Nghiên cứu các acetogenin và các thành phần hóa học khác từ hạt cây na annona squamosa l annonaceae

Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Hợp NGHIÊN CỨU CÁC ACETOGENIN VÀ CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC KHÁC TỪ HẠT CÂY NA (ANNONA SQUAMOSA L., ANNONACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Luận văn Thạc sĩ Hà Nội – Năm 2014 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Hợp NGHIÊN CỨU CÁC ACETOGENIN VÀ CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC KHÁC TỪ HẠT CÂY NA (ANNONA SQUAMOSA L., ANNONACEAE) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60440114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS PHAN MINH GIANG Hà Nội – Năm 2014 Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 LỜI CẢM ƠN Luận văn thạc sĩ hồn thành Phịng thí nghiệm Hố học hợp chất thiên nhiên, Bộ mơn Hố hữu cơ, Khoa Hoá học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Phan Minh Giang, người giao đề tài, hết lịng hướng dẫn bảo tận tình, tạo điều kiện thí nghiệm thuận lợi giúp đỡ em suốt trình làm luận văn thạc sĩ Để có kết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TSKH Phan Tống Sơn, người quan tâm đến vấn đề nghiên cứu luận văn này, tạo điều kiện thí nghiệm thuận lợi giúp đỡ em hồn thành luận văn thạc sĩ Cuối em xin cảm ơn thầy, anh, chị em sinh viên Phịng thí nghiệm Hố học hợp chất thiên nhiên tạo môi trường nghiên cứu thuận lợi giúp đỡ em thời gian em nghiên cứu hoàn thành luận văn thạc sĩ Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2014 Học viên cao học Nguyễn Quang Hợp Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ NA (ANNONACEAE) 1.1.1 Tổng quan họ Na (Annonaceae) chi Na (Annona) 1.1.2 Mô tả thực vật Na (Annona squamosa L.) 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Các ứng dụng y học cổ truyền Na 1.2 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ ANNONA SQUAMOSA L 1.2.1 Các hợp chất acetogenin từ Annona squamosa L 1.2.2 Các hợp chất thành phần khác từ Annona squamosa 18 1.2.3 Các hợp chất acetogenin khác thiên nhiên 26 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 PHƢƠNG PHÁP CHIẾT VÀ PHÂN TÁCH CÁC HỢP CHẤT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 36 2.1.1 Phƣơng pháp chiết 36 2.1.2 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách phân lập sắc ký 36 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC 37 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 38 3.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 38 3.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 38 3.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ HẠT CÂY NA 38 3.4 PHÂN TÍCH SẮC KÍ LỚP MỎNG CÁC PHẦN CHIẾT 39 3.4.1 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết diclometan (AS1D) 40 3.4.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết diclometan (AS2D) 41 3.4.3 Phân tích sắc kí phần chiết etyl axetat (ASE) 42 3.