NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CN CHIẾT XUẤT ĐỂ TẠO SẢN PHẨM CÓ GIÁ TRỊ TỪ QUẢ TÁO MÈO Ở VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ XUÂN DUY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ CHIẾT XUẤT ĐỂ TẠO SẢN PHẨM CÓ GIÁ TRỊ TỪ QUẢ TÁO MÈO (DOCYNIA INDICA (WALL.) DECNE) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 9.52.03.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HĨA HỌC HÀ NỘI – 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Vũ Đình Hồng Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Nguyễn Mạnh Cường Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN  BÀI BÁO QUỐC TẾ Xuan Duy Le, Manh Cuong Nguyen, Dinh Hoang Vu, Minh Quan Pham, Quoc Long Pham, Quang Tung Nguyen, Tuan Anh Nguyen, Van Thinh Pham, Long Giang Bach, Tuong Van Nguyen “Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Total Phenolic and Total Flavonoid from Fruits of Docynia indica (Wall.) Decne Using Response Surface Methodology” Processes 7.8 (2019): 485 (SCI-E, Q2), Doi:10.3390/pr7080485 Le Xuan Duy, Le Ba Vinh, Gao Dan, Vu Dinh Hoang, Tran Quoc Toan, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong “Soluble epoxide hydrolase inhibitors from Docynia indica (Wall.) Decne.” Nat Prod Res (2020): 1-6 (SCI-E, Q2), DOI: 10.1080/14786419.2020.1774759  BÀI BÁO TRONG NƯỚC Lê Xuân Duy, Trần Quốc Toàn, Lê Tất Thành, Cầm Thị Ính, Đỗ Hữu Nghị, Hà Việt Hải, Vũ Đình Hồng, Đỗ Thị Nguyệt, Phạm Quốc Long “Một số kết nghiên cứu thành phần hóa học táo mèo (Docynia indica Wall.) Việt Nam” Tạp chí Khoa học cơng nghệ, tập 53 số 4C (2015) Tr 81-87 Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Do Huu Nghi, Le Tat Thanh, Vu Dinh Hoang, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong “Triterpene acids from Docynia indica fruits and their cytotoxic activity” Vietnam J Technol 56 (2018): 199-204 Le Xuan Duy, Nguyen Manh Cuong, Vu Dinh Hoang, Pham Minh Quan, Lai Phuong Phuong Thao, Pham Quoc Long, Tran Quoc Toan “Process optimization for the extraction of phenolics from the fruits of Vietnam Docynia indica (Wall.) Decne.” Proceeding of international workshop (2019), pp 506513 (ISBN:978-604-965-263-9) MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Từ xa xưa, người biết sử dụng nguồn thực vật tự nhiên để chăm sóc sức khỏe, phịng ngừa điều trị bệnh Trong năm trở lại đây, xu hướng sử dụng loại thảo dược phòng chữa bệnh ngày gia tăng Ngày nay, thảo dược không sử dụng dạng thô theo y học cổ truyền mà áp dụng công nghệ đại lĩnh vực Hóa học, Sinh học kết hợp cơng nghệ bào chế để tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, tính chất dược lý mạnh Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc thù nên có nguồn thực vật phong phú đa dạng ước tính có 13.000 nghìn lồi Theo y học dân tộc, có 4000 lồi sử dụng làm thuốc chăm sóc sức khỏe người Với định hướng phát triển loài dược liệu để phục vụ đời sống, nước ta hình thành nhiều khu vực canh tác, trồng dược liệu quy mô lớn Đặc biệt, Tại số Tỉnh Tây bắc Yên bái, Sơn la, Điện biên năm gần phát triển mạnh loài táo mèo để phục vụ nhu cầu người tiêu dùng Táo mèo có tên khoa học Docynia indica (Wall.) Decne, thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) Ở nước ta, táo mèo phân bố độ cao từ 1500m đến 2000m tỉnh vùng núi Tây Bắc Theo Y học cổ truyền, táo mèo có vị chua chát, ngọt, tính ấm, có tác dụng kiện vị, thuộc nhóm tiêu thực hóa tích, chủ yếu điều trị chứng rối loạn tiêu hóa ăn nhiều thịt, dầu mỡ, ăn không tiêu, giúp ăn ngon miệng Quả táo mèo sấy khô vị thuốc Đông y giúp dịch vị tăng tiết axit mật pepsin dịch vị, chống rối loạn chuyển hóa lipit giảm mỡ máu… Các nghiên cứu đại gần cho thấy dịch chiết táo mèo có tác dụng kháng khuẩn, chống rối loạn trao đổi glucid lipid; Một số thành phần hóa học phân lập từ táo mèo có tác dụng có tác dụng kháng viêm hạ đường huyết Việc nghiên cứu, chế biến táo mèo tạo sản phẩm chăm sóc sức khỏe, hỗ trợ điều trị số bệnh lý quan tâm Tuy nhiên nay, nghiên cứu táo mèo nước cịn khiêm tốn Do đó, cần nghiên cứu sâu thành phần hóa học hoạt tính sinh học táo mèo đồng thời mở rộng nghiên cứu công nghệ khai thác, làm giàu thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao (cụ thể nhóm hoạt chất phenolic) táo mèo để đáp ứng yêu cầu bào chế tạo sản phẩm có chất lượng cao Từ vấn đề nêu trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học xây dựng quy trình cơng nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hóa học thăm dị hoạt tính sinh học thành phần hóa học táo mèo; Nghiên cứu tối ưu quy trình cơng nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm từ táo mèo Các nội dung nghiên cứu luận án  Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc số thành phần hóa học phân đoạn cao chiết ethyl