NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HÌNH THÁI QUẢ THỂ CỦA CÁC CHỦNG NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst. THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH TRONG NƯỚC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HÌNH THÁI QUẢ THỂ CỦA CÁC CHỦNG NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH TRONG NƯỚC Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHAN THỊ KIỀU Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 06/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HÌNH THÁI QUẢ THỂ CỦA CÁC CHỦNG NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH TRONG NƯỚC Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực KS NGUYỄN MINH QUANG PHAN THỊ KIỀU ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ Tháng 06/2013 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, trau dồi kiến thức trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, với bao cố gắng, tơi có hội thực khóa luận tốt nghiệp hướng dẫn, giúp đỡ tận tình thầy cơ, bạn bè để hồn thành trọn vẹn việc học, tơi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học tất thầy tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tơi thời gian theo học trường Cảm ơn thầy Lê Đình Đơn, Tơ Thị Nhã Trầm hết lòng học trò, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt q trình thực khóa luận Chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Minh Quang cô Võ Thị Thúy Huệ tận tình hướng dẫn, bảo động viên, truyền đạt bao kiến thức quý báu để hồn thành khóa luận hành trang để bước vào đời Xin cảm ơn anh Phan Hữu Tín, anh Huỳnh Đăng Sang bạn sinh viên nhóm nấm, Viện Cơng nghệ Sinh học Mơi trường, trường đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh giúp đỡ thời gian qua Cảm ơn bạn sinh viên lớp DH09SH, người giúp đỡ, góp ý chia sẻ tơi khó khăn thời gian học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tất người quan tâm, hướng dẫn hỗ trợ Chúc nhà trường, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trại thực nghiệm ngày phát triển lớn mạnh Sau chân thành gửi lời cảm ơn đến ba mẹ nuôi dưỡng, ủng hộ, tạo cho điều kiện tốt chỗ dựa vững để có hơm Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013 Phan Thị Kiều i TÓM TẮT Từ xưa đến nay, nấm Linh Chi biết đến loại siêu thảo dược, loại thần dược có khả tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa nhiều loại bệnh, điều chỉnh cân sinh lý, làm chậm trình lão hóa Nấm Linh Chi chứa nhiều dược chất quan trọng đặc biệt polysaccharide (β – D – glucans) có khả ức chế tế bào ung thư Hiện nay, giới nấm Linh Chi đưa vào quy mô sản xuất công nghiệp mang lại lợi ích kinh tế vơ to lớn Ở Việt Nam, năm gần nấm Linh Chi trọng sản xuất nghiên cứu, nhiên việc sản xuất nhỏ lẻ, chủ yếu tự phát Những nghiên cứu giá trị kinh tế dược liệu chủng nấm Linh Chi Việt Nam nhiều hạn chế Do đó, đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học hình thái thể nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) số tỉnh nước” tiến hành nhằm đánh giá chủng nấm mặt ý nghĩa kinh tế để đưa chủng nấm vào sản xuất đại trà Nội dung nghiên cứu: Khảo sát hoạt tính enzyme amylase cellulase chủng nấm Linh Chi, đánh giá tốc độ lan tơ, hình thái thể hiệu suất sinh học chủng nấm Cải tiến quy trình ly trích DNA chủng nấm Linh Chi thu thập Kết quả: Đánh giá hoạt tính sinh học enzyme amylase cellulase chủng nấm Linh Chi Ghi nhận khác tốc độ lan tơ, đường kính độ dày thể chủng nấm, chọn chủng có hiệu suất sinh học cao so với chủng nấm lại Ly trích DNA theo quy trình cải tiến mang lại kết tốt hơn, DNA hàm lượng cao so với quy trình cũ Kết luận: Hai chủng nấm Linh Chi thu thập trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tỉnh Đồng Nai vượt