Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm linh chi ganoderma lucidum leyss ex fr karst

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THANH BÌNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM (LEYSS EX FR.) KARST LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THANH BÌNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM (LEYSS EX FR.) KARST Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN TIẾN ĐẠT TS TRẦN MẠNH TRÍ Hà nội – Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ nhiều từ gia đình, cá nhân tập thể Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Tiến Đạt – Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, TS Trần Mạnh Trí – giảng viên trường Đại học Khoa học Tự nhiên hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Khoa Hóa học Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đào tạo giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp cổ vũ động viên tơi hồn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn! LỜI CAM ĐOAN Tơi là: Phạm Thanh Bình Học viên cao học: Chun ngành Hóa hữu – K26 Tơi xin cam đoan luận văn thạc sĩ công trình nghiên cứu trung thực chưa sử dụng cơng trình khác Các thí nghiệm để thu thập số liệu luận văn thân tơi tiến hành thí nghiệm phịng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam với đồng ý hướng dẫn TS Nguyễn Tiến Đạt TS Trần Mạnh Trí Các số liệu phục vụ cho phân tích, nhận xét đánh giá tơi thu thập từ nguồn có ghi rõ tài liệu tham khảo TÁC GIẢ LUẬN VĂN Phạm Thanh Bình MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 10 1.1 Đặc điểm thực vật 10 1.2 Giới thiệu nấm Linh chi 10 1.2.1 Phân bố sinh thái nấm Linh chi 13 1.2.2 Thành phần hóa học nấm Linh chi 13 1.2.3 Tác dụng dược lý 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc 23 2.4 Phương pháp thử hoạt tính 24 2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylase 24 2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 26 2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm 28 Chương THỰC NGHIỆM 30 3.1 Xử lý mẫu nghiên cứu: 30 3.2 Quy trình phân lập chất 30 3.3 Thơng số hóa lý hợp chất phân lập 32 3.3.1 Hợp chất (GL-1): ergosterol 32 3.3.2 Hợp chất (GL-2): ergosterol peroxide 32 3.3.3 Hợp chất (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one 33 3.3.4 Hợp chất (GL-4): ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24dien-26-al) 33 3.3.5 Hợp chất (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one 34 3.3.6 Hợp chất (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo 5α-lannost-8-en-26-oic acid) 34 3.3.7 Hợp chất (GL-7): ganoderic acid C6 (3β,12β-dihydroxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid) 35 3.3.8 Hợp chất (GL-8): ganoderic acid C 35 3.3.9 Hợp chất (GL-9): ganodermadiol (lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) 36 3.3.10 Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate 36 3.4 Thử hoạt tính sinh học 10 hợp chất phân lập từ nấm Linh chi (G lucidum) 37 3.4.1 Thử hoạt tính ức chế enzyme α-amylase 37 3.4.2 Thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 37 3.4.3 Thử hoạt kháng viêm 37 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Cấu trúc hợp chất phân lập từ nấm Linh chi 39 4.1.1 Hợp chất 1: (GL-1): ergosterol 39 4.1.2 Hợp chất 2: (GL-2): ergosterol peroxide 43 4.1.3 Hợp chất 3: (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one 47 4.1.4 Hợp chất (GL-4): Ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24dien-26-al) 50 4.1.5 Hợp chất (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one 53 4.1.6 Hợp chất (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hdroxy-7,11,15,23-tetraoxo 5α-lannost-8-en-26-oic acid) 60 4.1.7 Hợp chất (GL-7): Ganoderic acid C6 (3β,12β-dihydroxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid) 63 4.1.8 Hợp chất (GL-8): ganoderic acid C 67 4.1.9 Hợp chất (GL-9): Ganodermadiol (Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) 70 4.1.10 Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate 73 4.2 Hoạt tính sinh học chất phân lập từ nấm Linh chi G lucidum 77 4.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase 77 4.2.