KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (CND và BC) nghiên cứu xử lý sinh khối b clausii để thu bào tử

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SINH KHỐI Bacillus clausii ĐỂ THU BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SINH KHỐI Bacillus clausii ĐỂ THU BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: D HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân – Giảng viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, người ln động viên, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh, tồn thể thầy giáo anh chị kĩ thuật viên môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện, giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu để hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dìu dắt tơi suốt q trình học tập rèn luyện trường Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên, động viên giúp đỡ sống học tập Hà Nội, ngày 20 tháng năm Sinh viên MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Các chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Đặt vấn đề ………………… ………………………………….…… …… Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotics 1.1.1 Định nghĩa …………… ……… ………………………… ………2 1.1.2 Lịch sử phát triển probiotics …… ………………… ………… 1.1.3 Vai trò probiotics … ……………………………… ………… 1.1.4 Các chế phẩm probiotics thị trường ……… …… ….………… 1.2 Bacillus clausii 1.2.1 Bacillus clausii ……….………………… ………… ……………….5 1.2.2 Bào tử Bacillus clausii …………………………… ………………….7 1.3 Sự hình thành bào tử phương pháp thu bào tử 1.3.1 Sự hình thành bào tử ……………… ……………………………… 10 1.3.2 Sức đề kháng bào tử ……………… ……………………………11 1.3.3 Các phương pháp giải phóng nội bào tử ……………… ……………11 Chương 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất … … …………………… ………… …….14 2.1.2 Máy móc, thiết bị ……… ……….…………… ………………… 15 2.1.3 Môi trường sử dụng …………………………… …… ………….16 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Lựa chọn phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử ………………………………………… ……… 16 trình bảo quản …………… ………………………… ……… ……17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina … ……… ………… 17 2.3.2 Giữ giống thạch nghiêng …………… ………… …………….17 2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống ……………………………… ……… …17 2.3.4 Phương pháp thu bào tử ………………………………… …….……18 2.3.5 Phương pháp đếm số lượng bào tử sống lượng sản phẩm thu theo nguyên tắc pha loãng liên tục ……… ……… ………… 20 2.3.6 Kiểm tra khả bào tử bị nảy mầm trở lại điều kiện bảo quản .21 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Lựa chọn phƣơng pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa b Xử lý nhiệt sinh khối tế bào tạo nguyên liệu thô……… ……………22 Giải phóng nội bào tử từ ngun liệu thơ phương pháp vật lý (phương pháp siê Giải phóng nội bào tử từ nguyên liệu thô phương pháp hóa học …………………………………………………….…………………………24 Sử dụng tác nhân sinh học (enzyme lysozyme) …………… …….29 trình bảo quản 2SO4 10% (80˚C).………….32 3.2.2 Khảo sát khả bào tử bị nảy mầm trở lại trình bảo quản 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………… …….…………….