trội so với chủng nấm lại tốc độ lan tơ, hình thái thể hiệu suất sinh học Do đó, đưa vào sản xuất, mang lại hiệu kinh tế cao Quy trình ly trích DNA sau cải tiến đảm bảo DNA ly trích có chất lượng hàm lượng cao sử dụng cho phản ứng RAPD – PCR nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền chủng nấm Linh Chi ii SUMMARY The thesis title: Surveying biological and morphological fruiting body traits of Ganoderma lucidum in provinces in Vietnam Ancient times until nows, Ganoderma lucidum is well-known a super herbal, which is a panacea with capacity of strengthen the immune system, prevention of the diseases, adjustment of physiological balance, delay aging process Ganoderma lucidum contain important phamaceutical substances, especially, β-D-glucans is ability to inhibit process of cancel cells Nowadays, Ganoderma lucidum is used into industrial production and bring a large of economical profit in the world In Vietnam, in recent years, Ganoderma lucidum is also significantly notible for production and study, but which happened in small scale and household There is a few of studies about economical value and medicinal herbs of Ganoderma lucidum species in Vietnam Therefore, the thesis “Survey biological and morphological fruiting body traits of Ganoderma lucidumin some provinces in Vietnam” was conducted with purpose to evaluate Ganoderma lucidum species for economical value to apply for production Our research includes: Survey biological activity of amylase and cellulase enzyme of Ganoderma lucidum species, evaluating of growth rate, morphological fruiting body and biological performance of each strain Improving the protocol for DNA extraction of collected Ganoderma lucidum species These results are evaluated biological activity of amylase and cellulase enzyme of Ganoderma lucidum species It is recorded the differences about growth rate, diameter and thickness of fruiting body of each strain Choosing species, which is high biological performance compare with the others Extracted DNA followed advance protocol bring better results, DNA is clearner and higher concentration than old protocol These conclusion are two Ganoderma lucidum strains were collected in Nong Lam University, Ho Chi Minh City and Dong Nai province are superior than the others strains about growth rate, morphological fruiting body and biological performance Therefore, its can apply into production, bring high economic efficiency DNA extraction process after improving to ensure the extracted DNA were higher in quality and concentration, which’s able to use in RAPD – PCR reaction in the study of genetic diversity assessment of lingzhi mushroom Key words: Ganoderma lucidum, morphological fruiting body Ganoderma lucidum iii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) 2.2 Vị trí phân loại nấm Linh Chi 2.3 Nguồn gốc phân bố nấm Linh Chi 2.4 Đặc điểm hình thái nấm Linh Chi 2.5 Đặc điểm sinh học nấm Linh Chi 2.5.1 Đặc điểm sinh dưỡng nấm Linh Chi 2.5.2 Điều kiện ngoại cảnh 2.6 Công dụng nấm Linh Chi 2.6.1 Thành phần hóa học đặc tính dược lý Linh Chi 2.6.2 Công dụng nấm Linh Chi 2.7 Tình hình nghiên cứu sản xuất Linh Chi giới Việt Nam 10 2.7.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi giới 10 2.7.