KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) chiết xuất và phân lập thành phần saponin trong thân rễ cây sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC Khoá: Người hướng dẫn: HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực khố luận tơi nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên mơn Hố dược Kiểm nghiệm thuốc Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy hết lịng bảo, hướng dẫn động viên tơi suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ biết ơn chân thành đến thầy cô Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội, Ths Nguyễn Thị Hồng Anh, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập làm khố luận Và xin cảm ơn chị Thuỷ- Khoa Dược trường Đại học y dược Thái Nguyên, chị Huệ bạn Phượng, Chuyên, Phương- Khoa Y Dược trường Đại học Quốc gia Hà Nội đồng hành suốt thời gian qua Lời cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln bên giúp đỡ động viên học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp quý thầy cô bạn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2018 Sinh viên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương - Tổng quan 1.1 Tổng quan chung sâm vũ diệp 1.1.3 Đặc điểm thực vật, phận dùng 1.1.4 Phân bố sinh thái 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.7 Thành phần hoá học 1.2 Tổng quan phương pháp sắc ký 1.2.1 Sắc ký cột 1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.3 Tổng quan phương pháp xác định cấu trúc 1.3.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1.3.2 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 10 Chương - Đối tượng phương pháp nghiên cứu 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.2 Phương tiện nghiên cứu 11 2.2.1 Dung mơi, hố chất 11 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 12 2.3.1 2.3 Phương pháp nghiên cứu 12 Phương pháp xử lý chiết mẫu 12 2.3.2 Phương pháp phân lập tinh chế hợp chất hoá học 12 2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 12 2.3.4 Phương pháp phân tích định tính hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao 13 Chương 3- Kết thực nghiệm bàn luận 13 3.1 Chiết xuất tinh chế hợp chất saponin từ thân rễ SVD 13 3.1.1 Chiết xuất phân lập 13 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập SKLM 15 3.2 Xác định cấu trúc saponin phân lập 16 3.2.1 Hợp chất số 16 3.2.2 Hợp chất số 19 3.3 Phân tích định tính dấu vân tay hoá học hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao 22 Chương - Bàn luận 23 4.1 Về xử lý chiết mẫu phân lập chất tinh khiết 23 4.2 Xác định cấu trúc hợp chất 24 4.3 Xây dựng dấu vân tay sắc ký dược liệu SVD HPLC 24 Chương - Kết luận kiến nghị 25 5.1 Kết luận 25 5.2 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 Carbon 13 nuclear magnetic resonance DEPT DEPT IR Infrared HPLC High performance liquid chromatography Proton nuclear magnetic resonance C-NMR H-NMR MS Mass spectrum NMR Nuclear magnetic resonance Rf Retardation factor RP18 Reversed Phase 18 SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet VIS Visible DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình Cấu trúc hố học 10 saponin tách từ thân rễ SVD Hình Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái 11 Sapa, Lào Cai 15/07/2016 Hình Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng 14 Hình Sơ đồ phân lập sắc ký hợp chất tinh khiết từ phân 15 đoạn BuOH Hình Sắc ký đồ chất số số phân lập sau 15 phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH Hình Cấu trúc hóa học hợp chất số 19 Hình Cấu trúc hóa học hợp chất số 22 Hình Sắc ký đồ HPLC hai saponin phân lập 23 (A), (B) cao butanol SVD DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng Các hợp chất saponin phân lập từ SVD Trang 13 16 13 19 Bảng Số liệu phổ H C-NMR, DEPT hợp chất số Bảng Số liệu phổ H C-NMR hợp chất số ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam vùng đất nhiều loài thảo dược quý đặc biệt loài thuộc chi sâm Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thuốc quý thuộc chi Sâm (Panax) sử dụng thuốc truyền thống có tiềm để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe lồi khác chi Gần sâm vũ diệp hoá bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang Lào Cai [1; 13] Về mặt y học, thân rễ sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ có mặt số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc Ở