acetate táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne): Điều chế cặn chiết, phân lập hợp chất phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học phương pháp hóa lý đại  Đánh giá hoạt tính sinh học: Tác dụng bảo vệ tim mạch, chống oxy hóa ức chế số dịng tế bào ung thư cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn số hợp chất phân lập  Nghiên cứu, tối ưu hóa quy trình cơng nghệ chiết xuất, sấy phun để tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo giàu phenolic quy mơ phịng thí nghiệm Cấu trúc luận án Luận án gồm 148 trang với 76 bảng 63 hình Bố cục luận án cụ thể sau: Mở đầu trang, tổng quan 26 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu trang, thực nghiệm 11 trang, kết thảo luận 87 trang, kết luận kiến nghị 03 trang, danh mục cơng trình cơng bố 01 trang, tài liệu tham khảo 10 trang CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan gồm phần chính: Phần giới thiệu chi táo mèo (Docynia), họ hoa hồng (Rosaceae); thông tin táo mèo, táo mèo phân bố sản lượng táo mèo nước ta; thành phần hóa học tác dụng sinh học táo mèo Phần giới thiệu tình hình khai thác, chế biến sử dụng táo mèo nước ta, công nghệ chế biến táo mèo Phần giới thiệu nhóm hoạt chất phenolic chiếm hàm lượng lớn táo mèo, đặc điểm chung phương pháp chiết xuất phenolic đại Phần giới thiệu phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) tối ưu hóa quy trình cơng nghệ CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne, thu hái Huyện Bắc Yên, Tỉnh Sơn La vào tháng năm 2014 tháng 10 năm 2017 Mẫu nghiên cứu định danh khoa học TS Nguyễn Qc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam - VAST 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp định lượng số thành phần hóa học 2.2.1.1 Phương pháp định lượng phenolic tổng Hàm lượng tổng phenolic xác định theo phương pháp Singleton cộng (1999) cách sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteu chất chuẩn acid gallic Hàm lượng phenolic tổng = C.V/m; Với C: Nồng độ phenolic xác định theo đường chuẩn (µg/mL); V: Thể tích dịch chiết tổng (mL); m: Khối lượng cao chiết thu ứng với lượng mẫu đem chiết (g) 2.2.1.2 Phương pháp định lượng flavonoid tổng Hàm lượng flavonoid tổng xác định theo phương pháp Zhishen cộng (1999) Nguyên tắc phương pháp dựa tạo phức màu vàng flavonoid với dung dịch AlCl3 Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid xác định bước sóng 415 nm Quercetin dùng làm chất chuẩn tham chiếu Hàm lượng flavonoid tổng = C.V/m; Với C: Nồng độ flavonoid xác định theo đường chuẩn (µg/mL); V: Thể tích dịch chiết tổng (mL); m: Khối lượng cao chiết thu ứng với lượng mẫu đem chiết (g) 2.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học 2.2.2.1 Phương pháp chiết xuất + Phương pháp chiết vi sóng: Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng + Phương pháp chiết siêu âm: Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm + Phương pháp chiết hồi lưu: Chiết xuất có gia nhiệt bếp điện, dung môi hồi lưu hệ thống sinh hàn + Phương pháp chiết soxhlet: Sử dụng thiết bị chiết soxhlet để chiết xuất nhằm định lượng cao chiết toàn phần 2.2.2.2 Phương pháp phân lập thành phần hóa học + Sắc ký cột: silica gel pha thường, pha đảo, selphadex + Sắc ký lớp mỏng: thực mỏng tráng sẵn, phát vệt chất soi đèn UV bước sóng 254 365 nm màu thuốc thử 2.2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Kết hợp thơng số hóa lý (điểm nóng chảy, độ quay cực) với phương pháp phổ đại phổ khối lượng (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-, 13 C-NMR DEPT) chiều ( HSQC, HMBC, NOESY ) 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học + Hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) thơng qua chế ức chế enzyme soluble epoxide hydrolase đánh giá dựa việc phân tích huỳnh quang với chất đối chứng dương sử dụng Auda + Xác định hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DPPH (1,1diphenyl-2- picrylhydrazyl) Sự hấp thụ DPPH bước sóng λ = 515 nm xác định máy đọc ELISA sau nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử phiên vi lượng 96 giếng + Hoạt tính gây độc tế bào thử nghiệm phương pháp MTT [3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide] hai dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư cổ tử cung (HeLa) Các thử nghiệm thực Khoa Dược, Trường Đại học Chungnam, Hàn Quốc Phịng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - VAST 2.2.4 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quy trình công nghệ Phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quy trình cơng nghệ áp dụng theo mơ hình bậc hai Box-Willson BoxBehnken tùy vào toán cụ thể Sau xây dựng mơ hình ta cần đánh hội tụ mơ hình thơng qua phân tích phương sai Nếu mơ hình hội tụ ta xác định phương trình hồi quy tiến hành