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi Việt Nam 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 13 3.2.1 Chủng nấm Linh Chi 13 3.2.2 Môi trường nuôi cấy nấm Linh Chi 13 iv 3.2.3 Thiết bị hóa chất dùng thí nghiệm 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp phân lập tăng sinh chủng nấm Linh Chi 16 3.3.2 Khảo sát khả tổng hợp enzyme amylase cenllulase 16 3.3.3 Khảo sát tốc độ lan tơ hình thái thể chủng nấm Linh Chi 17 3.3.4 Tách chiết DNA 18 3.3.4.1 Phương pháp ly trích DNA chủng nấm Linh Chi 18 3.3.4.2 Định tính DNA mẫu phương pháp điện di gel agarose 19 3.3.4.3 Định lượng DNA mẫu phương pháp đo mật độ quang 19 3.3.5 Phản ứng RAPD - PCR 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Khả tổng hợp enzyme amylase cellulase chủng nấm Linh Chi 21 4.1.1 Khả tổng hợp enzyme amylase chủng nấm Linh Chi 21 4.1.2 Khả tổng hợp enzyme cellulase chủng nấm Linh Chi 22 4.2 Sự phát triển nấm Linh Chi bịch phôi 23 4.2.1 Thời gian tăng trưởng tơ nấm 23 4.2.2 Tốc độ tăng trưởng trung bình tơ nấm 24 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm nấm hại bịch phôi nấm Linh Chi 25 4.2.4 Thời gian xuất thể chủng nấm Linh Chi 27 4.3 Độ lớn thể chủng nấm Linh Chi 28 4.4 Trọng lượng thể hiệu suất sinh học chủng nấm Linh Chi 31 4.5 Kết ly trích DNA chủng nấm Linh Chi 33 4.5.1 Kết định tính DNA chủng nấm Linh Chi 33 4.5.2 Kết định lượng DNA chủng nấm Linh Chi 35 4.6 Kết phân tích đa dạng di truyền nấm Linh Chi 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA Analysis of Variance CMC Carboxyl Methyl Cellulase DNA Deoxyribo Nucleic Acid EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid GC Gas Chromatography HPLC High Pressure Liquid Chromatography ICP Inductively Coupled Plasma IR Infrared Rays MS Mass Spectometry NMR Nuclear Magnetic Resonance OD Optical Density PGA Potato Glucose Agar PGAY Potato Glucose Agar Yeast TBE Tris – borate – EDTA TE Tris – EDTA UV Ultraviolet Radiation vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển nấm Linh Chi Bảng 2.2 Thành phần hóa học G lucidum Bảng 2.3 Các hoạt chất sinh học dẫn xuất nấm Linh Chi Bảng 2.4 Phân loại Linh chi tác dụng trị liệu Bảng 3.1 Nguồn gốc chủng nấm Linh Chi 13 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất thực phản ứng RAPD – PCR 19 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR 19 Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải amylase chủng nấm Linh Chi 20 Bảng 4.2 Đường kính vòng phân giải cellulose chủng nấm Linh Chi 21 Bảng 4.3 Tốc độ lan tơ trung bình chủng nấm Linh Chi 24 Bảng 4.4 Thời gian xuất thể chủng nấm Linh Chi 26 Bảng 4.5 Đường kính thể chủng nấm Linh Chi 27 Bảng 4.6 Độ dày thể chủng nấm Linh Chi 29 Bảng 4.7 Trọng lượng thể tươi chủng nấm Linh Chi 30 Bảng 4.8 Trọng lượng thể khô chủng nấm Linh Chi 30 Bảng 4.9 Hiệu suất sinh học chủng nấm Linh chi 31 Bảng 4.10 Kết đo OD chủng nấm Linh Chi quy trình chưa cải tiến 34 Bảng 4.11 Kết đo OD chủng nấm Linh Chi quy trình cải tiến 35 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Quả thể nấm Linh Chi Hình 4.1 Vòng phân giải amylase chủng nấm Linh Chi 21 Hình 4.2 Vòng phân giải cellulose chủng nấm Linh Chi 22 Hình 4.3 Tốc độ tăng trưởng tơ nấm theo thời gian 23 Hình 4.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh chủng nấm Linh Chi 25 Hình 4.5 Tỷ lệ nhiễm loại bệnh nấm Linh Chi 25 Hình 4.6 Đường kính thể chủng nấm Linh Chi 28 Hình 4.7 Độ dày thể chủng nấm Linh Chi 29 Hình 4.8 Kết điện di DNA chủng nấm Linh Chi gel agarose 1% 31 Hình 4.9 Kết điện di DNA ly trích theo quy trình cải tiến gel agarose 1% 34 Hình 4.10 Sản phẩm phản ứng RAPD – PCR 36 viii 4.5 Kết ly trích DNA chủng nấm Linh Chi 4.5.1 Kết định tính DNA chủng nấm Linh Chi DNA thông tin di truyền, vật liệu quan trọng dùng nghiên cứu thị phân tử Việc ly trích DNA có ý nghĩa quan trọng định đến thành công cho phản ứng PCR sau Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD chất lượng DNA khn không cần độ tin cao (Weising ctv, 2005), cần lượng nhỏ DNA mẫu (50 ng/μl) đủ để thực phản ứng RAPD-PCR LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN Hình 4.8 Kết điện di DNA chủng nấm Linh Chi Ly trích theo quy trình chưa