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 43 3.5.1 Phân tách phần chiết diclometan (AS1D) 43 3.5.2 Phân tách phần chiết diclometan (AS2D) 45 3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (ASE) 45 3.6 HẰNG SỐ VẬT LÍ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 46 3.6.1 Chất AS1D3.0 (Solamin) 46 Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp 3.6.2 3.6.3 3.6.4 3.6.5 3.6.6 3.6.7 Cao học Hóa hữu – K22 Chất AS1D3.1 (Squamocin J) 46 Chất AS1D3.42 (Squamocin G) 47 Chất AS1D3.7 (4-Dehydroxyannonin IV 4-Dehydroxyannonin VIII) 48 Chất AS1D5.6 (Squamocin) 49 Chất AS1D7.2 (Annonin IV Annonin VIII) 50 Chất AS1D7.4 (Annonin XVI) 51 3.6.8 Chất AS1D10 (β-Sitosterol 3-O- -D-glucopyranosid Stigmaterol 3O- -D-glucopyranosid) 52 3.6.9 Chất ASE3.4.4 (N-trans-Caffeoyl-tyramin) 53 3.6.10 Chất ASE5.2 (Squamin A Squamin B) 53 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 56 4.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ HẠT NA 56 4.3 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT TỪ HẠT NA 59 4.3.1 Phân tách sắc kí phần chiết diclometan (AS1D) 59 4.3.2 Phân tách sắc kí phần chiết etyl axetat (ASE) 61 4.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 61 4.4.1 Solamin (AS1D3.0) 62 4.4.2 Squamocin J (AS1D3.1) 64 4.4.3 Squamocin G (AS1D3.4.2 AS1D5.4) 66 4.4.4 4-Dehydroxyannonin IV 4-Dehydroxyannonin VIII (AS1D3.7) 68 4.4.5 Squamocin (AS1D5.6) 70 4.4.6 Annonin IV Annonin VIII (AS1D7.2) 72 4.4.7 Annonin XVI (AS1D7.4) 74 4.4.8 β-Sitosterol 3-O- -D-glucopyranosid (AS1D10a) Stigmaterol 3-O- D-glucopyranosid (AS1D10b) 77 4.4.9 N-trans-Caffeoyl-tyramin (ASE3.4.4) 78 4.4.10 Squamin A (ASE5.2a) Squamin B (ASE5.2b) 79 KẾT LUẬN 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT CC (Column Chromatography): Sắc kí cột dƣới trọng lực dung mơi DEPT (Disstortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT ESI-MS (ElectroSpray Ionisation-Mass Spectrometry): Phổ khối lƣợng ion hóa phun bụi điện tử FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc kí lỏng hiệu cao NMR (Nuclear Magnetic Resonance): Cộng hƣởng từ hạt nhân Mini-C (Mini-Column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon-13 Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lá Na (Annona squamosa L., Annonaceae) Hình 1.2 Hoa Na (Annona squamosa L., Annonaceae) Hình 3.1 Sắc ký cột điều chế Hình 4.1 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D3.0 Hình 4.2 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D3.1 Hình 4.3 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D3.4.2 Hình 4.4 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D3.7 Hình 4.5 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D5.6 Hình 5.6 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D7.2a AS1D7.2b Hình 4.7 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D7.4 Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng: Bảng 3.1 Phân tích TLC phần chiết AS1D Bảng 3.2 Phân tích TLC phần chiết AS2D Bảng 3.3 Phân tích TLC phần chiết ASE Bảng 4.1 Hiệu suất thu nhận phần chiết từ hạt Na (phƣơng pháp chiết 1) Bảng 4.2 Hiệu suất thu nhận phần chiết từ hạt Na (phƣơng pháp chiết 2) Sơ đồ: Sơ đồ 4.1 Quy trình điều chế phần chiết từ hạt Na Sơ đồ 4.2 Quy trình phân tách phần chiết diclometan (AS1D) Sơ đồ 4.3 Quy trình phân tách phần chiết etyl axetat (ASE) Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H-NMR Solamin (AS1D3.0) Phụ lục Phổ 13C-NMR