……… 36 Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAD Antibiotic Associated Diarrhea Bệnh tiêu chảy liên quan đến kháng sinh ADN Acid Deoxyribo Nucleic ATTC American Type Culture Bảo tàng giống vi sinh vật Mỹ B clausii Bacillus clausii B subtilis Bacillus subtilis B coagulans Bacillus coagulans CFU Colony Forming Units E coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic acid IBD Inflammatory Bowel Diseases Bệnh viêm ruột cấp LAB Lactic Acid Bacteria Nhóm vi khuẩn lactic SDS Sodium Dodecin Sulfate Số đơn vị khuẩn lạc DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2: Các máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu 3.3: 2SO4 Bảng 3.2: Kết đếm số lượng bào tử sống sót sau trình xử lý tác nhân H2SO4 10% (80°C) lysozyme DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: VSL#3 hỗn hợp gồm lồi Streptococcus, lồi Bifidobacterium lồi Lactobacillus Hình 1.2: Sản phẩm Yakult tiếng Yakult Nhật Bản công bố có chứa L casei Shirota Hình 1.3: Sản phẩm Biosubtyl-II công ty vacxin sinh phẩm số 2, Nha Trang, Việt Nam đóng gói dạng gói bột uống chứa bào tử B subtilis Hình 1.4: Bào tử B clausii Hình 1.5: Bào tử B coagulans Hình 1.6: Mặt cắt ngang bào tử Bacillus subtili Hình 1.7: Chế phẩm Erceflora cơng ty Sanofi – Aventis đóng gói tỷ bào tử 5ml Sản phẩm lưu hành Philippines Hình 1.8: Chế phẩm Probacin công ty INPHARM, s.r.o., ČR chứa tỷ bào tử B clausii / 10ml Sản phẩm lưu hành cộng hịa Sec Hình 1.9: Chế phẩm Enterogermina cơng ty Sanofi – Aventis Hình 1.10: Sự hình thành bào tử Hình 3.1: Hình ảnh tiêu ngun liệu thơ Hình 3.2: Hình ảnh sau xử lý NaOH 20% 80°C 80 phút Hình 3.3: Hình ảnh tiêu sau xử lý sinh khối với H2SO4 10% 80°C 80 phút Hình 3.4: Hình ảnh tiêu sản phẩm xử lý lysozyme tỷ lệ 40ml lysozyme (1mg/ml)/1g nguyên liệu thô 120 phút Hình 3.5: Biểu đồ thể tương quan % sinh khối sau xử lý so với nguyên liệu ban đầu phương pháp NaOH, H2SO4 10% (80°C) lysozyme Bacillus Trong nhóm Bacillus sử dụng làm probiotics, chi B clausii B clausii , v “Nghiên cứu xử lý sinh khối B clausii để thu bào tử” với mục tiêu Lựa chọn phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử Khảo sát trình bảo quản bào tử sau xử lý ảy mầm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotics: 1.1.1 Định nghĩa: Thuật ngữ probiotics thuật ngữ dùng để vi khuẩn có lợi cho người động vật [32] 1.1.2 Lịch sử phát triển probiotics: Các vi khuẩn có lợi cho thể người phát từ kỷ trước Nhóm vi khuẩn lactic (LAB) Elie Metchnikoff (1845 – 1916) phát ông nghiên cứu mối liên quan chế độ ăn có sử dụng sữa lên men với đời sống khỏe mạnh người nơng dân Bulgari Cùng thời gian đó, lần Bifidobacterium bác sĩ nhi khoa người Pháp Henry Tissier - phân lập từ phân đứa trẻ sơ sinh bú mẹ Chi Bacillus sử dụng chế phẩm sinh học thời gian dài với chế phẩm biết đến nhiều Enterogermina (được đăng ký Italy năm 1958) [30] Hiện nay, probiotics đưa vào chế phẩm nhiều dạng: thuốc, thực phẩm, thực phẩm chức Ngoài chi Lactobacillus Bifidobacterium probiotics sử dụng phổ biến lâu đời Enterococcus, Bacillus, Streptococcus Pediococcus ứng dụng rộng rãi [11] 1.1.3 Vai trò probiotics:  Điều trị tiêu chảy nguyên nhân: - Do sử dụng kháng sinh (AAD): Một nghiên cứu Mỹ năm 2006 rằng: Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, hỗn 30 Rửa lại sinh khối, n theo quy trình nêu mục 2.3.4 (c) cân lượng bào tử thu Kết quả: Sau 120 phút, hình ảnh tiêu cho thấy rõ có nhiều mảnh vỡ tế bào, khơng phát cịn dạng tế bào sinh dưỡng tế