cải tiến gel agarose 1% cường độ dòng điện 400 mA 30 phút Hình 4.8 cho thấy DNA tổng số ly trích theo quy trình mục 3.3.4.1 khơng tinh sạch, DNA tổng số giống nấm Linh Chi có tượng đứt, gãy (vệt smear kéo dài) lượng tạp mẫu nhiều trình nghiền chưa tốt thao tác chưa đảm bảo, đoạn DNA bị gãy thể thành vệt mờ chạy dọc theo giếng, xuất bên bên băng DNA tổng số Các vệt sáng cuối giếng phần tạp nhiễm trình tinh DNA chưa tốt Hơn hàm lượng DNA ly trích khơng nhiều Để tối ưu hóa q trình ly trích DNA, nhằm đảm bảo chất lượng số lượng DNA ly trích để sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi có số thay đổi quy trình ly trích DNA 33  Mẫu nấm ni cấy, lắc tăng sinh môi trường PGY (là môi trường PGAY không bổ sung agar) khoảng – ngày điều kiện 25oC Sau đó, để yên – ngày nấm phát triển thành mảng, giúp thao tác nghiền dễ khơng có agar  Nghiền sinh khối nấm dung dịch nitơ lỏng thành bột mịn Chuyển bột nấm vào eppendorf 1,5 ml cho bột nấm chiếm 1/3 thể tích tube Thêm 300 μl dung dịch ly trích (Extraction buffer), vortex nhẹ để tạo dịch đồng nhất, đặt eppendorf buồng ủ (Water bath) 65oC vòng  Thêm 600 μl dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, chủ yếu protein cách làm biến tính protein đồng thời khơng hòa tan acid nucleic  Tạo mơi trường muối để kết tủa DNA cách thêm 0,03 thể tích muối natri acetate 3M 0,6 thể tích isopropanal vào eppendorf Kết ly trích DNA theo quy trình cải tiến thể hiện: LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN Hình 4.9 Kết điện di DNA chủng nấm Linh Chi Ly trích theo quy trình cải tiến gel agarose 1% cường độ dòng điện 400 mA 30 phút Hình 4.9 cho thấy DNA tổng số ly trích theo quy trình cải tiến tốt so với DNA tổng số hình 4.8 DNA đứt gãy (gel bị smear) lượng tạp mẫu hơn, thể qua vệt sáng chạy dọc theo giếng mờ so với quy trình cũ 34 4.5.2 Kết định lượng DNA chủng nấm Linh Chi Bảng 4.10 Kết đo OD dung dịch DNA chủng nấm Linh Chi quy trình chưa cải tiến Nghiệm thức OD260nm OD280nm OD260nm/OD280nm Nồng độ DNA (ng/μl) LC-NL 0,016 0,009 1,78 27,30 LC-CC 0,034 0,020 1,70 54,23 LC-QN 0,026 0,015 1,73 48,82 LC-DL 0,016 0,011 1,45 24,42 LC-BD 0,052 0,030 1,73 81,16 LC-DN 0,015 0,009 1,70 24,78 LC-HN 0,076 0,040 1,90 133,62 Đối với quy trình chưa cải tiến tỷ lệ OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,45 (LCDL) đến 1,90 (LC-HN) với hàm lượng DNA từ 24,42 (LC-DL) đến 133,62 ng/μl(LCHN), hàm lượng DNA quy trình thấp nên cải tiến quy trình ly trích, kết đo OD sau: Bảng 4.11 Kết đo OD dung dịch DNA chủng nấm Linh Chi quy trình cải tiến Nghiệm thức OD260nm OD280nm OD260nm/OD280nm Nồng độ DNA (ng/μl) LC-NL 0,078 0,039 2,00 140,09 LC-CC 0,137 0,070 1,96 234,89 LC-QN 0,116 0,059 1,97 206,90 LC-DL 0,094 0,047 2,00 168,82 LC-BD 0,044 0,022 2,00 79,02 LC-DN 0,075 0,038 1,92 81,18 LC-HN 0,075 0,038 1,97 133,98 DNA có tỷ lệ OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,8 – 2,0 Mẫu sợi nấm ly trích theo quy trình cải tiến có tỷ lệ OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,92 (LC-DN) đến 2,00 (LC-NL, LC-DL, LC-BD) với hàm lượng DNA từ 79,02 (LCBD) đến 234,89 ng/μl (LC-CC) Chất lượng hàm lượng DNA có mẫu cao 35 so với quy trình chưa cải tiến, thực phản ứng RAPD – PCR cho việc đánh giá đa dang di truyền chủng nấm Linh Chi Kết định tính cho thấy tượng DNA đứt gãy lượng tạp nhiều do:  Thao tác kinh nghiệm người ly trích, q trình ly trích thao tác nhẹ nhàng, tránh làm đứt gãy DNA Việc sử dụng Nitơ lỏng thuận lợi trình ly trích, DNA đứt gãy giảm đi, hàm lượng DNA thu nhiều  Khi chuyển phần dịch phía có chứa DNA sau ly tâm, thao tác cần xác tránh lấy phần tạp phía bên lớp màng ngăn mỏng  Rã đông DNA nhiều lần ảnh hưởng đến chất lượng DNA Nếu dùng thường xuyên thời gian