Solamin (AS1D3.0) Phụ lục Phổ (+)-ESI-MS Solamin (AS1D3.0) Phụ lục Phổ 1H-NMR Squamocin J (AS1D3.1) Phụ lục Phổ 13C-NMR Squamocin J (AS1D3.1) Phụ lục Phổ (+)-ESI-MS Squamocin J (AS1D3.1) Phụ lục Phổ 1H-NMR Squamocin G (AS1D3.4.2) Phụ lục Phổ 13C-NMR Squamocin G (AS1D3.4.2) Phụ lục Phổ (+)-ESI-MS Squamocin G (AS1D3.4.2) Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR 4-Dehydroxyannonin IV 4-Dehydroxyannonin VIII (AS1D3.7) Phụ lục 11 Phổ 13C-NMR 4-Dehydroxyannonin IV 4-Dehydroxyannonin VIII (AS1D3.7) Phụ lục 12 Phổ (+)-ESI-MS 4-Dehydroxyannonin IV 4-Dehydroxyannonin VIII (AS1D3.7) Phụ lục 13 Phổ 1H-NMR Squamocin (AS1D5.6) Phụ lục 14 Phổ 13C-NMR Squamocin (AS1D5.6) Phụ lục 15 Phổ (+)-ESI-MS Squamocin (AS1D5.6) Phụ lục 16 Phổ 1H-NMR Annonin IV Annonin VIII (AS1D7.2) Phụ lục 17 Phổ 13C-NMR Annonin IV Annonin VIII (AS1D7.2) Phụ lục 18 Phổ (+)-ESI-MS Annonin IV Annonin VIII (AS1D7.2) Phụ lục 19 Phổ 1H-NMR Annonin XVI (AS1D7.4) Phụ lục 20 Phổ 13C-NMR Annonin XVI (AS1D7.4) Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 Phụ lục 21 Phổ (+)-ESI-MS Annonin XVI (AS1D7.4) Phụ lục 22 Phổ 1H-NMR β-Sitosterol Stigmaterol (AS1D10) Phụ lục 23 Phổ 1H-NMR N-trans-caffeoyl-tyramin (ASE3.4.4) Phụ lục 24 Phổ 1H-NMR Squamin A Squamin B (ASE5.2) Phụ lục 25 Phổ 13C-NMR Squamin A Squamin B (ASE5.2) Phụ lục 26 Phổ DEPT Squamin A Squamin B (ASE5.2) Luận văn Thạc sĩ 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 151,8 131,2 (nối đôi α,β)] V ng lacton đƣợc xác định nhờ tín hiệu nhóm oxymetin δH 5,05 (1H, qd, J = 7,0 Hz, 2,0 Hz); δC 77,9 Tuy nhiên, độ chuyển dịch hóa học tín hiệu proton cacbon-13 vòng γ-lacton cho thấy ảnh hƣởng nhóm C-4 hydroxy số γ-lacton cuối mạch Annonaceae acetogenin [28] Do đó, cấu trúc 4-hydroxy metyl γ-lacton cuối mạch (cấu trúc A) AS1D7.2 đƣợc xác định [28] cấu trúc A Các kiện phổ 13 C-NMR cho thấy nhóm oxymetin cịn lại AS1D7.2 δC 71,6, 74,1, 74,3, 74,5, 74,6, 79,4, 82,0, 82,3, 82,7, 82,8 83,3 tạo thành hệ vòng bis-THF (cấu trúc B) Sự nhân đơi số tín hiệu hệ vịng cho thấy tồn cặp đồng phân lập thể đia OH O O OH OH cấu trúc B Cấu trúc B đƣợc liên kết với cấu trúc A nhóm metyl cuối mạch qua đơn vị metylen mạch dài cho cấu trúc C acetogenin dạng vòng bistetrahydrofuran (bis-THF) cấu trúc C Phổ (+)-ESI-MS xác định công thức phân tử C37H66O8 (M = 638) AS1D7.2 qua pic ion giả phân tử m/z 639,37 ([M + H]+) 661,34 ([M + Luận văn Thạc sĩ 73 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 Na]+) Pic ESI-MS m/z 334,24 ([311 + Na]+) cho thấy phân cắt liên kết C15 C-16, xác định chiều dài mạch cacbon m = 10 n = Cấu hình tƣơng đối AS1D7.2 đƣợc xác định dựa so sánh độ chuyển dịch hóa học phổ 1H-NMR 13 C-NMR Dựa tín hiệu phổ cacbon-13 sáu nhóm oxymetin δC 74,1, 74,3, 74,5, 79,4, 82,0, 82,7 82,8, đồng phân lập thể đia (AS1D7.2a) đƣợc xác định có cấu hình tƣơng đối threo-trans-threo-trans-erythro vịng THF nhóm hydroxy liền kề Với tín hiệu cacbon-13 hệ vịng bis-THF hai nhóm hydroxy bậc hai δC 71,6, 74,5, 74,6, 79,5, 82,0, 82,3 83,3, đồng phân lập thể đia lại (AS1D7.2b) đƣợc xác định có cấu hình tƣơng đối erythro-trans-threo-trans-erythro [28] Hóa lập thể rel-36S v ng lacton đƣợc xác định từ giá trị δC 