tối ưu hóa thơng số cơng nghệ phương pháp hàm nguyện vọng Harrington (1965) Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0.0 để xây dựng mô hình tối ưu hóa thơng số cơng nghệ q trình CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Điều chế cao chiết tổng cao chiết phân đoạn Quả táo mèo tươi 15 kg phân loại, rửa thái lát Sấy diệt men 1100C 20 phút sấy mẫu tới khô 600C (hàm ẩm ≤ 10%) Táo mèo khơ nghiền mịn máy nghiền (đường kính lỗ sàng 0.2 mm) thu dược kg bột Bột nguyên liệu táo mèo kg chiết siêu âm với methanol nhiệt độ phịng, tỷ lệ dung mơi/ngun liệu (3/1, v/w) Lọc dịch chiết cô đặc máy cô quay áp suất giảm thu 652 g cặn chiết methanol Hòa tan cặn methanol với nước cất chiết phân bố với dung môi độ phân cực tăng dần nhexan, dichloromethane ethyl acetate Tiến hành lọc cô đặc dịch chiết phân bố thu cặn chiết tương ứng cặn n-hexan (36,2 g); cặn dichloromethane (65 g); cặn ethyl acetate (258,8 g) cặn nước (289,4 g) 3.1.1 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn EtOAc táo mèo Lấy 114 g cặn chiết ethyl acetate (EtOAc), tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2/MeOH (100:0  0/100) chia thành phân đoạn ký hiệu từ E1 đến E8 Kiểm tra phân đoạn thu sắc ký lớp mỏng (TLC), màu thuốc thử H2SO4 5% kiểm tra máy soi UV bước sóng 254 nm 365 nm Gom phân đoạn giống cô quay đuổi dung môi thu cao chiết phân đoạn Từ phân đoạn E1 đến E8 tiếp tục tiến hành phương pháp sắc ký để phân lập, thu hợp chất Sơ đồ phân lập thể hình 3.1.1 Hình 3.1.1 Sơ đồ phân lập thành phần hóa học từ táo mèo 3.1.2 Thơng số vật lý kiện phổ hợp chất (xem luận án) 3.2 Quy trình chiết phenolic thiết lập mơ hình nghiên cứu 3.2.1 Chiết xuất phương pháp soxhlet Chuẩn bị dụng cụ chiết soxhlet Cân xác 10g bột nguyên liệu táo mèo cho vào túi giấy lọc, buộc kín Đưa túi lọc chứa nguyên liệu vào ngăn chiết Nạp 500 mL ethanol thực phẩm 96% vào bình cầu 1000 mL Tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu kết nối thiết bị chiết soxhlet Bật bếp điện gia nhiệt lên 650C, thời gian chiết 10 Kết thúc q trình chiết, dịch chiết quay đuổi dung môi để thu cao chiết tổng Sau tiến hành định lượng phân tích hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng Hàm lượng cao chiết tổng Y (%) tính theo khối lượng mẫu đem chiết Kết nghiên cứu sử dụng làm tiêu chuẩn để so sánh với phương pháp chiết phenolic 3.2.2 Chiết xuất sử dụng vi sóng 3.2.2.1 Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo cho vào bình cầu 1000 mL, thêm 500 ml dung môi (được pha với nồng độ ethanol độ pH cần nghiên cứu) vào bình cầu Đưa bình cầu vào lị vi sóng tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu Bật sinh hàn, bật lị vi sóng mức công suất cần nghiên cứu Thời gian chiết xuất tính bắt đầu bật lị vi sóng Kết thúc trình chiết, dịch chiết lọc qua phễu lọc buchner cô đặc thu cao chiết tổng Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) cao chiết 3.2.2.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm yếu tố Z1: Thời gian chiết xuất (phút); Z2: Nồng độ ethanol chiết xuất (%); Z3: Cơng suất vi sóng (W) Z4: Độ pH dung môi chiết Hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lượng flavonoid tổng) Y3 (Hàm lương cao chiết tổng) Các biến mã hóa Z1, Z2, Z3 Z4 ký hiệu A, B, C D Lựa chọn mơ hình khảo sát theo Box-Willson với k = 4, chọn cánh tay địn α = 1.414 số thí nghiệm tâm Tổng số thí nghiệm ma trận 27 thí nghiệm 3.2.3 Chiết xuất sử dụng siêu âm 3.2.3.1 Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo cho vào bình cầu 1000 mL 2000 mL loại cổ, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung mơi 5.4 thêm vào bình cầu tỷ lệ nghiên cứu (theo bố trí thí nghiệm) Lắp sinh hàn, nhiệt kế thiết bị siêu âm đầu dị sau tiến hành gia nhiệt bếp điện, chiết siêu âm điều kiện nhiệt độ, công suất siêu âm thời gian cần nghiên cứu Kết thúc trình chiết, dịch chiết lọc qua phễu lọc buchner cô đặc thu cao chiết tổng Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) cao chiết 3.2.3.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm yếu tố Z1: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w), Z2: Nhiệt độ chiết siêu âm (0C), Z3: Công suất siêu âm (W) Z4: Thời gian chiết (phút) Hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng) Các biến mã hóa Z1, Z2, Z3 Z4 ký hiệu A, B, C D Lựa chọn mơ hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 4, số thí nghiệm tâm Tổng số thí nghiệm ma trận 27 thí nghiệm 3.2.4 Chiết xuất phương pháp hồi lưu 3.2.4.1 Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo cho vào bình cầu 2000 mL, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi 5.4 thêm vào bình cầu tỷ lệ nghiên cứu Lắp sinh hàn tiến hành gia nhiệt bếp điện, chiết hồi lưu điều kiện nhiệt độ thời gian cần nghiên cứu Kết thúc trình chiết, dịch chiết lọc qua phễu lọc buchner cô đặc thu cao chiết tổng Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) cao chiết 3.2.4.