ngắn nên giữ DNA 4oC, bảo quản DNA -20oC trường hợp giữ mẫu lâu dài 4.6 Kết phân tích đa dạng di truyền nấm Linh Chi Hình 4.10 Sản phẩm phản ứng RAPD – PCR Giếng 1: DNA mẫu LC-NL OPU – 01; Giếng 2: DNA mẫu LC-CC OPU – 01; Giếng 3: DNA mẫu LC-QN OPC – 01; Giếng 4: DNA mẫu LC-QN OPU – 01; Giếng 5: DNA LC-DL OPU – 01; Giếng 6: ladder Điện di gel agarose 1% cường độ 400 mA 30 phút 36 Theo kết nghiên cứu khả phân loại chi Ganoderma kỹ thuật phân tử RAPD – PCR mồi đặc hiệu laccase Trịnh Tam Kiệt cho thấy kỹ thuật RAPD – PCR sử dụng để xác định mối quan hệ nguồn gốc loài Ganoderma có Việt Nam mồi ngẫu nhiên sử dụng nghiên cứu OPU – 01 Trong q trình nghiên cứu, chúng tơi sử dụng mồi OPU – 01 thực phản ứng RAPD – PCR để đánh giá đa dạng di truyền chủng nấm Linh Chi thu thập Tuy nhiên kết ban đầu (hình 4.10) cho thấy tất mẫu cho sản phẩm PCR (tương ứng băng DNA sản phẩm PCR hình điện di) có kích thước chủng nấm LC-NL, LC-CC, LC-QN LC-DL sử dụng mồi OPU – 01 Phản ứng RAPD – PCR mẫu nấm LC-QN với mồi OPC – 01 cho sản phẩm có kích thước lớn kích thước sản phẩm sử dụng mồi OPU – 01 Kết chưa thể đánh giá đa dạng di truyền chủng nấm Linh Chi Do đó, cần phải nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình phản ứng RAPD – PCR mồi OPU – 01 thực với số đoạn mồi ngẫu nhiên khác 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Các chủng nấm Linh Chi thu thập số tỉnh nước (Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bình Dương, Lâm Đồng, Quảng Nam, Hà Nội) khảo sát hoạt tính sinh học hình thái thể chủng nấm Đối với chủng nấm có tốc độ lan tơ nhanh, sợi tơ mịn, khỏe tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, sợi tơ khỏe mọc lên vết bệnh phát triển bình thường, thời gian xuất thể sớm so với chủng nấm lại, điển hình chủng nấm Linh Chi thu thập trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tỉnh Đồng Nai Các chủng nấm thu thập trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tỉnh Đồng Nai chủng nấm có đường kính thể lớn (đường kính thể trung bình 13 cm 11,9 cm), hiệu suất sinh học cao hẳn với chủng khác (lần lượt 10,02% 9,61%), thích hợp cho việc sản xuất đại trà, mang lại hiệu kinh tế cao Trong đó, nấm Linh Chi thu thập tỉnh Bình Dương có hiệu suất sinh học thấp (6,38%) DNA mẫu chủng nấm Linh Chi ly trích theo quy trình Lê Hữu Phước, DNA ly trích khơng sạch, nhiều DNA đứt gãy (vệt smear kéo dài) hàm lượng DNA ly trích khơng nhiều Qua q trình cải tiến quy trình ly trích DNA chủng nấm, chất lượng DNA cao (OD260nm/OD280nm: 1,8 – 2) hàm lượng DNA thu cao (79,02–234,89 ng/μl) so với quy trình chưa cải tiến, đảm bảo DNA ly trích sử dụng cho phản ứng RAPD – PCR nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền chủng nấm Linh Chi 5.2 Đề nghị Khảo sát đặc điểm sinh trưởng, phát triển chủng nấm Linh Chi vùng sinh thái thu thập Khảo sát số thành phần dược tính chủng nấm Linh Chi thu thập: alkaloid, polysaccharide, triterpenoid Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền chủng nấm Linh Chi kỹ thuật sinh học phân tử 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thượng Dong 2007 Nấm Linh Chi Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Kim Dung 2004 Nghiên cứu khắc phục khó khăn tách chiết ADN bất hoạt ức chế PCR Ganoderma Tạp chí Di truyền học ứng dụng, 4: – Nguyễn Lân Dũng 2002 Công nghệ trồng nấm, tập tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Duy Đại 2009 Tài liệu hướng dẫn: trồng nấm Linh Chi Công ty TNHH TM DV Thiên Hà Xanh, nông trại nấm Linh Chi NANO, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Đống 2002 Nấm ăn – Cơ sở khoa học công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hữu Đống 2003 Nuôi trồng sử dụng nấm ăn, nấm dược liệu Nhà xuất Nghệ An Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh 2000 Nấm ăn, nấm dược liệu – công dụng công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Hà Nội Nguyễn Minh Khang, 2005 Khảo sát sinh trưởng nấm Linh Chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát vùng núi Chứa Chan – Việt Nam Khóa luận Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Trịnh Tam Kiệt, Nguyễn Hồi Giang, Nguyễn Xuân Hùng, Lê Đình Lương 2005 Nghiên cứu khả phân loại chi Ganoderma kỹ thuật phân tử RAPD – PCR mồi đặc hiệu laccase Tạp chí Di truyền Ứng dụng, 1: – 10 Trần Văn Mão 2004 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 11 Lê Hữu Phước Trần Văn Hai 2011 Định danh số chủng nấm ký sinh côn trùng từ hai loài nấm Metarhizium Anisopliae sokorin, Beauveria basiana vuillemin đồng sông Cửu Long phương pháp PCR Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 18b: 212 – 218 12 Vũ Văn Sáng 2003 Giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 13 Lê Xuân Thám 1998 Nấm Linh Chi thuốc quý Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 14 Lê Duy Thắng 2006 Kỹ thuật trồng nấm, tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Erkel I.E 2009 The effect of different substrate medium on yield of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst Journal of food, Agriculture and Enviroment, 7: 841 – 844 39 Jong, S C and Birmingham, M J 1992 Medical benefits of the mushroom Ganoderma Advance and Applied Microbiology, 37: 101-134 John M.S Barlett, David Stirling 2002 Methods in Molecular Biology Vol 226 PCR protocols, 2nd edition Humana press Inc., Totowa, NJ Kamal Hossain 2009 Cultivation of Reishi Mushroom (Ganoderma lucidum) on sawdust of different tree species Bangladesh Journal Mushroom, 3: – 5 Sambrook, J Fritsch, E.F and Maniatis, T 1989 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Yihual Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng zhou 2001 Extraction of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland Yihual Gao, Jin Lan and Zhifang Liu 2001 Extraction and determination of ganoderma polysaccharides Int Med Complement Med Vol 1, Supplement Weising K, Nybom H, K Wolf, Kahl G 2005 DNA Finger CRC Press, Taylor and Francis Tài liệu Internet Daniel Sliva 2003 Ganoderma lucidum (Reishi) in Cancer Treatment 10 Lingzhi experts 1987 About Lingzhi 11 Nguyễn Duy Chính 1998 Cây nấm Linh Chi 12 13 14 15 16 17 18 40 PHỤ LỤC Phụ lục Hình Bịch phơi nấm Linh Chi bố trí nghiệm thức Phụ lục Bảng Tỷ lệ nhiễm (%) chủng nấm Linh Chi Loại bệnh Mốc xanh Mốc đen Nấm khác Không lan tơ LC-NL 0,48 0 LC-CC 1,90 1,43 0,48 0,95 LC-QN 1,43 0,95 0,48 LC-DL 1,90 2,38 0,48 0,95 LC-BD 2,38 0,95 0,95 0,95 LC-DN 0,48 0 LC-HN 3,33 1,90 2,38 Bảng Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm đo vòng phân giải amylase Nghiệm thức LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 2.60 2.35 3.30 3.40 3.05 3.60 2.95 Lần lặp lại 3.80 2.85 3.40 3.40 3.05 3.45 2.55 3.00 3.00 2.75 3.35 2.95 4.00 3.20 Trung bình Sai số 3.133 2.733 3.150 3.383 3.017 3.683 2.900 0.61 0.34 0.35 0.03 0.06 0.28 0.33 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm đo vòng phân giải amylase Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 1.778 0.296 2.580 0.0676 Within 14 1.608 0.115 -Total 20 3.386 Bảng Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm đo vòng phân giải cellulose Nghiệm thức LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 3.75 2.55 3.30 3.65 3.45 3.95 3.55 Lần lặp lại 2.95 3.15 3.05 3.55 3.50 4.10 3.25 2.65 3.20 3.15 3.60 3.25 3.85 3.20 Trung bình Sai số 3.117 2.967 3.167 3.600 3.400 3.967 3.333 0.57 0.36 0.13 0.05 0.13 0.13 0.19 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm đo vòng phân