KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ sâm lai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS VAR FUSCIDISCUS K KOMATSU, S ZHU & S.Q CAI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS VAR FUSCIDISCUS K KOMATSU, S ZHU & S.Q CAI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : Người hướng dẫn : LỜI CẢM ƠN Khóa luận kết cho q trình học tập, rèn luyện tơi Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội q trình nghiên cứu, thực hành Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu Qua xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Nguyễn Thị Duyên – Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược liệu, PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, trực tiếp hướng dẫn tơi hồn thành đề tài khóa luận Lãnh đạo, thầy cô công tác Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập, nghiên cứu khoa suốt năm học qua Cán nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt PGS.TS Đỗ Thị Hà tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình tiến hành thực nghiệm Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống trồng Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai)”, mã số: KHCN-TB.16C/13-18, ThS Phạm Quang Tuyến chủ nhiệm hỗ trợ kinh phí để thực nghiên cứu Gia đình, bạn bè người ln ln tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập vừa qua Dù nhận nhiều hướng dẫn giúp đỡ khóa luận khơng tránh khỏi thiết sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khóa luận tơi hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2018 Sinh viên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BLC Phân đoạn butanol Sâm Lai Châu BuOH Butanol CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DCM Dicloromethan DCMLC Phân đoạn DCM Sâm Lai Châu DL/DM Dược liệu/Dung môi EtOH Ethanol GLUT4 Protein màng tế bào vân, tim, mỡ mô khác (Glucose transporter type 4) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LPS Lipopolysaccharid M Khối lượng phân tử (Mass) m/z Khối lượng/điện tích MeOH Methanol Mp Điểm nóng chảy (Melting Point) MS Phổ khối (Mass Spectroscopy) NF-κB Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor- Kappa B) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) PCA Phản ứng phản Anaphylaxis) PRT4 Pseudoginsenosid Rf Hệ số lưu SKĐ Sắc ký đồ vệ thụ động (Passive Cutaneous TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TLR4 Receptor LPS (Tool-Like Receptor) TLTK Tài liệu tham khảo TNF-α Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor) Treg Regulary T cells TT Thứ tự UV-Vis Phổ tử ngoại (Ultra Violet – Visible) v/v Thể tích/ Thể tích VKH&CNVN Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam WLC Phân đoạn nước Sâm Lai Châu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol Sâm Việt Nam Bảng 1.2 Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol Sâm Việt Nam Bảng 1.3 Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic Sâm Việt Nam Bảng 1.4 Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol Sâm Việt Nam Bảng 1.5 Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol Sâm Việt Nam .10 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ hợp chất LC05 MR2 26 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất LC07 Rb1 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv .4 Hình 1.2 Hình ảnh Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var fuscidiscus 13 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu 20 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát thuốc thử H2SO4 cồn tuyệt đối, hơ nóng 21 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol .23 Hình 3.4 Sắc ký đồ MR2 LC05 25 Hình 3.5 Cấu trúc hợp chất LC05 (majonosid R2) 28 Hình 3.6 Kết TLC LC07 với phân đoạn butanol 29 Hình 3.7 Cơng thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) 32 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.1 Vài nét chi Panax L 1.1.2 Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.3 Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.4 Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.5 Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.6 Tác dụng sinh học hợp chất có Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 10 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu – Sâm Lai Châu 11 1.2.1 Đặc điểm thực vật 12 1.2.2 Phân bố 13 1.2.3 Mối quan hệ di truyền Sâm Lai Châu Sâm Việt Nam .13 1.2.4 Thành phần hóa học 14 1.2.5 Tác dụng sinh học 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng 15 2.2 Hoá chất, thiết bị 15 2.2.1 Hoá chất 15 2.2.2 Thiết bị 15 2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết .16 2.3.1 Phương pháp chiết xuất phân lập 16 2.3.2 Phương pháp xác định nhận dạng cấu trúc 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Chiết phân đoạn Sâm