM Vernonia amygdalina Del Asteraceae Nguyen Hung Anh Supervisor: Associate Professor Tran Anh Vu – Associate Professor Huynh Ngoc Thuy Introduction Recently, Vernonia amygdalina is a medical herb that is widely used in the supplementary treatment for patients with diabetes mellitus Some scientific studies show that Vernonia amygdalina has blood glucoselowering effect However, in Viet Nam, the number of products originated from Vernonia amygdalina are still limited As the matter of fact, the topic of “Study on preparation of standardized concentrated extract from Vernonia amygdalina Del Asteraceae” was conducted to prepare and establish standards for concentrated extract from the leaves of Vernonia amygdalina This concentrated extract could be used as material for production medication that potentially supports the diabetes mellitus therapy Subject and Method Subject: Dried leaf of Vernonia amygdalina bulb were harvested from Tay Ninh, An Giang and Dak Lak province in 03/2017 Method: Vernonia amygdalina dried leaf powder was extracted with ethanol 96% using percolation method to make the total concentrated extract Cynarosid was isolated from this concentrated extract using the distribution of liquid-liquid extraction technique, recrystallization of crystals in suitable solvents and preparative HPLC HPLC method was used to determine the quantification of cynarosid HPLC method was also used to establish the simultaneous quantification process of cynarosid and luteolin in dry material and extract The standards of the material were tested and established based on the Vietnamese Pharmacopoeia Optimization the preparation process of Vernonia amygdalina extract which economically yielded high content of active ingredient and the inhibition of α-glucosidase Determination of in-house standards of the Vernonia amygdalina concentrated extract was based on the Vietnamese Pharmacopoeia in relation to the heavy metals and bacteria limit Scaling up three batches of Vernonia amygdalina concentrated extract (25 kg of material/batch) Testing some specifications to evaluate the stability of process Result From 10 kg of dry herba Vernonia amygdalina, 1.2 kg of ethanol concentrated extract was extracted This extract was isolated and refined to obtain 85 mg of cynarosid This study successfully: Established and validated quantification process of cynarosid using HPLC method (the content is 96.17%) Established and validated the simultaneous quantification process of cynarosid and luteolin in dry material and extract using HPLC method The standards of the Vernonia amygdalina material was established based on the Vietnamese Pharmacopoeia Identification and quantification of active ingredient were conducted based on the makers that were cynarosid and luteolin Identified the optimal condition of preparation process of Vernonia amygdalina extract which economically yielded high content of active ingredient and the inhibition of α-glucosidase The preparation method was percolation extraction with 70% ethanol, the ratio liquid extract: dry herb was 6,5:1, the liquid extract was dried by universal oven at 55 oC until the moisture was about 12-15% The preparation method of the three pilot batches of Vernonia amygdalina concentrated extract (25 kg of material/batch) was also established The three pilot batches were tested appearance, moisture, qualitative, quantitative and met the specification standards This study also established specifications of Vernonia amygdalina concentrated extract such as appearance, moisture, total ash, heavy metals limit, bacteria limit, qualitative and quantitative Conclusion This research successfully achieved objectives The Vernonia amygdalina concentrated extract after pharmacological study will be used as material for preparation of some blood glucose-reducing medications iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG VIỆT ii BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG ANH iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 DƯỢC LIỆU LÁ ĐẮNG 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học Lá đắng 1.1.4 Một số nghiên cứu tác dụng dược lý 1.2 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐIỀU CHẾ CAO THUỐC 1.2.1 Một số phương pháp chung chiết xuất dược liệu 1.2.2 Một số nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất cynarosid số chất dược liệu Lá đắng 1.2.3 Cao thuốc 10 1.3 PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC 11 1.3.1 Khảo sát tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase in vitro 11 1.3.2 Qui trình tiến hành phản ứng 13 1.3.3 Một số nghiên cứu khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro 13 1.4 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU VÀ CAO THUỐC 14 1.4.1 Nội dung cách thức xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 14 1.4.2 Nội dung tiêu chuẩn sở cho cao thuốc 15 1.4.3 Một số nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng cynarosid số loại dược liệu cao thuốc 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, DUNG MƠI HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Dung mơi, hóa chất thiết bị 18 2.1.3 Nơi tiến hành 20 2.1.4 Xử lý số liệu 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 v 2.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu Lá đắng 21 2.2.2 Phương pháp điều chế cao Lá đắng 33 2.2.3 Nâng cấp cỡ lô cao Lá đắng 38 2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cao Lá đắng 39 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42 3.1 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 42 3.1.1 Điều chế đánh giá chuẩn làm việc cynarosid 42 3.1.2 Kiểm tra nguyên liệu Lá đắng 56 3.1.3 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu 76 3.2 PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO LÁ ĐẮNG 77 3.2.1 Khảo sát điều kiện chiết xuất 77 3.2.2 Khảo sát điều kiện phù hợp điều chế dịch chiết Lá đắng 79 3.2.3 Điều chế dịch chiết 81 3.2.4 Khảo sát điều kiện điều chế cao đặc từ dịch chiết 81 3.3 NÂNG CẤP CỠ LÔ CAO LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 82 3.3.1 Khảo sát số thông số kỹ thuật 82 3.3.2 Tiến hành chiết xuất điều chế cao đặc 82 3.4 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO LÁ CÂY LÁ ĐẮNG 85 3.4.1 Kiểm tra chất lượng cao Lá đắng 85 3.4.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cao Lá đắng 87 Chương BÀN LUẬN 89 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa Tiếng Việt DĐVN Dược điển Việt Nam Dược điển Việt Nam TCCS Tiêu chuẩn sở Tiêu chuẩn sở TT Thuốc thử SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng MeOH Methanol EtOH Ethanol DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IR Infrared Hồng ngoại UV Ultraviolet Tử ngoại PDA Photodiode array Dãy quang điện NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối OD Optical density Mật độ quang HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng Sắc ký đồ vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Chương trình pha động methanol nước acid phosphoric 0,2% 16 Bảng 1.2 Chương trình pha động acetoniltril nước acid acetic 0,4% 17 Bảng 1.3 Chương trình pha động acetonitril nước acid formic 0,1% 17 Bảng 2.1 Danh sách hóa chất 18 Bảng 2.2 Chất chuẩn sản phẩm đối chiếu 19 Bảng 2.3 Danh sách thiết bị .19 Bảng 2.4 Kế hoạch thử nghiệm .35 Bảng 2.5 Thành phần chất mẫu thử nghiệm đĩa 96 giếng 37 Bảng 3.1 Bảng so sánh phổ 13C-NMR 1H-NMR CYNA1 cynarosid 49 Bảng 3.2 Kết thăm dò tỷ lệ pha động acetonitril - nước acid phosphoric 0,1% 50 Bảng 3.3 Kết thăm dò tốc độ dòng 51 Bảng 3.4 Kết thăm dò nhiệt độ cột 51 Bảng 3.5 Kết xác định tính tương thích hệ thống .52 Bảng 3.6 Số liệu đường tuyến tính quy trình định lượng cynarosid 54 Bảng 3.7 Kết xác định độ lặp lại mẫu thử 55 Bảng 3.8 Kết xác định độ .55 Bảng 3.9 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật 63 Bảng 3.10 Kết xác định độ ẩm 64 Bảng 3.11 Kết xác định độ tro nguyên liệu 64 Bảng 3.12 Kết định tính flavonoid nguyên liệu 65 Bảng 3.13 Chương trình pha động 66 Bảng 3.14 Kết thông số sắc ký mẫu thử 67 Bảng 3.15 Chương trình pha