bào sinh dưỡng chứa nội bào tử Sau rửa, thu hình ảnh tiêu có bào tử tinh khiết Hình 3.4: Hình ảnh tiêu sản phẩm xử lý lysozym tỷ lệ 40ml lysozym (1mg/ml)/1g nguyên liệu thô 120 phút Kết cân sinh khối sau xử lý: c xử lý: 0,50g : 0,40g Tỷ lệ % sinh khối sau xử lý so với sinh khối trước xử lý: Nhận xét, : lysozym s ( ) 39 [3] enzym S lysozym 2SO4 : 80˚C xử lý NaOH 10% 10% 2SO4 lysozym Khối lượng Khối lượng (g) (g) k.l NaOH 0,5 0,07 14% (++) H2SO4 0,5 0,21 42% (+) Lysozym 0,5 0,40 80% (-) Hình 3.5: Biểu đồ thể tương quan % sinh khối sau xử lý so với nguyên liệu ban đầu phương pháp NaOH 10%, H2SO4 10% (80°C) lysozym 3.1 đồ thị 3.5 lysozym cao (80%), H2SO4 (14%) P phương cho ng H2SO4 tốt phương pháp hóa học vật lý lysozym ( kh ) Như v , phương pháp xử lý tiến hành, phương pháp sinh học hiệu nhất, sản phẩm thu dạng tế bào sinh dưỡng, sinh khối thu đạt tỷ lệ cao so với nguyên liệu ban đầu Tuy nhiên, giá thành lysozym cao, đẩy cao chi phí sản xuất Vì vậy, cần tìm lượng lysozym thấp hiệu xử lý dạng sinh dưỡng nguyên liệu thô chứa bào tử để tiết kiệm chi phí sản xuất, giảm giá thành sản phẩm b Sử dụng lysozym với tỷ lệ khác nhau: Tiến hành: Lấy 0,5 g nguyên liệu thô 2.3.4 (a), ủ với 30ml dung dịch lysozym 37°C 120 phút mục 2.3.4 (c) lysozym ướt : 40, 20, 15, 10ml Kết quả: Với thể tích lysozym (1mg/ml)/1g sinh khối 40, 20, 15ml, hình ảnh tiêu nhìn thấy bào tử tinh khiết, không phát dạng tế bào sinh dưỡng dạng tế bào sinh dưỡng chứa nội bào tử Với 10ml lysozym (1mg/ml) dùng cho 1g nguyên liệu thơ tiêu sau xử lý bắt đầu thấy xuất dạng sinh dưỡng bắt màu xanh nằm lẫn với bào tử bắt màu đỏ Nhậ : Kết cho thấy, lượng lysozym thấp cịn đạt hiệu xử lý giải phóng nội bào tử 15ml lysozym (1mg/ml)/1g sinh khối ướt Tỷ lệ thấp 2,6 lần so với tỷ lệ sử dụng nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Hiền (40ml lysozym (1mg/ml)/1g sinh khối) [3] Điều có ý nghĩa việc tiết kiệm chi phí sản xuất, giảm giá thành sản phẩm Nếu tiếp tục giảm tỷ lệ lysozym xuống 10ml lysozym (1mg/ml)/1g sinh khối ướt điều kiện ủ 37°C 120 phút cịn tế bào sinh dưỡng chưa bị phá vỡ, với lượng sinh khối, thể tích lysozym giảm xuống làm tăng nồng độ chất, nồng độ enzym giảm xuống làm giảm khả tiếp xúc enzym chất, làm giảm hiệu xử lý giải phóng nội bào tử lysozym Tóm lại, kết phần 3.1 cho thấy , enzym lysozym lysozym 15ml lysozym ướt, ủ 37°C 120 phút enzym lysozym Tác nhân H2SO4 (10%, ủ 80°C 80 phút) tác nhân giải phóng nội bào tử tốt tác nhân vật lý, hóa học (làm giảm dạng tế bào sinh dưỡng, tỷ lệ sinh khối lại 42%) Mặt khác, H2SO4 lại tác nhân dễ kiếm, rẻ tiền, chất lượng ổn định Cho nên, việc sử dụng phương pháp để giải phóng nội bào tử Bacillus cần nghiên cứu thêm 3.2 Khảo sát bào tử sau xử lý nảy mầm trình bảo quản: S , sau thu dạng bào tử B clausii, cần mức độ bào tử bị nảy mầm 3.2.1 lysozym 2SO4 10% (80˚C): : Một yêu cầu quan trọng bào tử thu sau q trình xử lý phải có tỷ lệ sống cao (sản phẩm bào tử, tỷ lệ sản phẩm thu so với nguyên liệu ban đầu cao (80%)) enzym Thí nghiệm thực để so sánh bào tử thu sau trình xử lý nhân lysozym 2SO4 10% (80˚C) Tiến hành: lysozym 2SO4 2.3.5 Kết quả: : Bảng 3.2: Kết đếm số lượng bào tử sống sót sau q trình xử lý tác nhân H2SO4 10% (80°C) lysozym Số (g) (cfu) (cfu) H2SO4 10 0,21 120×10 0,40 > 300×10 