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm yếu tố Z1: Thời gian chiết xuất (phút), Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Z3: Nhiệt độ chiết xuất (0C) Hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng) Các biến mã hóa Z1, Z2 Z3 ký hiệu A, B, C Với k = 3, lựa chọn cánh tay đòn α = 1.215 số thí nghiệm tâm Tổng số thí nghiệm ma trận 15 thí nghiệm 3.3 Quy trình sấy phun thiết kế mơ hình 3.3.1 Tiến hành thí nghiệm Dịch sau chiết lọc đặc thu 2.1 lít dịch có hàm lượng chất khơ đạt 15-20% Bổ sung chất trợ sấy maltodextrin với tỷ lệ nghiên cứu vào dịch chiết cô đặc Bật máy khuấy dịch chiết, bật bơm lưu lượng, điều chỉnh lưu lượng dòng cấp ứng với điều kiện nghiên cứu tiến hành trình sấy phun, tác nhân sấy (khí nóng) thổi vào buồng phun dịch Nhiệt độ tác nhân sấy thay đổi theo điều kiện nghiên cứu Thiết bị sử dụng nghiên cứu máy sấy phun Buchi B290 mini spray dryer, tốc độ bơm dịch (15-35 mL/phút), nhiệt độ khí nóng đầu vào (120 – 2200C), lưu lượng khí nóng tối đa 35 m3/giờ, công suất bay L H2O/giờ (Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà nội) Bột sau sấy phun phân tích hàm lượng phenolic tổng hàm ẩm 10 dịch hóa học [δH 6.54 (br s, H-5); 6.52 (d, J= Hz, H-7, TM17a); 6.51 (d, J= Hz, H-7, TM17b)], vòng lactone xuất với tín hiệu cộng hưởng δH 5.61 (t, J= 2.5 Hz, H-3, TM17a); 5.59 (t, J= 2.5 Hz, H-3, TM17b); 3.11 3.07 (H-4a); 3.34 (m, H-4b) Hình 4.1.1.2 Phổ 1H-NMR hợp chất TM17 Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy có 21 tín hiệu ngun tử carbon bao gồm carbon nhóm methylene (-CH2), 12 carbon nhóm methine (-CH) carbon khơng liên kết với hydro Trong có tín hiệu nhóm keton liên kết với nguyên tử oxy (O-C=O) đặc trưng khung dihydroisocoumarin xuất δC 169.25/169.18 ppm, cặp tín hiệu carbon đối xứng vịng B δC (ppm) 128.22/ 128.20 115.18 chứng tỏ vòng B bị vị trí đối xứng vịng (C-1’ C4’), tín hiệu carbon đặc trưng vòng lactone δC (ppm) 80.0 33.66; Bên cạnh xuất tín hiệu carbon độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 99.77/99.67; 73.06; 76.44; 69.51; 77.11 60.52 gợi ý tín hiệu carbon cấu tử đường Trên phổ chiều HMBC thể tương tác proton anomeric δH (ppm) 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) với nguyên tử carbon C-6 phần aglycon Hằng số tương tác proton anomer J= 7.5 – 8.0 Hz cho phép khẳng định đường dạng beta Phổ HMBC thể tương tác H-7 (δH 5.51/5.52) với C-5 (δC 107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-4 (δH 3.08/3.34) với C-5 (δC 107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-5 (δH 6.55) với C-4 (δC 33.66); H-3 (δH 5.61/5.59) với C-10 (δC 142.15), C-6’ (δC 128.22/ 128.20), C2’(δC 128.22/128.20); H-2’(δH 7.32), H-6’(δH 7.32) với C-4’ (δC 157.76); 11 H3’(δH 6.80), H-5’(δH 6.80) với C-1’(δC 128.47/128,45) Các tương tác cho phép xác định vị trí nhóm hydroxyl C-8 C-4’ Hình 4.1.1.3 Phổ 13C-NMR hợp chất TM17 Hình 4.1.1.5 Phổ HSQC HMBC hợp chất TM17 Các tín hiệu phổ 1H-NMR 13C-NMR nêu khẳng định phần aglycon TM17 thunberbinol C [72] Tiến hành thủy phân TM17 chạy sắc ký lỏng hiệu cao với đối chứng chuẩn xác định cấu tử đường phân tử TM17 đường β-D-glucose 12 Hình 4.1.1.6 Sắc ký đồ HPLC xác định cấu tử đường Trong cấu trúc hóa học hợp chất TM17, vị trí carbon C-3 carbon bất đối Do đó, để xác định cấu hình tuyệt đối hợp chất TM17, tiến hành đo phổ lưỡng sắc tròn (phổ CD) Kết phổ CD cho hiệu ứng cotton âm xảy bước sóng 227 nm (Δε -2.29), 255 nm (Δε -4.85) 305 nm (Δε -1.21) Trong hiệu ứng cotton âm xảy mạnh bước sóng 255 nm (Δε -4.85) (Hình 4.1.1.9) Tiến hành so sánh phổ CD hợp chất TM17 với hợp chất có cấu trúc hóa học vị trí carbon bất đối tương tự hợp chất TM17 hợp chất: 3Shydrangenol 4’-O-glucoside, 3S-thunberginol I 4’-O-glucoside 3Sflorahydroside Ở hợp chất vừa nêu, phổ CD chúng xảy hiệu ứng cotton âm mạnh 260 nm (Δε -3.76), 255 nm (Δε -8.30) 255 nm (Δε -0.79) [72-74] Điều hợp chất TM17 phù hợp với cấu hình dạng 3S 3-aryl dihydroisocoumarin Do đó, hợp chất TM17 khẳng định 3S-thunberginol C 6-O-β-D-glucopyranoside Đây hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên Tuy nhiên, phổ 1H-NMR 13C-NMR xuất tín hiệu kép xuất theo cặp tín hiệu sát (như bảng liệu phổ 4.1.1) Chúng đặt giả thuyết hợp chất TM17 tồn đồng thời cấu dạng bền khác nên đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân xảy tượng Để chứng minh cho giả thuyết này, tiến hành tính tốn lý thuyết lượng bền cấu dạng hợp chất TM17 thơng qua việc tính tốn enthalpy tương đối (ΔH) hợp chất này, sử dụng phương pháp DFT (density functional theory method) Kết tính tốn lý thuyết cho thấy 02 cấu dạng nửa thuyền tồn trạng thái lượng bền với ethalpy tương đối H = 0.0 