Lai Châu phân lập hợp chất từ cao phân đoạn butanol 20 3.1.1 Kết chiết phân đoạn Sâm Lai Châu 20 3.1.2 Kết phân lập hợp chất tinh khiết 22 3.1.3 Hằng số phân lập hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 24 3.2 Biện luận cấu trúc hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 25 3.2.1 Biện luận cấu trúc LC05 25 3.2.2 Biện luận cấu trúc LC07 28 3.3 Bàn luận 32 3.3.1 Về chiết xuất 32 3.3.2 Về phân lập, tinh chế nhận dạng cấu trúc hợp chất 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Nền kinh tế - xã hội ngày phát triển đại hơn, kéo theo nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho người ngày tăng Một sản phẩm chăm sóc sức khỏe người dược phẩm Với phát triển khoa học công nghệ tiến bộ, nhà khoa học muốn tối ưu hóa cơng dụng thuốc hạn chế tối đa tác dụng phụ thuốc Một biện pháp hữu hiệu áp dụng tạo thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên thân thiện với người “Sâm” từ quen thuộc mà hay dùng để nói loài dược liệu quý thuộc chi Panax L Có lẽ nghe đến Sâm biết đến cơng dụng tuyệt vời như: thuốc bổ, tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc bảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, hạ huyết áp, giảm đường huyết…[53] Cũng cơng dụng đáng nể đó, lồi Sâm ln trọng tìm kiếm, nghiên cứu phát triển Việt Nam tiếng với loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv), lồi Sâm có hàm lượng saponin cao Năm 2013, Phan Kế Long cộng phát thứ Sâm đặt tên Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus), bậc phân loại loài Sâm Việt Nam huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu [38] Mặc dù nghiên cứu sơ cho thấy Sâm Lai Châu chứa hàm lượng saponin tương đối cao đem lại hiệu đáng ý, song nay, nghiên cứu chi tiết thứ Sâm Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học giá trị sử dụng Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) thực đề tài: “Phân lập, xác định cấu trúc số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai)” với mục tiêu cần đạt được: Chiết xuất phân lập số hợp chất từ phân đoạn n-butanol Xác định nhận dạng cấu trúc chất phân lập phân đoạn 10 26 Kim, N D., Kang, S Y., and Schini, V B (1994), “Ginsenosides evoke endothelium-dependent vascular relaxation in rat aorta”, General Pharmacology 25, 1071–1077 27 Kim, Y C., Kim, S R., Markelonis, G J., and Oh, T H (1998b), “Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamateinduced neurodegeneration”, Journal of Neuroscience Research 53, 426–432 28 Konoshima, T., Takasaki, M., Ichiishi, E., Murakami, T.,Tokuda, H., Nishino, H., Duc, N M., Kasai, R., Yamasaki, K (1999), “Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis”, Cancer Letters 147(1-2), 6-11 29 Konoshima, T., Takasaki, M., Tokuda, H., Nishino, H., Duc, N M., Kasai, R., Yamasaki, K (1998), “Anti-tumor-promoting activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv (I).”, Biological Pharmaceutical Bulletin 21(8), 834-8 30 Lee, S.-J., Ko, W.-G., Kim, J.-H., Sung, J.-H., Lee, S.-J., Moon, C.-K., and Lee, B.-H (2000), “Induction of apoptosis by a novel intestinal metabolite of ginseng saponin via cytochrome c-mediated activation of caspase-3 protease”, Biochemical Pharmacology 60, 677–685 31 Lee, S Y et al (2015), “Ocotillol, a Majonoside R2 Metabolite, Ameliorates 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic Acid-Induced Colitis in Mice by Restoring the Balance of Th17/Treg Cells”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 63(31), 31-7024 32 Linné, C (1735), Systema Naturae, Leyden 33 Linné, C (1753), Species Plantarum, Stockholm 34 Lutomski J., Luan T.C and Hoa T.T (1992), "Polyacetylenes in the Araliaceae family Part IV", Herba Polonica 38(3), 137-140 35 Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Ryoji Kasai, Aiko Ito, Kazuo Yamasaki and Osamu Tanaka (1993), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv Collected in Vietnam I”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 41(11), 2010-2014 36 Park, E.-K., Shin, Y.-W., Lee, H.-U., Kim, S.-S., Lee, Y.-C., Lee, B.-Y., and Kim, D.-H (2005), “Inhibitory effect of ginsenoside Rb1 and compound K on NO and prostaglandin E2 biosynthesis of RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide”, Biological Pharmaceutical Bulletin 28, 652–656 37 Park, E K.,Choo, M.-K., Han, M J., and Kim, D.-H (2004), "Ginsenoside Rh1 possesses antiallergic and anti-inflammatory activities", International Archives of Allergy and Immunology 133, 113-120 38 Phan Ke Long et al (2013), "Lai Chau ginseng Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai I morphology, ecology, distribution and conservation status", Proceeding of the 2nd VAST-KAST Workshop on Biodiversity and Bio-active compounds, 65-73 39 Radad, K., Gille, G., Moldzio, R., Saito, H., and Rausch, W.