571×10 10 10% Lysozym 13 > 75×10 14 1mg/ml Nhận xét: Kết bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ bào tử sống/1g sinh khối sau xử lý phương pháp lysozym nhiều nhiều so với phương pháp H2SO4 10% (gấp 1000 lần), thêm vào đó, bào tử thu phương pháp lysozym tinh khiết bào tử thu phương pháp H2SO4 10% (80°C) Do đó, chất lượng bào tử thu sau xử lý phương pháp lysozym cao nhiều chất lượng bào tử thu sau phương pháp xử lý H2SO4 10% (80°C) Mặt khác, khối lượng bào tử thu sau xử lý lượng sinh khối ban đầu (0,5g) phương pháp sử dụng lysozym 0,4g cao gấp lần phương pháp sử dụng H2SO4 10% 80°C (0,21g) Như vậy, phương pháp sử dụng lysozym xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử hiệu phương pháp tiến hành chất lượng số lượng bào tử 3.2.2 Khảo sát khả bào tử bị nảy mầm trở lại trình bảo quản: Trên thị trường nay, chế phẩm chứa bào tử bào chế dạng hỗn dịch uống (trong nước) chế phẩm khơ (gồm có dạng bột uống, viên nén, viên nang) Trong điều kiện bảo quản bào tử nảy mầm trở lại làm giảm chất lượng nguyên liệu chế phẩm chứa bào tử Nguyên nhân tạp chất chưa loại q trình xử lý Các thí nghiệm nhằm xác định nguyên liệu bào tử tạo có bị nảy mầm điều kiện bảo quản thông thường bảo quản khô bảo quản nước hay khơng Bên cạnh tiến hành kiểm tra xem q trình bảo quản, bào tử có cịn khả nảy mầm điều kiện thuận lợi không Tiến hành: Bào tử thu đượ thí nghiệ lysozym chia thành phần Bảo quản điều kiện: - Một phần đem sấy khô 60°C cất túi polymer, bảo quản bình hút ẩm - Một phần bảo quản nước cất hấp tiệt trùng, để yên điều kiện nhiệt độ phòng Tại thời điểm 1, 3, tháng, theo dõi màu sắc mùi mẫu lưu lấy mẫu làm tiêu theo Ogieska xem bào tử có bị nảy mầm điều kiện bảo quản hay không Đồng thời dùng que cấy vô trùng cấy bào tử vào môi trường dinh dưỡng hấp tiệt trùng, đem nuôi cấy máy lắc ổn nhiệt điều kiện 37°C, tốc độ lắc 110 vòng/phút 24 Sau 24 giờ, thu mẫu làm tiêu bản, đọc kết Kết quả: Sau tháng kết theo dõi khơng có thay đổi: Cảm quan: - Trong mơi trường lỏng, bào tử màu trắng ngà, lắng đáy lọ, phần nước suốt, không màu, không mùi - Trong điều kiện bảo quản khô, nguyên liệu bào tử có màu nâu nhạt, khơ, khơng mùi Hình ảnh tiêu bản: Ở mẫu lưu, tiêu có bào tử màu đỏ Kết ni cấy: Với mẫu lưu, bào tử phát triển làm đục mơi trường dinh dưỡng Hình ảnh tiêu bả ni cấy hình ảnh trực khuẩn Gram (+) Nhận xét: Trong điều kiện thời gian theo dõi tháng nguyên liệu chứa bào tử tạo quy trình xử lý với tác nhân lysozym đảm bảo yếu tố là: không nảy mầm điều kiện bảo quản nảy mầm điều kiện thuận lợi Tóm lại, kết mục 3.2 cho thấy lysozym đạt 75×10 14 bào tử/1g sinh khối sau xử lý ,m enzym lysozym enzym lysozym ,đ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Trên sở kết thí nghiệm tiến hành, đề tài đạt số kết luận sau: 1.1 Lựa chọn phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để tạo nguyên liệu chứa bào tử: Bacillus clausii (SDS, EDTA, NaOH, H2SO4 Sau trình xử lý lysozyme thu bào tử tinh khiết, tỷ lệ khối lượng bào tử so với sinh khối ban đầu cao (80%) Tỷ lệ enzyme lysozyme thấp đạt hiệu xử lý 15ml lysozyme (1mg/ml)/1g sinh khối ướt điều kiên ủ 37°C 120 phút Phương pháp sử dụng H2SO4 10% (80°C, 80 phút) cho kết hầu hết dạng sinh dưỡng tỷ lệ sinh khối lại thấp (42%) 1.2 lý m trình bảo quản: sau 13 