kcal/mol H = 0.2 kcal/mol Điều làm sáng tỏ giả thuyết nêu hợp chất 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside tồn loại cấu dạng bền khác (a/b) 13 Hình 4.1.1.7 Cấu trúc hóa học TM17 (a) Hình 4.1.1.8 Phổ CD TM17 (b) Hình 4.1.1.9 Hai cấu dạng bền kiểu nửa thuyền hợp chất TM17 Bảng 4.1.1 Dữ liệu phổ NMR hợp chất TM17 chất so sánh thunberginol C Vị trí C TLTK (DMSO-d6) [72] δH (ppm) δC (ppm) TM17 (DMSO-d6) δH (ppm) δC (ppm) 169.4 169.25 / 169.18 80.0 5.54 (1H, t, J= 3.0 Hz) 79.7 3.03 (1H, dd, J= 3.0; 17.0 Hz, H-4a) 3.24 (1H, dd, J= 3.0; 17.0 Hz, H-4b) 6.3 (1H, d, J= 2.0 Hz) 33.6 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz) 106.8 164.4 100.9 5.61 (1H, t, J = 2.5 Hz) / 5.59 (1H, t, J = 2.5 Hz) 3.11 (1H, t, J= 2.5 Hz, H-4a)/3.07 (1H, t, J= 2.5 Hz, H-4a) 3.35 (overlap, H-4b) 6.55 (1H, br s) 6.52 (1H, d, J= 2.0 Hz) / 6.51 (1H, d, J = 2.0 Hz) 33.66 107.37 / 107.27 162.99 101.76 14 11.1 (-OH) 163.3 100.3 11.09 (-OH) 142.2 128.6 10 1’ 2’ 7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 128.0 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 3’ 4’ 5’ 6’ 6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 115.1 157.6 115.1 128.0 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz) 6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz) 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/ 4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) 3.24, m 3.37, m 3.18, m 3.2, m 3.46 (1H, m) 3.76 (1H, m) 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ 163.28 102.56 / 102.54 142.15 128.47 / 128.45 128.22 / 128.20 115.18 157.76 115.18 128.22 / 128.20 99.77 / 99.67 73.06 76.44 69.51 77.11 60.52 4.2 Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết hợp chất phân lập 4.2.1 Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) 4.2.1.1 Đối với cao chiết Cao chiết phân đoan n-hexan khơng thể hoạt tính nồng độ 37.5 75 µM, thể hoạt tính thấp 150 µM Các phân đoạn cịn lại thể hoạt tính giảm dần: cao ethyl acetate > cao dichloromethane > cặn nước > cao tổng methanol Bảng 4.2.2.1 Kết đánh giá hoạt tính sEH với cao chiết TT Phân Đoạn cao chiết Dichloromethane Ethyl acetate Cặn nước Nồng độ thử (µM) 37.5 75 150 37.5 75 150 37.5 Phần trăm ức chế I (%) 28.0 ± 3.4 57.9 ± 0.1 83.8 ± 2.7 36.7 ± 2.5 68.7 ± 3.5 92.7 ± 1.2 25.4 ± 1.2 15 10 11 12 Cao tổng methanol 75 150 37.5 75 150 45.9 ± 0.2 68.4 ± 0.1 4.9 ± 0.5 12.8 ± 1.7 21.1 ± 2.2 4.2.2.2 Đối với hợp chất phân lập Có 25 hợp chất thể hoạt tính bao gồm chất TM1, TM5, TM8, TM10, TM16, TM24, TM33 TM37 Giá trị IC50 (µM) hợp chất nằm khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2 Trong đó, hợp chất TM9 TM37 thể hoạt tính mạnh có giá trị IC50 19.3 ± 2.2 10.0 ± 0.6 µM Bảng 4.2.2.2 Kết thử hoạt tính sEH với hợp chất phân lập TT Kí hiệu đối chứng (+) Auda TM1 TM5 TM9 TM10 TM16 TM24 TM33 TM37 Phần trăm ức chế nồng độ 100 µM (%) IC50 (µM) 16.8 ± 0.5 nM 73.3 ± 1.1 72.8 ± 0.2 >100 79.9 ± 0.4 76.8 ± 0.06 74.0 ± 2.8 52.7 ± 0.2 >100 41.9 ± 1.1 30.5 ± 0.1 19.3 ± 2.2 22.9 ± 0.2 24.7 ± 2.5 36.1 ± 0.6 88.4 ± 0.2 10.0 ± 0.6 4.2.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Trong tổng số 25 hợp chất đem thử có tới 14 hợp chất thể hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm khoảng (18.05 ± 0.69 đến 49.34 ± 1.22) Đặc biệt 14 hợp chất thể hoạt tính có hợp chất thể hoạt tính mạnh đối chứng dương hợp chất TM12 có giá trị SC50 18.05 (µg/mL) Bảng 4.2.1 Kết hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập Ký hiệu Đối chứng (+) Ascorbic acid TM1 TM2 Giá trị SC50 (µg/mL) 26.40 ± 0.44 Ký hiệu TM12 Giá trị SC50 (µg/mL) 18.05 ± 0.69 35.48 ± 2.02 31.37 ± 0.12 TM15 TM16 30.12 ± 0,15 33.47 ± 0,51 16 TM3 TM5 TM7 TM9 TM10 28.18 ± 1.18 29.17 ± 1.67 49.34 ± 1.22 29.11 ± 0.17 42.32 ± 0.42 TM17 TM30 TM36 TM37 40.51 ± 0.78 41.81 ± 0.45 42.76 ± 2.12 29,12 ± 0.38 4.2.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cao chiết Chỉ có cao chiết phân đoạn n-hexan dicholoromethane (CH2Cl2) thể hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung hela với giá trị IC50 99.24 µg/mL 67.2 µg/mL Các cao chiết phân đoạn cịn lại khơng thể hoạt tính 4.3 Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết phenolic từ táo mèo quy mơ phịng thí nghiệm 4.3.1 Kết chiết soxhlet thu cao chiết toàn phần Phương pháp chiết soxhet cho hiệu suất chiết cao phương pháp chiết kiệt Hàm lượng cao chiết tổng thu trung bình đạt 36,07% Hàm lượng phenolic tổng hàm lượng flavonoid tổng cao với giá trị trung bình 28,9 (mg GAE/g cao chiết) 20,0 (mg QE/g cao chiết) 4.3.2 Mơ hình nghiên cứu tối ưu quy trình chiết xuất phenolic phương pháp chiết vi sóng 4.3.2.1 Ảnh hưởng yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.3.2.2 Thiết lập mơ hình xác định phương trình hồi quy hàm mục tiêu Từ số liệu thí nghiệm