giải cellulose Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 2.037 0.340 4.388 0.0106 Within 14 1.083 0.077 -Total 20 3.121 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm đo vòng phân giải cellulase Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Original = = = = = = = Order 3.117 2.967 3.167 3.600 3.400 3.967 3.333 BC C BC AB BC A BC Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 3.967 = 3.600 = 3.400 = 3.333 = 3.167 = 3.117 = 2.967 A AB BC BC BC BC C Bảng Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát tốc độ lan tơ Linh chi LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 0.870 0.493 0.617 0.406 0.411 0.846 0.354 Lần lặp lại 0.886 0.497 0.583 0.463 0.459 0.892 0.370 0.816 0.488 0.599 0.366 0.432 0.810 0.494 Trung bình Sai số 0.857 0.493 0.600 0.412 0.434 0.849 0.406 0.04 0.00 0.02 0.05 0.02 0.04 0.08 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát tốc độ lan tơ Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 0.712 0.119 68.260 0.0000 Within 14 0.024 0.002 -Total 20 0.736 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát tốc độ lan tơ Original Order Mean = 0.8573 Mean = 0.4927 Mean = 0.5997 Mean = 0.4117 Mean = 0.4340 Mean = 0.8493 Mean = 0.4060 A BC B C C A C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 0.8573 = 0.8493 = 0.5997 = 0.4927 = 0.4340 = 0.4117 = 0.4060 A A B BC C C C Bảng 10 Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian suất thể chủng nấm Linh Chi Linh chi LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 26 51 37 52 50 27 52 Lần lặp lại 26 52 39 55 49 27 53 27 52 39 53 52 28 53 Trung bình Sai số 26.333 51.667 38.333 53.333 50.333 27.333 52.667 0.58 0.58 1.15 1.53 1.53 0.58 0.58 Bảng 11 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát thời gian xuất thể chủng nấm Linh Chi Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 2621.905 436.984 417.121 0.0000 Within 14 14.667 1.048 -Total 20 2636.571 Bảng 12 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian suất thể chủng nấm Linh Chi Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Original Order = 26.33 = 51.67 = 38.33 = 53.33 = 50.33 = 27.33 = 52.67 D AB C A B D AB Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 53.33 = 52.67 = 51.67 = 50.33 = 38.33 = 27.33 = 26.33 A AB AB B C D D Bảng 13 Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát đường kính thể Linh chi LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 13.2 7.1 9.1 8.1 6.5 12.5 8.6 Lần lặp lại 12.8 7.7 9.5 7.8 7.3 11.2 7.4 13.0 7.2 9.7 8.0 7.8 12.0 8.1 Trung bình Sai số 13.000 7.333 9.433 7.967 7.200 11.900 8.033 0.20 0.32 0.31 0.15 0.66 0.66 0.60 Bảng 14 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát đường kính thể Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 96.360 16.060 75.789 0.0000 Within 14 2.967 0.212 -Total 20 99.327 Bảng 15 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát đường kính thể Original Order Mean = 13.00 Mean = 7.333 Mean = 9.433 Mean = 7.967 Mean = 7.200 Mean = 11.90 Mean = 8.033 A C B C C A C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 13.00 = 11.90 = 9.433 = 8.033 = 7.967 = 7.333 = 7.200 A A B C C C C Bảng 16 Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát độ dày thể Linh chi LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 1.4 1.7 1.6 1.8 1.3 1.3 1.6 Lần lặp lại 1.3 1.8 1.8 1.9 1.5 1.2 1.5 1.5 1.8 1.5 1.6 1.6 1.5 1.8 Trung bình Sai số 1.400 1.767 1.633 1.767 1.467 1.333 1.633 0.10 0.06 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 Bảng 17 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát độ dày thể Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 0.543 0.090 4.872 0.0069 Within 14 0.260 0.019 -Total 20 