-D (2004b), “Ginsenosides Rb1 and Rg1 effects on mesencephalic dopaminergiccells stressed with glutamate”, Brain Research 1021, 41–53 40 Radad, K., Gille, G., Moldzio, R., Saito, H., Ishige, K., and Rausch, W.-D (2004a), “Ginsenosides Rb1 and Rg1 effects on survival and neurite growth of MPPỵ-affected mesencephalic dopaminergic cells, Journal of neural transmission 111, 37–45 41 Rausch, W.-D., Liu, S., Gille, G., and Radad, K (2006), “Neuroprotective effects of ginsenosides”, Acta Neurobiologiae Experimentalis 66, 369–375 42 Rhule, A., Navarro, S., Smith, J R., and Shepherd, D M (2006), “Panax notoginseng attenuates LPS-induced pro-inflammatory mediators in RAW264.7 cells”, Journal of Ethnopharmacology 106, 121–128 43 Rudakewich, M., Ba, F., and Benishin, C G (2001), “Neurotrophic and neuroprotective actions of ginsenosides Rb1 and Rg1”, Planta Medical 67, 533– 537 44 Scott, G I., Colligan, P B., Ren, B H., and Ren, J (2001), “Ginsenosides Rb1 and Re decrease cardiac contraction in adult rat ventricular myocytes: Role of nitric oxide”, British Journal of Pharmacology 134, 1159–1165 45 Shang, W., Yang, Y., Jiang, B., Jin, H., Zhou, L., Liu, S., and Chen, M (2007), “Ginsenoside Rb1 promotes adipogenesis in 3T3-L1 cells by enhancing PPARg2 and C/EBPa gene expression”, Life Sciences 80, 618–625 46 Tran, Q L., Adnyana, I K., Tezuka, Y., Nagaoka, T., Tran, Q K., and Kadota, S (2001), "Triterpene saponins from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective activity", Journal of Natural Products 64, tr 456–461 47 Wakabayashi, C., Murakami, K., Hasegawa, H., Murata, J., and Saiki, I (1998), “An intestinal bacterial metabolite of ginseng protopanaxadiol saponins has the ability to induce apoptosis in tumor cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications 246, 725–730 48 Wang, W., Zhao, Z.-J., Rayburn, E R., Hill, D L., Wang, H., and Zhang, R (2007), “In vitro anti-cancer activity and structure-activity relationships of natural products isolated from fruits of Panax ginseng”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 59, 589–601 49 Yamaguchi, Y., Haruta, K., and Kobayashi, H (1995), “Effects of ginsenosides on impaired performance induced in the rat by Scopolamine in a radial-arm maze”, Psychoneuroendrocrinology 20, 645–653 50 Yamassaki, K (2000), “Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis”, Pharmaceutical Biology 38, 16-24 51 Zhu, S et al (2003), “A new variety of the Genus Panax from Southern Yunnan, China and its nucleotide sequences of 18S Ribosoma RNA Gene”, Journal of Japanese Botany 78(2), 86-94 52 Zhu, S., Zou, K., Fushimi, H., Cai, S., and Komatsu, K (2004), “Comparative study on triterpene saponins of ginseng drugs”, Planta Medical 70, 666–677 C Trang Web 53 Wikimedia, ngày tháng năm https://vi.wikipedia.org/wiki/S%C3%A2m_Ng%E1%BB%8Dc_Linh 2018 54 Cục sở hữu trí tuệ Việt Nam, ngày 20 tháng năm 2018, http://noip.gov.vn/noip/cms_vn.nsf/vwDisplayContentNews/DDDF190395A51 545472580180013B989?OpenDocument 55 Công ty cổ phần Dược Quảng Nam, ngày tháng năm 2018, https://sites.google.com/site/samngoclinh1000/tm-hiu-v-sm-ngc-linh PHỤ LỤC MẪU TIÊU BẢN CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - SÂM LAI CHÂU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC V Pharma cy, and Medici ne of School @ Phụ lục Mẫu tiêu Sâm Lai Châu (Viện Nghiên cứu Lâm sinh) Phụ lục Phổ hợp chất LC05 (majonosid R2) Phụ lục 2.1 Phổ khối ESI-MS hợp chất LC05 Phổ 1H-NMR Phụ lục 2.2 Phổ H-NMR hợp chất LC05 Pharmacy , and Phổ 13C-NMR @ Medicin e of School 13 Phụ lục 2.3 Phổ C-NMR hợp chất LC05 Phổ DEPT Pharmacy , and @ Medicin e of School Phụ lục 2.4 Phổ DEPT hợp chất LC05 Phụ lục Phổ hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) Pharmacy , and Medicin e of School Phụ lục 3.1 Phổ khối ESI-MS hợp chất LC07 Pharmacy , and Phổ H1-NMR @ Medicin e of School Phụ lục 3.2 Phổ H -NMR hợp chất LC07 Phổ C13-NMR @ Pharmacy , and Medicin e of School 13 Phụ lục 3.3 Phổ C -NMR hợp chất LC07 Pharmacy , and Phổ DEPT @ Medicin e of School Phụ lục 3.4 Phổ DEPT hợp chất LC07 VN Pharma cy, and Medici ne of School @ Phụ lục 3.5 Phổ HSQC hợp chất LC07 VN Pharma cy, and Medici ne of School @ Phụ lục 3.6 Phổ HMBC hợp chất LC07 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS VAR... 3.1.3 Hằng số phân lập hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 24 3.2 Biện luận cấu trúc hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 25 3.2.1 Biện luận cấu trúc LC05 25 3.2.2 Biện luận cấu trúc LC07... Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol 23 BLC7 (240 mg) LC07 (4,8 mg) 3.1.3 Hằng số phân lập hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu Hợp chất LC05: phân lập dạng bột vô định hình