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 78 4.2.3 Hoạt tính kháng viêm 79 KẾT LUẬN 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 85 DANH MỤC BẢNG Bảng Bảng số liệu 13C NMR hợp chất từ nấm Linh chi (G lucidum) 42 Bảng Số liệu phổ hợp chất GL-5 54 Bảng Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase 77 Bảng Kết thử hoạt tính enzyme α-glucosidase 78 Bảng Kết thử hoạt tính kháng viêm 79 DANH MỤC HÌNH Hình Một số lồi nấm thuộc chi Ganoderma 11 Hình Mẫu nấm linh chi (G lucidum Karst) 30 Hình Sơ đồ phân lập hợp chất từ nấm Linh chi (G lucidum) 31 Hình Cấu trúc hợp chất GL-1 39 Hình Phổ 1H hợp chất GL-1 39 Hình Phổ 13C NMR hợp chất GL-1 40 Hình Phổ DEPT hợp chất GL-1 41 Hình Phổ MS hợp chất GL-1 41 Hình Cấu trúc hợp chất GL-2 43 Hình 10 Phổ 1H NMR hợp chất GL-2 44 Hình 11 Phổ 13C NMR hợp chất GL-2 44 Hình 12 Phổ DEPT hợp chất GL-2 45 Hình 13 Phổ HSQC hợp chất GL-2 45 Hình 14 Phổ HMBC hợp chất GL-2 46 Hình 15 Phổ MS hợp chất GL-2 46 Hình 16 Cấu trúc hợp chất GL-3 47 Hình 17 Phổ 1H NMR hợp chất GL-3 48 Hình 18 Phổ 13C NMR hợp chất GL-3 48 Hình 19 Phổ DEPT hợp chất GL-3 49 Hình 20 Phổ MS hợp chất GL-3 49 Hình 21 Cấu trúc hợp chất GL-4 50 Hình 22 Phổ 1HNMR hợp chất GL-4 51 Hình 23 Phổ 13C NMR hợp chất GL-4 51 Hình 24 Phổ DEPT hợp chất GL-4 52 Hình 25 Phổ MS hợp chất GL-4 52 Hình 26 Cấu trúc hợp chất GL-5 56 Hình 27 Phổ 1H hợp chất GL-5 56 Hình 28 Phổ 13C NMR hợp chất GL-5 57 Hình 29 Phổ DEPT hợp chất GL-5 57 Hình 30 Phổ HSQC hợp chất GL-5 58 Hình 31 Phổ HMBC hợp chất GL-5 58 Hình 32 Phổ COSY hợp chất GL-5 59 Hình 33 Phổ NOESY hợp chất GL-5 59 Hình 40 Cấu trúc hợp chất GL-7 63 Hình 41 Phổ 1H hợp chất GL-7 64 Hình 42 Phổ 13C NMR hợp chất GL-7 65 Hình 43 Phổ DEPT hợp chất GL-7 65 Hình 44 Phổ HSQC hợp chất GL-7 66 Hình 45 Phổ HMBC hợp chất GL-7 66 Hình 46 Phổ MS hợp chất GL-7 67 Hình 47 Cấu trúc hợp chất GL-8 67 Hình 48 Phổ 1H hợp chất GL-8 68 Hình 49 Phổ 13C NMR hợp chất GL-8 69 Hình 50 Phổ DEPT hợp chất GL-8 69 Hình 51 Phổ MS hợp chất GL-8 70 Hình 52 Cấu trúc hợp chất GL-9 70 Hình 53 Phổ 1H hợp chất GL-9 71 Hình 54 Phổ 13C NMR hợp chất GL-9 72 Hình 55 Phổ DEPT hợp chất GL-9 72 Hình 56 Phổ MS hợp chất GL-9 73 Hình 57 Cấu trúc hợp chất GL-10 73 Hình 58 Phổ 1H hợp chất GL-10 75 Hình 59 Phổ 13C NMR hợp chất GL-10 75 Hình 60 Phổ DEPT hợp chất GL-10 76 Hình 61 Phổ MS hợp chất GL-10 76 DANH MỤC VIẾT TẮT Kí hiệu 13 C-NMR Tiếng Anh Diễn giải Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Proton Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân proton Resonance human lung adenocarcinoma Tế bào ung thư phổi người cell Column chromatography Sắc kí cột H-NMR A-549 CC DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ DEPT DMSO Dimethylsulfoxide (CH3)2SO HMBC Heteronuclear mutiple Bond Tương tác dị hạt nhân qua nhiều Connectivity liên kết HSQC Heteronuclear quantum coherence single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm RP-18 SRB TMS Reserve phase C-18 Sulforhodamine B Tetramethylsilane Chất hấp phụ pha đảo C-18 Sulforhodamine B Tetramethylsilane ĐẶT VẤN ĐỀ Hóa học hợp chất thiên nhiên, phận chuyên ngành hóa hữu cơ, có xu hướng phát triển mạnh mẽ Thế giới thực vật nguồn tài nguyên vô phong phú quý giá hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Xu hướng sâu nghiên cứu tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh ngày thu hút quan tâm nhà khoa học ưu điểm chúng độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hóa thể so với dược phẩm tổng hợp Việt Nam có hệ thực vật đa dạng phong phú nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 lồi thực vật bậc cao có khoảng 5.000 lồi sử dụng làm thuốc Nhân dân ta từ lâu biết sử dụng loại cỏ tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh Bắt nguồn từ kinh nghiệm dân gian, với phát triển nhanh chóng khoa học kỹ thuật, đến nhiều dược liệu nghiên cứu, sử dụng rộng rãi cuốc sống khoa học Nấm Linh chi dược liệu quý, thuốc quan trọng nước Đông Nam Á Trong năm gần đây, nhóm nghiên cứu ngồi nước quan tâm thực bước đầu thu nhiều kết khả quan Các công bố nước quốc tế rằng, thành phần hóa học nấm Linh chi có phổ hoạt tính sinh học rộng phải kể đến như: điều hòa hệ miễn dịch, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm mỡ máu, hạ huyết áp, hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thư… Xuất phát từ lợi ích nấm Linh chi, hoạt tính sinh học mang lại cho người, để hiểu sâu thành phần hóa học hoạt tính sinh học nấm Linh chi, thúc đẩy tác giả tiến hành nghiên cứu đề tài này, nhằm góp phần nhỏ vào việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học nấm Linh chi nhằm mục đích phát dược tố mới, phục vụ công bảo vệ sức khỏe cộng đồng, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst” Mục tiêu đề tài thực nội dung sau: Phân lập hợp chất từ nấm Linh chi (G lucidum); Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ nấm Linh chi (G lucidum); Đánh giá số hoạt tính hợp chất phân lập Trên phổ 13C-NMR DEPT xuất 30 tín hiệu 30 nhóm nguyên tử carbon bao gồm nhóm methyl, nhóm methylene, nhóm methine nhóm ngun tử carbon khơng liên kết với hydro Trong vùng trường thấp xuất tín hiệu carbon cặp liên kết đôi dạng (–CH=CC=C