0.803 Bảng 18 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát độ dày thể Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Original Order = 1.400 = 1.767 = 1.633 = 1.767 = 1.467 = 1.333 = 1.633 AB A AB A AB B AB Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 1.767 = 1.767 = 1.633 = 1.633 = 1.467 = 1.400 = 1.333 A A AB AB AB AB B Bảng 19 Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát trọng lượng thể tươi Linh chi LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 56.2 41.2 43.0 41.8 35.2 56.1 40.5 Lần lặp lại 58.1 38.3 45.1 45.0 33.4 53.3 39.1 53.9 40.6 47.5 46.2 38.6 52.1 43.2 Trung bình Sai số 56.067 40.033 45.200 44.333 35.733 53.833 40.933 2.10 1.53 2.25 2.27 2.64 2.05 2.08 Bảng 20 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát trọng lượng thể tươi Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 983.629 163.938 35.266 0.0000 Within 14 65.080 4.649 -Total 20 1048.709 Bảng 21 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát trọng lượng thể tươi Original Order Mean = 56.07 Mean = 40.03 Mean = 45.20 Mean = 44.33 Mean = 35.73 Mean = 53.83 Mean = 40.93 A BC B B C A BC Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 56.07 = 53.83 = 45.20 = 44.33 = 40.93 = 40.03 = 35.73 A A B B BC BC C Bảng 22 Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát trọng lượng thể khơ Linh chi LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 18.7 13.7 14.4 14.0 11.7 18.6 14.0 Lần lặp lại 18.9 12.5 14.6 14.6 11.3 17.5 13.6 17.5 13.3 14.9 15.1 11.9 17.1 14.3 Trung bình Sai số 18.367 13.167 14.633 14.567 11.633 17.733 13.967 0.76 0.61 0.25 0.55 0.31 0.78 0.35 Bảng 23 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát trọng lượng thể khô Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 104.300 17.383 57.039 0.0000 Within 14 4.267 0.305 Total 20 108.567 Bảng 24 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát trọng lượng thể khô Original Order Mean = 18.37 Mean = 13.17 Mean = 14.63 Mean = 14.57 Mean = 11.63 Mean = 17.73 Mean = 13.97 A C B BC D A BC Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 18.37 = 17.73 = 14.63 = 14.57 = 13.97 = 13.17 = 11.63 A A B BC BC C D Bảng 25 Bảng xử lý số liệu thống kê thí nghiệm đánh giá hiệu suất sinh học Linh chi LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN 10.04 7.36 7.69 7.46 6.29 10.02 7.23 Lần lặp lại 10.38 6.84 8.06 8.04 5.96 9.52 6.98 9.63 7.25 8.48 8.25 6.89 9.30 7.71 Trung bình Sai số 10.017 7.150 8.077 7.917 6.380 9.613 7.307 0.38 0.27 0.40 0.41 0.47 0.37 0.37 Bảng 26 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát hiệu suất sinh học Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 31.440 5.240 35.410 0.0000 Within 14 2.072 0.148 Total 20 33.512 Bảng 27 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm đánh giá hiệu suất sinh học chủng nấm Linh Chi Original Order Mean = 10.02 Mean = 7.150 Mean = 8.077 Mean = 7.917 Mean = 6.380 Mean = 9.613 Mean = 7.307 A BC B B C A BC Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 10.02 = 9.613 = 8.077 = 7.917 = 7.307 = 7.150 = 6.380 A A B B BC BC C ... đặc điểm hình thái thể chủng nấm Linh Chi thu thập số tỉnh nước Đánh giá suất sinh học chủng nấm Linh Chi thu thập số tỉnh nước Thiết lập quy trình ly trích DNA từ chủng nấm Linh Chi thu thập nhằm... Nghiên cứu hoạt tính sinh học hình thái thể chủng nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) thu thập số tỉnh nước thực không mang ý nghĩa mặt kinh tế mà góp phần vào việc nghiên cứu chủng nấm Linh Chi. .. Chí Minh LC-CC Nấm Linh Chi thu thập Quảng Nam LC-QN Nấm Linh Chi thu thập Đà Lạt LC-DL Nấm Linh Chi thu thập Bình Dương LC-BD Nấm Linh Chi thu thập Đồng Nai LC-DN Nấm Linh Chi thu thập Hà Nội LC-HN