ảnh hưởng thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng tơi lựa chọn mơ hình nghiên cứu theo mơ hình bậc Box-Willson Các mức gốc (hay mức bản) yếu tố hệ số α = 1.414 (với k= 4) thể bảng 4.3.2.2a Bảng 4.3.2.2a Các mức thí nghiệm biến biến công nghệ Tên biến, khoảng biến thiên Biến Khoảng biến Biến thực mã thiên (Δ) Mức nghiên cứu -α -1 +α Z1: thời gian chiết (phút) A 15 15 30 45 51 Z2: Nồng độ ethanol (%) Z3: Công suất máy vi sóng (W) B 20 32 40 60 80 88 C 160 175 240 400 560 625 Z4: độ pH D 1.2 6.8 17 Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 27 thí nghiệm đánh giá hội tụ mơ hình thơng qua phân tích phương sai Kết mơ hình nghiên cứu xác định tương hợp với thực nghiệm Sau loại bỏ yếu tố khơng có ý nghĩa Hàm mục tiêu xác định biểu diễn phương trình hồi quy bậc sau: + Y1 = 29.42 + 2.93A + 0.88B + 1.78C + 0.76D – 0.89AB + 1.09AD – 1.02BC – 1.3B2 – 1.1D2 (1) + Y2 = 21.22 + 2.32A + 0.68B + 0.99C + 0.41D – 0.59AB + 0.62AD – 1.11BC + 0.39BD – 0.92B2 – 0.57D2 (2) + Y3 = 29.65 + 2.55A + 1.06B + 1.05C + 0.61D – 0.46AC + 0.49AD – 0.97BC – 0.91B2 (3) 4.3.2.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Quá trình chiết xuất cần tối ưu cho hàm mục tiêu Y1, Y2 Y3 đạt giá trị lớn Điều giải việc giải toán tối ưu phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với mức độ ưu tiên (từ đến 5) Trong toán này, với mục tiêu đặt ra, lựa chọn mức độ ưu tiên cho hàm mục tiêu sau: Hàm Y1 (mức 5); hàm Y2 (mức 3); hàm Y3 (mức 2) Tại điều kiện thông số công nghệ bảng 4.3.2.4, giá trị dự đoán hàm mục tiêu Y1 = 33.64 (mg GAE/g); Y2 = 25.1 (mg QE/g) Y3 = 33.33 (%) Bảng 4.3.2.3a Kết tối ưu biến công nghệ A 1.34 Biến mã hóa B C D 0.23 0.7 0.26 Thời gian (phút) 50.1 Biến thực Nồng độ Công ethanol suất vi (%,v/v) sóng (W) 64.6 441.6 Độ pH dung mơi 5.4 Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết thực nghiệm với kết tính tốn lý thuyết cho thấy mức độ sai khác nhỏ Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ xác cao 4.3.3 Mơ hình nghiên cứu tối ưu quy trình chiết xuất phenolic phương pháp chiết siêu âm 4.3.3.1 Ảnh hưởng yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.3.3.2 Thiết lập mơ hình xác định phương trình hồi quy hàm mục tiêu 18 Bài tốn dựa vào số liệu thí nghiệm ảnh hưởng thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng lựa chọn mơ hình nghiên cứu theo mơ hình bậc Box-Behnken Các mức gốc (0), mức thấp (1) mức cao (+1), yếu tố (với k= 4) khoảng biến thiên thể bảng 4.3.3.2a Bảng 4.3.3.2a Các mức thí nghiệm biến biến cơng nghệ Biến thực Z1: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Z2: Nhiệt độ chiết (0C) Z3: Công suất siêu âm (W) Z4: Thời gian chiết (phút) Biến mã A Khoảng biến thiên (Δ) B C D 15 40 15 Mức nghiên cứu -1 30 100 45 45 140 60 60 180 75 Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 29 thí nghiệm đánh giá hội tụ mơ hình thơng qua phân tích phương sai Kết mơ hình nghiên cứu xác định tương hợp với thực nghiệm Sau loại bỏ yếu tố khơng có ý nghĩa Hàm mục tiêu xác định biểu diễn phương trình hồi quy bậc sau: + Y1 = 33.60 + 1.35B – 0.94C + 1.1D – 1.52AC + 1.7BC + 2.49BD + 1.63CD – 2.45A2 – 4.8B2 – 4.58C2 – 3.30D2 (1) + Y2 = 28.59 + 2.44A + 1.75C + 5.97D + 2.39AB + 5.33AD – 2.27BC – 4.72A2 – 2.75B2 – 2.9C2 – 2.17D2 (2) 4.3.3.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Tương tự tốn trước đó, trình chiết xuất nguyên liệu táo mèo cần tối ưu cho hàm mục tiêu Y1 Y2 đạt giá trị lớn Điều giải việc tiến hành giải toán tối ưu phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với mức độ ưu tiên (từ đến 5) Trong toán này, với mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho hàm mục tiêu sau: Hàm Y1 (mức 5), hàm Y2 (mức 3) Tại điều kiện thông số công nghệ bảng 4.3.3.4, giá trị dự đoán hàm mục tiêu Y1 = 33.0 (mg GAE/g) Y2 = 32.83 (%) Bảng 4.3.3.3 Kết tối ưu biến công nghệ A Biến mã hóa B C D 0.29 0.27 0.05 0.61 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) 7.58 Biến thực Nhiệt độ Công suất Thời gian chiết siêu chiết siêu chiết âm (0C) âm (W) (phút) 49.05 142 69.15 19 Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết thực nghiệm với kết tính toán lý thuyết cho thấy mức độ sai khác nhỏ Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ xác cao 4.3.4 Mơ hình nghiên cứu tối ưu quy trình chiết xuất phenolic phương pháp chiết hồi lưu 4.3.4.1 Ảnh hưởng yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.3.4.2 Thiết lập mơ hình xác định phương trình hồi quy hàm mục tiêu Từ số liệu thí nghiệm ảnh hưởng thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu Y1 Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mơ hình bậc 2, kế hoạch hóa thực nghiệm hỗn hợp trung tâm theo mô tả BoxWillson Các mức gốc (hay mức bản) yếu tố hệ số α = 1.215 (với k= 3) khoảng biến