lysozyme 25×10 cfu/1g nguyên liệu 2SO4 ) 10% 80˚C (571×10 10 , cfu/1g nguyên liệu , n c: , , ngà Kiến nghị: Do hạn chế thời gian hóa chất nghiên cứu, để đề tài hoàn thiện cần tiếp tục nghiên cứu sau: - Ngh khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu giải phóng nội bào tử tác nhân H2SO4 (nồng độ, nhiệt độ xử lý, thời gian xử lý, chất xúc tác…) - Theo dõi độ ổn định bào tử thu sau trình xử lý bào tử ) TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: - Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại Học Dược Hà Nội (2007), Vi sinh vật học, Hà Nội, tr 22 – 24 - Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 31- 35 - Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội - Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp, Nguyễn Văn Vinh (2009), “ Bàn khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotics”, Tạp chí dược học, 393, Y tế, tr 4- - Mai Phương Hoa (2012), Thực hành kỹ thuật di truyền, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, thành phố Hồ Chí Minh, tr 11- 12 - Trần Thu Hoa (2002), Nghiên cứu khả dùng bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp làm nguyên liệu thuốc chủng ngừa qua niêm mạc, luận án tiến sĩ Dược học, trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr 33- 35 - Nguyễn Duy Long, Phan Tố Như, Nguyễn Minh Nhựt, Hoàng Quốc Khánh (2007), “Tuyển chọn chủng Lactobacillus sinh tổng hợp polyhydroxybutyrate”, báo cáo nghiên cứu khoa học, Phòng vi sinh ứng dụng, Viện sinh học nhiệt đới - Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, tr 54 – 55 - Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh, Nxb Giáo dục - Đặng Thị Thu (2012), Công nghệ Enzyme, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 25- 29 Tiếng Anh: - Adam JK, Bharti O, Naidu KSB (2012), “Probiotics: Recent understandings and biomedical applications”, Curr Trends in Biotechnol.Pharma., 6, p 1-14 - A.L Hart, A.J Stagg, M.A Kamm (2003), Journal of Clinical Gastroenterology, 36, p 111- 119 - Barbosa TM, Serra CR, La Ragione RM, Woodward MJ, Henriques AO (2005), “ Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract”, Appl Environ Microbio, 71, p 968978 - C Ganesh Kumar, Han-Seung Joo, Yoon-Mo Koo, Seung R Paik and Chung-Soon Chang (2004), “Thermostable alkaline protease from a novel marine haloalkalophilic Bacillus clausii isolate”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20, p 351–357 - Delia, P., Sansotta, G., Donato, V., Frosina, P., Messina, G., De Renzis, C., Famularo, G (2007), “Use of probiotics for prevention of radiation-induced diarrhea”, World Journal of Gastroenterology, 13 (6), p 912-915 - Fooks, L.J., Fuller, R., Gibson, G.R (1999), “Prebiotics, probiotics and human gut microbiology”, International Dairy Journal, 9(1), p 53-61 - J.C Lieske, D.S Goldfarb, C De Simone, C Regnier (2005), “Use of a Probioitic to Decrease Enteric Hyperoxaluria”, Kidney International, 68(3), p 1244–1249 - K.C Anukam, E Osazuwa, G.I Osemene, F Ehigiagbe, A.W Bruce, G Reid (2006), “Azole vaginal gel to treat symptomatic bacterial vaginosis”, Microbes and Infection, 12, p 2772 - K Kukkonen, E Savilahti, T Haahtela, K Juntunen-Backman, R Korpela, T Poussa, T Tuure, M Kuitunen (2007), “Probiotics and prebiotic galacto-oligosaccharides