động 67 Bảng 3.16 Diện tích đỉnh cynarosid luteolin chiết ethanol 70%, methanol 70% 68 Bảng 3.17 Diện tích đỉnh cynarosid luteolin Lá đắng qua lần chiết 68 Bảng 3.18 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn (n=6) 69 Bảng 3.19 Số liệu đường tuyến tính quy trình định lượng cynarosid luteolin 71 Bảng 3.20 Giới hạn phát giới hạn định lượng 72 Bảng 3.21 Kết xác định độ lặp lại mẫu dược liệu 73 Bảng 3.22 Kết xác định độ lặp lại mẫu cao 73 Bảng 3.23 Kết xác định độ mẫu dược liệu .74 Bảng 3.24 Kết xác định độ mẫu cao 74 Bảng 3.25 Kết định lượng cynarosid luteolin nguyên liệu 75 viii Bảng 3.26 Tiêu chuẩn sở dược liệu Lá đắng .76 Bảng 3.27 Kết khảo sát hàm lượng hoạt chất theo phương pháp chiết xuất 77 Bảng 3.28 Kết khảo sát hàm lượng hoạt chất theo nồng độ dung môi chiết 77 Bảng 3.29 Kết khảo sát hàm lượng cynarosid luteolin theo kích thước dược liệu .78 Bảng 3.30 Kết khảo sát hàm lượng cynarosid luteolin theo tỷ lệ dịch chiết: dược liệu 78 Bảng 3.31 Các yếu tố khảo sát khoảng thay đổi 79 Bảng 3.32 Ma trận bố trí thử nghiệm kết .79 Bảng 3.33 Các thí nghiệm mức .80 Bảng 3.34 Kết tối ưu theo phương pháp Box-Wilson 80 Bảng 3.35 Kết thăm dị nhiệt độ làm khơ tủ sấy 81 Bảng 3.36 Kết thăm dị lượng dung mơi làm ẩm 82 Bảng 3.37 Kết thăm dò thời gian làm ẩm 82 Bảng 3.38 Kết đánh giá lô cao Lá đắng qui mô pilot 84 Bảng 3.39 Kết khối lượng làm khô cao 85 Bảng 3.40 Kết tro toàn phần cao 85 Bảng 3.41 Kết định tính phản ứng hóa học 85 Bảng 3.42 Kết định lượng cao đặc Lá Lá đắng 87 Bảng 3.43 Tiêu chuẩn sở cho cao đặc Lá đắng 87 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-25 Phụ lục 3.7 Độ tinh khiết pic cynarosid luteolin mẫu cao Phụ lục 3.8 Độ tinh khiết pic cynarosid luteolin mẫu dược liệu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-26 Phụ lục 3.9 Độ tinh khiết pic cynarosid luteolin mẫu cao thêm chuẩn Phụ lục 3.10 Độ tinh khiết pic cynarosid luteolin mẫu dược liệu thêm chuẩn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-27 Phụ lục 3.11 Các thông số sắc ký độ tinh khiết pic cynarosid luteolin mẫu thử với điều kiện sắc ký chọn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-28 Phụ lục 3.12 Tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn Phụ lục 3.13 Tính tuyến tính Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Phụ lục 3.14 Độ lặp lại độ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-30 Phụ lục 3.15 Thăm dị dung mơi chiết dược liệu Phụ lục 3.16 Thăm dò số lần chiết Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-31 PHỤ LỤC 4: PHIẾU KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CAO, CHỨNG NHẬN PHÂN TÍCH CHUẨN, HỢP ĐỒNG CHUYỂN GIAO CÔNG NGHỆ Phụ lục 4.1 Kết kiểm giới hạn kim loại nặng giới hạn nhiễm khuẩn cao Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-32 Phụ lục 4.2 Giấy chứng nhận phân tích (CoA) chất chuẩn cynarosid luteolin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-34 Phụ lục 4.3 Hợp đồng chuyển giao công nghệ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-35 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-36 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-37 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-38 Phụ lục 4.4 Đơn xin xác nhận tham gia đề tài Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-39 Phụ lục 4.5 Giấy xác nhận nghiệm thu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... phát từ thực tế nói trên, đề tài ? ?Nghiên cứu điều chế cao định chuẩn từ Lá đắng (Vernonia amygdalina Del Asteraceae)? ?? thực với mục tiêu điều chế xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần từ Lá đắng, ... từ thực tế nói trên, khn khổ luận văn cao học, đề tài ? ?Nghiên cứu điều chế cao định chuẩn từ Lá đắng (Vernonia amygdalina Del Asteraceae)? ?? thực với mục tiêu điều chế xây dựng tiêu chuẩn cho cao. .. CHÍ MINH - NGUYỄN HÙNG ANH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO ĐỊNH CHUẨN TỪ LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del Asteraceae) Ngành: Công nghệ dược phẩm Bào chế thuốc Mã số: 8720202 Luận văn Thạc