thiên thể bảng 4.3.4.2a Bảng 4.3.4.2a Các mức thí nghiệm biến biến cơng nghệ Tên biến, khoảng biến thiên Biến Khoảng biến Biến thực mã thiên (Δ) Mức nghiên cứu -α -1 +α Z1: thời gian A chiết (phút) 60 227 240 300 360 373 Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu B (v/w) 4.57 9.43 Z3: Nhiệt độ chiết (0C) 15 36.8 40 55 70 73.2 C Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 15 thí nghiệm đánh giá hội tụ mơ hình thơng qua phân tích phương sai Kết mơ hình nghiên cứu xác định tương hợp với thực nghiệm Sau loại bỏ yếu tố khơng có ý nghĩa Hàm mục tiêu xác định biểu diễn phương trình hồi quy bậc sau: + Y1 = 31.28 + 2.82A + 3.4B + 2.63C + 1.32AC − 4.45A2 – 2.42B2 – 2.47C2 (1) + Y2 = 30.74 + 3.29A + 3.16B + 2.84C + 1.51AC − 4.34A2 – 2.2B2 – 2.4C2 (2) 4.3.4.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Cũng tương tư toán trước, trình chiết xuất nguyên liệu táo mèo cần tối ưu cho hàm mục tiêu Y1và Y2 đạt 20 giá trị lớn Trong toán này, với mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho hàm mục tiêu sau: Hàm Y1 (mức 4), hàm Y2 (mức 3) Tại điều kiện thông số công nghệ bảng 4.3.4.4, giá trị dự đoán hàm mục tiêu Y1 = 33.96 (mg GAE/g) Y2 = 33.21 (%) Bảng 4.3.4.3 Kết tối ưu biến cơng nghệ Biến mã hóa A B C 0.17 0.81 0.46 Thời gian (phút) 310.2 Biến thực Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) 8.62 Nhiệt độ chiết (0C) 61.9 Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết thực nghiệm với kết tính toán lý thuyết cho thấy mức độ sai khác nhỏ Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ xác cao 4.3.5 So sánh, đánh giá phương án công nghệ nghiên cứu Từ kết so sánh hiệu chiết suất phân tích yếu tố liên quan đến công nghệ khả triển khai, nâng cấp quy mô công nghệ Trong phương pháp chiết xuất phenolic nghiên cứu, đánh giá phương pháp chiết siêu âm phù hợp để triển khai cơng nghệ chiết xuất có nhiều tiềm để áp dụng vào thực tế sản xuất 4.4 Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo quy mơ phịng thí nghiệm 4.4.1 Ảnh hưởng yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.4.2 Thiết lập mơ hình xác định phương trình hồi quy hàm mục tiêu Từ số liệu thí nghiệm ảnh hưởng thơng số cơng nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu Y1 Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mơ hình bậc 2, kế hoạch hóa thực nghiệm theo mơ tả Box- Behnken Các mức gốc (0), mức thấp (-1) mức cao (+1), yếu tố (với k= 3) khoảng biến thiên thể bảng 4.4.2a Bảng 4.4.2a Các mức thí nghiệm biến biến cơng nghệ Biến thực Z1: Hàm lượng Maltodextrin bổ sung (%, w/w) Z2: Nhiệt độ khí sấy vào (0C) Biến mã A Khoảng biến thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 11 B 20 120 140 160 21 C Z3: tốc độ bơm dịch 25 30 35 (mL/phút) Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 15 thí nghiệm đánh giá tương hợp mơ hình thơng qua phân tích phương sai Kết mơ hình nghiên cứu xác định tương hợp với thực nghiệm Sau loại bỏ yếu tố khơng có ý nghĩa Hàm mục tiêu xác định biểu diễn phương trình hồi quy bậc sau: + Y1 = 13.52 – 2.13A – 0.78B – 0.067C – 0.47AB + 0.36AC + 0.18BC – 0.36 A2 – 0.33C2 (1) + Y2 = 6.85 + 0.46A – 0.9B + 0.13C – 0.4AB – 0.64B2 + 0.22C2 (2) 4.4.3 Tối ưu hóa quy trình sấy phun Cũng tương tư tốn trước, q trình sấy phun dịch chiết táo mèo cần tối ưu để hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng phenolic tổng) lớn Y2 (độ ẩm sản phẩm) nhỏ Trong toán này, với mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho hàm mục tiêu nhau: Hàm Y1 (mức 3), hàm Y2 (mức 3) Tại điều kiện thông số công nghệ bảng 4.4.3, giá trị dự đoán hàm mục tiêu Y1 = 15.02 (mg GAE/g) Y2 = 5.23(%) Bảng 4.4.3 Kết tối ưu biến cơng nghệ Biến mã hóa A B C Biến thực Hàm lượng Nhiệt độ khí Tốc độ maltodextrin sấy vào (0C) bơm dịch (%, w/w) (mL/phút) -1 -0.36 160 28.2 Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết thực nghiệm với kết tính tốn lý thuyết cho thấy mức độ sai khác nhỏ Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ xác cao 4.5 Thuyết minh quy trình cơng nghệ tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo quy mơ phịng thí nghiệm kg bột ngun liệu táo mèo sau tiền xử lý (độ ẩm ≤ 12%, độ mịn d ≤ mm) cho vào bình thủy tinh dung tích 15 lít Thêm vào bình 7.6 lít ethanol thực phẩm 65%, độ pH 5.4 (pH dung môi điều chỉnh dung dịch axit citric 0.1M với hệ đệm axit citric/natri citrate) Khuấy phút để dung môi ngấm vào nguyên liệu Đưa bình chiết vào thiết bị bể siêu âm dung tích 20 lít (model: UCP-20, Jeiotech – Hàn quốc, cơng suất siêu âm tối đa 500W) Điều chỉnh công suất siêu âm chế độ trung 22 bình (140-150W), cài đặt nhiệt độ chiết 49 ± 20C Tiến hành chiết siêu âm thời gian 70 phút Kết thúc trình chiết xuất, tiến hành lọc thu dịch chiết phễu buchner thu 7.2 lít dịch chiết Sử dụng