in the prevention of allergic diseases: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial”, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 119(1), p 192- 198 - K Suresh Babu Naidu, Jamila K Adam, Patrick Govender (2012), “The use of probiotics and safety concerns”, African Journal of Microbiology Research, 6(41), p 6871-6877 - L.A Simons, S.G Amansec, P Conway (2006), Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases, 16(531) - L Nicholson, Nobuo Munakata, Gerda Horneck, Henry J Melosh and Peter SetlowWayne (2000), “Resistance of Bacillus Endospores to Extreme Terrestrial and Extraterrestrial Environments”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(3), p 548- 572 - Nicholson, W.L and P Setlow (1990), “Sporulation, germination, and outgrowth”, pp 391 – 450 - N K Asha Devi1, K Balakrishnan, R Gopal and S Padmavathy (2008), “Bacillus clausii MB9 from the east coast regions of India: Isolation, biochemical characterization and antimicrobial potentials”, Current science, 95, p 627- 636 - Preben Nielsen, Dagmar Fritze and Fergus G Priest (1995), “Phenetic diversity of alkaliphilic Bacillus strains: proposal for nine new species”, Microbiology, 141, p 1745-1761 - Rosa Lippolis, Antonio Gnoni, Anna Abbrescia, Damiano Panelli, Stefania Maiorano, Maria Stefania Paternoster, Anna Maria Sardanelli, Sergio Papa, Antonio Gaballo (2011), “Comparative proteomic analysis of four Bacillus clausii strains: Proteomic expression signature distinguishes protein profile of the strains”, Journal of proteomics, p - 10 - Saavedra, J (2000), “Probiotics and infectious diarrhea”, The American Journal of Gastroenterology, 95 (1), p 16-18 - Spinosa MR, Braccini T, Ricca E, De Felice M, Morelli L, Pozzi G, Oggioni MR (2000), “On the fate of ingested Bacillus spores”, Res Microbiol, 151, p 361-368 - Tran C Dong, Pham H Van, Simon M Cutting (2009), “Bacillus Probiotics”, School of Biological Sciences, Royal Holloway University of London, Egham, Surrey, TW20 0EX, UK - World Gastroenterology Organisation (2011), “Global Guidelines: Probiotics and prebiotics” - World Health Organization, Food and Agriculture Organization of the United Nations (2011), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria” Một số trang web: - http://www.anabio.com.vn/vn/san-pham-va-dich-vu/bacillusclausii - http://www.atcc.org - http://eurekamag.com/keyphrase/b/001/bacillus-clausii.php - http://www.lekynainternetu.cz/p/probacin/ - http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_clausii - http://www.mims.com/Philippines/drug/info/Erceflora - http://www.sporegen.com/bacilluspro.html ... 80°C 80 phút để xử lý sinh khối chứa b? ?o tử Bacillus clausii khơng có hiệu tách b? ?o tử khỏi vỏ tế b? ?o, tiêu có dạng tồn B clausii dạng tế b? ?o sinh dưỡng, b? ?o tử tự nội b? ?o tử nằm tế b? ?o sinh dưỡng... dạng b? ?o tử Vì thế, sinh khối thu sau q trình có dạng: tế b? ?o sinh dưỡng chết, b? ?o tử tự nội b? ?o tử nằm tế b? ?o sinh dưỡng Để thu nguyên liệu chứa b? ?o tử tinh khiết, cần phải phá vỡ tế b? ?o sinh. .. 9 Bacillus Trong nhóm Bacillus sử dụng làm probiotics, chi B clausii B clausii , v ? ?Nghiên cứu xử lý sinh khối B clausii để thu b? ?o tử? ?? với mục tiêu Lựa chọn phương pháp xử lý sinh khối Bacillus