Việt Nam giới, tổng quan tài liệu thấy khơng có nhiều nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng sinh học dược liệu sâm vũ diệp Vì vậy, việc nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hoá học tác dụng sinh học để thu thập thêm chứng khoa học nâng cao hiệu sử dụng loại dược liệu quý hứa hẹn nhiều kết có giá trị khoa học thực tiễn Năm 2017 vừa qua, nhóm nghiên cứu Khoa Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội thực nghiên cứu bước đầu thành phần hoá học thân rễ sâm vũ diệp thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất phân lập từ phân đoạn phân cực ethyl acetat [7; 8] Tiếp nối nghiên cứu thực đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng Tây Bắc” Kết đề tài góp phần xây dựng sở liệu thành phần hố học, từ làm tiền đề cho nghiên cứu sâu định tính định lượng nghiên cứu tác dụng sinh học loài sâm Mục tiêu đề tài bao gồm: Chiết xuất phân lập hợp chất saponin phân đoạn n-butanol thân rễ sâm vũ diệp Xác định cấu trúc hoá học saponin phân lập Xây dựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp sắc ký lỏng hiệu cao Đề tài phần đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN-TB.07C/13-18 Chương - Tổng quan 1.1 Tổng quan chung sâm vũ diệp 1.1.1 Tên khoa học, tên đồng danh Sâm vũ diệp có tên khác vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, trúc tiết nhân sâm, tam thất xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên thất, nữu tử thất, tam thất lông chim, hương sơn tam thất (Trung Quốc) có tên khoa khoa học Panax bipinnatifidus Seem [1; 12] Một số tên đồng danh SVD: Aralia bipinnatifida (Seem.) C B Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec et Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk; Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng Wall var major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall spp Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [12] 1.1.2 Vị trí phân loại [2] Trong hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (1987), SVD thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi Nhân sâm (Panax L.) 1.1.3 Đặc điểm thực vật, phận dùng Cây thân thảo sống nhiều năm Thân rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng hàng năm để lại Thân khí sinh mảnh, cao 20-30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi tàn vào mùa đông, mọc chồi thân từ tháng đến đầu tháng dương lịch Lá kép chân vịt, gồm 2-3 mọc vịng Lá chét 5-7 (ít 3) thn, dài 2,5-14 cm, rộng 1,5-4 cm, gốc trịn, đầu thn thành mũi nhọn, xẻ thuỳ khơng đều, mép có cưa, có lông Cụm hoa tán đơn, mọc ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 2090 hoa; cuống hoa mảnh dài 1-1,5 cm Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn thân, cánh hoa, bầu 2-3 Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2 cm, chín màu đỏ, có chấm đen to đầu, chứa 1-2 hạt Hạt hình cầu gần TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cộng (2003), Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 711 - 714 Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, Thực vật học 2007, NXB Y học, Hà Nội, tr 285-286 Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ mơn hố phân tích (2006), Trường Đại học Dược Hà Nội, Hố phân tích II, tr 17, 99-146, 173-222 Nguyễn Thượng Dong (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc, Nhà xuất Y học, tr 8-99, 162-196, 234-242 Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia, Hà Nội Đỗ Văn Hào, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Thu Thủy, Đặng Thị Ngần, Đào Thị Hồng Bích, Nguyễn Thị Hồng Anh, Dương Thị Ly Hương, Nguyễn Hữu Tùng (2017), “Thành phần hóa học phân đoạn ethyl acetat từ rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 33 (2), 50-55 Trần Công Luận, (2002), Phân tích thành phần hóa học số tác dụng dược lý hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr 1-65 10 Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên cộng (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học hai lồi sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)", Tạp chí Dược liệu, 14(1), tr 17-23 11 Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), Định tính saponin dược liệu Giảo cổ lam HPLC, Khóa luận tốt nghiệp- Trường ĐH Dược Hà Nội 12 Nguyễn Văn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 10(3), tr 71-76 13 Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền (2006), "Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái sâm vũ diệp Tam thất hoang Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr 177-180 14 Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiêu cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ y tế 15 Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T sai et K M Feng) in vitro, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Khoa y dược, ĐHQGHN 16 Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 199 – 222; 493 – 685 17 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Bộ y tế, Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107 – 113, 216-250 18 Vụ khoa học đào tạo (2007), Bộ y tế, Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB y học, tr 79-82, 84-110 B Tiếng anh 19 Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp 1307-1330 20 Chun Liang, Yan Ding et al (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-Κb", Journal of Ginseng Research, 37(1), pp 74-79 21 Hu M, Ogawa K et al (1995), "Triterpenoid glucuronide saponins from root bark of Aralia armata", Phytochemistry, 39, pp 179-184 22 Liang C, Ding Y, et al (2010), "Oleanane –type triterpenoids from Panax stipuleannatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett., 20, pp 7110-7115 13 23 Mahato S, Kundu A (1994), " C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp 1517-1575 24 Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462 25 Tung NH, Quang TH et al (2011), "Oleanolic triterpenesaponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 14171420 26 Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636 27 Yang W Z, Hub Y., Wu W Y., et al (2014), “Saponins in the genus Panax L (Araliaceae): A systemic review of their chemical diversity”, Phytochemistry, 106, pp 7-24 28 Yoshikawa M, Murakami T et al (1996), "Bioactive saponins and glycosides VII On the hypoglycemic principles from the root cortex of Aralia elata Seem.: Structure related hypoglycemic activity of oleanolic acid oligoglycoside", Chem Pharm Bull, 44(10), pp 1923-1927 PHỤ LỤC Phụ lục - Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục - Phổ hợp chất số (Stipuleanosid R2 ) Phụ lục 2.1 Phổ ESI-MS [M-H]- chất số 1 Phụ lục 2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (MeOD, 500 MHz) chất số 13 Phụ lục 2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR – DEPT chất số 13 Phụ lục 2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR (MeOD, 125 MHz) chất số Phụ lục - Phổ hợp chất số (araloside A methyl ester) + Phụ lục 3.1 Phổ ESI-MS [M+Na] chất số Phụ lục 3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (CD3OD, 400 MHz) chất số 13 Phụ lục 3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR (CD3OD, 100 MHz) chất số Phụ lục Hình ảnh sắc ký lớp mỏng trình phân lập hai hợp chất Phụ lục - Phiếu kết giám định mẫu VN Pharma cy, and Medici ne of School @ Phụ lục - Phổ hợp chất số (Stipuleanosid R2 ) Công thức: C53H84O23 Công thức phân tử Phụ lục 2.1 Phổ ESI-MS [M-H]- chất số 1 Phụ lục 2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (MeOD, 500MHz) chất số Pharma cy, and Medici ne of School @ 13 Phụ lục 2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR – DEPT chất số 13 Phụ lục 2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR (MeOD, 125 MHz) chất số Phụ lục - Phổ hợp chất số (araloside A methyl ester) Công thức: C48H76O18 Công thức phân tử + hụ lục 3.1 Phổ ESI-MS [M+Na] chất số Phụ lục 3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (CD3OD, 400MHz) chất số 13 Phụ lục 3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR (CD3OD, 100 MHz) chất số P P a u t C :\ W I N N M R \ C O M M O N \ D A T A M \ d a t a \T Phụ lục 4: số hình ảnh sắc ký lớp mỏng trình chiết xuất phân lập of School @ ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM. ) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC... loài sâm Mục tiêu đề tài bao gồm: Chiết xuất phân lập hợp chất saponin phân đoạn n-butanol thân rễ sâm vũ diệp Xác định cấu trúc hoá học saponin phân lập Xây dựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp. .. phần hoá học thân rễ sâm vũ diệp thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất phân lập từ phân đoạn phân cực ethyl acetat [7; 8] Tiếp nối nghiên cứu thực đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin thân rễ sâm