máy cô cất chân không (model R300, Buchi – Thụy sĩ) cô đặc dịch chiết đến nồng độ chất khô 15%, lượng dịch chiết thu 2.1 lít Q trình sấy phun dịch chiết thực máy sấy phun mini Buchi B290 (Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội) Bật máy sấy phun, điều chỉnh ổn định nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào 1600C, đầu 900C Chuẩn bị dịch sấy phun, bổ sung 7% (w/w) chất mang maltodextrin vào dịch chiết khuấy Bật bơm lưu lượng, điều chỉnh tốc độ bơm dịch đạt 28 mL/phút, tiến hành sấy phun Kết thúc trình sấy phun thu 320 g bột cao chiết táo mèo giàu phenolic Sản phẩm bột táo mèo thu có độ ẩm 5.2 %, hàm lượng phenolic tổng đạt 14.9 (mg GAE/g bột) Sản phẩm đóng túi hút chân khơng bảo quản nhiệt độ 250C KẾT LUẬN Luận án thực kết bao gồm Nghiên cứu thành phần hóa học Từ phân đoạn cao chiết ethyl acetate táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) phân lập xác định cấu trúc hóa học 25 hợp chất bao gồm: 19 hợp chất phenolic, hợp chất triterpenoid dẫn xuất axit hữu mạch thẳng Trong có hợp chất có tên 3SThunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside 16 hợp chất khác lần đầu phân lập từ táo mèo Nghiên cứu hoạt tính sinh học - Hoạt tính bảo vệ tim mạch + Các cao chiết phân đoạn: Cao chiết ethylcetate thể hoạt tính mạnh nhất, tiếp đến cao chiết dichloromethane, cao nước cao chiết methanol Cao chiết n-hexan thể hoạt tính thấp nồng độ 150 µg/mL + Các hợp chất phân lập được: Có số 25 hợp chất thể hoạt tính với giá trị IC50 (µM) nằm khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2 Trong hợp chất TM9 TM37 thể hoạt tính mạnh có giá trị IC50 19.3 ± 2.2 10.0 ± 0.6 µM - Hoạt tính chống oxy hóa: Có 14 số 25 hợp chất thể hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm khoảng (18.05 ± 0.69 đến 49.34 ± 1.22) Đặc biệt, hợp chất thể hoạt tính bảo vệ 23 tim mạch TM9 TM37 thể hoạt tính chống oxy hóa mạnh tương đương đối chứng dương với giá trị SC50 29.11 ± 0.17 29.12 ± 0.38 (µg/mL) - Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) ung thư cổ tử cung (Hela) Trong cao chiết phân đoạn đem thử nghiệm có cao chiết phân đoạn n-hexan dicholoromethane (CH2Cl2) thể hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) với giá trị IC50 99.24 µg/mL 67.2 µg/mL Các cao chiết phân đoạn cịn lại khơng thể hoạt tính đến nồng độ 100 µg/mL Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất phenolic - Đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa trình chiết xuất phenolic từ táo mèo sử dụng phương pháp chiết vi sóng, chiết siêu âm chiết hồi lưu Kết trình chiết xuất phenolic phương pháp điều kiện tối ưu đánh giá hàm lượng phenolic tổng dao động từ 32.05 – 34.1 (mg GAE/g cao chiết) hàm lượng cao chiết tổng thu dao động từ 32.9 – 33.4 (%) - Trong phương pháp chiết xuất nghiên cứu, phương pháp chiết siêu âm lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu nâng cấp quy mô Các thông số công nghệ tối ưu phương pháp chiết siêu âm quy mơ phịng thí nghiệm là: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 7.6/1 (v/w), nhiệt độ chiết siêu âm 49 (0C), công suất chiết siêu âm 140 (W), thời gian chiết 70 (phút) với dung môi chiết ethanol 65% độ pH dung môi 5.4 Khi Hàm lượng phenolic tổng 33.05 ± 0.33 (mg GAE/g), hàm lượng cao chiết tổng 32.9 ± 0.21 (%) Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo Các thông số công nghệ tối ưu quy trình sấy phun là: hàm lượng chất mang maltodextrin (%, w/w), nhiệt độ khí sấy vào 160 (0C) tốc độ bơm dịch 28,2 (mL/phút) Khi hàm lượng phenolic tổng độ ẩm sản phẩm 14.98 ± 0.17 (mg GAE/g) 5.17 ± 0.12 (%) Sản phẩm có màu sắc mùi vị đặc trưng táo mèo, dạng bột mịn, khơng vón cục 24 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu phân lập số thành phần hóa học từ phân đoạn cao chiết khác táo mèo phân đoạn nước, dicholoromethane Tiếp tục nghiên cứu thăm dị hoạt tính sinh học hợp chất phân lập liên quan đến bệnh tiểu đường, mỡ máu… Tiếp tục nghiên cứu, nâng cấp quy mơ hồn thiện cơng nghệ để triển khai sản xuất quy mơ lớn ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN Lần áp dụng mơ hình khảo sát thành phần hóa học táo mèo theo định hướng hoạt tính bảo vệ tim mạch Từ phân đoạn ethyl acetate có tác dụng bảo vệ tim mạch mạnh phân lập 25 hợp chất có hợp chất 16 hợp chất khác lần phân lập từ táo mèo Lần đầu tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa thơng số cơng nghệ q trình chiết xuất phenolic phương pháp chiết khác chiết vi sóng, chiết siêu âm chiết hồi lưu; Từ tiến hành so sánh, đánh giá lựa chọn phương pháp chiết suất phù hợp Lần đầu tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa thơng số cơng nghệ q trình sấy phun dịch chiết táo mèo thu bột cao chiết táo mèo giàu phenolic sử dụng cho mục đích bào chế tạo sản phẩm chăm sóc sức khỏe