77,9 Do đó, cấu trúc chất đƣợc xác định annonin XIV (AS1D7.2a) annonin VIII (AS1D7.2b) Các chất acetogenin đƣợc phân lập từ Annona squamosa [28] threo trans threo trans threo OH (CH2)9 H3C (CH2)10 O OH CH3 O OH AS1D7.2a OH O O erythro trans threo trans threo OH (CH2)9 H3C (CH2)10 O OH CH3 O AS1D7.2b OH OH O O Hình 4.6 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D7.2a AS1D7.2b 4.4.7 Annonin XVI (AS1D7.4) Hợp chất AS1D7.4 đƣợc phân lập từ phần chiết diclometan (AS1D) dƣới dạng bột vơ định hình màu trắng, Rf = 0,43 (TLC, sillica gel, n-hexan/axeton 5:2, v:v) Luận văn Thạc sĩ 74 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 Các kiện phổ 1H-NMR 13 C-NMR hợp chất AS1D7.4 cho thấy có mặt vịng metyl γ-lacton α,β khơng no qua tín hiệu nhóm metyl doublet [δH 1,41 (3H, d, J = 7,0 Hz); δC 19,2], nhóm metin olefinic [δH 6,99 (1H, d, J = 1,5 Hz)] nhóm cacbonyl α,β khơng no [δC 174,6 (nhóm cacbonyl); 148,8 134,4 (nối đơi α,β)] V ng lacton đƣợc xác định nhờ tín hiệu nhóm oxymetin δH 4,99 (1H, q, J = 7,5 Hz); δC 77,4 Nhƣ cấu trúc metyl γ-lacton cuối mạch đặc trƣng cho Annonaceae acetogenin (cấu trúc A) đƣợc xác định [43] cấu trúc A Trên phổ 13C-NMR có xuất tám nhóm oxymetin δC 71,7, 71,9, 74,4, 74,5, 79,4, 82,0, 82,3 83,3 Các tín hiệu phải thuộc hai vịng tetrahydrofuran liên kết với (δC 79,4, 82,0, 82,3 83,3) nằm hai nhóm hydroxymetin liền kề (δC 71,7 74,5); hai tín hiệu cịn lại δC 71,9 74,4 hai nhóm hydroxymetin khác nhóm (δC 71,9) liên kết với mạch nhánh acetogenin nhóm cịn lại liên kết với vịng tetrahydrofuran Tám proton cacbinol cộng hƣởng δH 3,42 (2H, s br), 3,61 (1H, s br), 3,82 (4H, m) 3,94 (2H, m) (cấu trúc B) cấu trúc B Luận văn Thạc sĩ 75 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 Cấu trúc B đƣợc liên kết với cấu trúc A nhóm metyl cuối mạch [δH 0,89 (3H, t, J = 7,0 Hz)] qua đơn vị metylen mạch dài cho cấu trúc C acetogenin dạng vòng bis-tetrahydrofuran (bis-THF) Sự lắp ghép cho nhóm cacbinol hệ vịng bis-THF nhóm metyl cuối mạch phù hợp với phân mảnh quan sát đƣợc phổ ESI-MS cấu trúc C Phổ (+)-ESI-MS xác định công thức phân tử C37H88O8 (M = 638) AS1D7.4 qua pic ion giả phân tử m/z 639,34 ([M + H]+) 661,30 ([M + Na]+) Trên phổ ESI-MS m/z 318,23 ([295 + Na]+) cho thấy phân cắt liên kết C-15 C-16 pic m/z 540 ([535 + Na  H2O]+) cho thấy phân cắt liên kết C28 C-29 chiều dài mạch cac on đƣợc xác định k = 12, m = 3, n = Cấu hình tƣơng đối AS1D7.4 đƣợc xác định dựa so sánh độ chuyển dịch hóa học phổ 1H-NMR 13C-NMR Các kiện phổ NMR sáu nhóm oxymetin δH 3,42 (2H, s br), 3,61 (1H, s br), 3,82 (4H, m) 3,94 (2H, m); δC 71,7, 71,9, 74,4, 74,5, 77,4, 79,4, 82,0, 82,2 83,3 AS1D7.4 phù hợp với cấu hình erythro-trans-threo-trans-threo hai vịng THF nhóm hydroxy rel-36S giống nhƣ annonin XVI đƣợc phân lập từ Annona squamosa [28] Hóa lập thể rel-36S v ng lacton đƣợc xác định từ giá trị δ C 77,4 Do đó, cấu trúc AS1D7.4 đƣợc xác định annonin XVI erythro trans threo trans threo OH (CH2)5 (CH2)12 (CH2)3 H3C O OH CH3 O OH OH O O Hình 4.7 Cấu trúc lập thể tƣơng đối AS1D7.4 Luận văn Thạc sĩ 76 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 4.4.8 β-Sitosterol 3-O- -D-glucopyranosid (AS1D10a) Stigmaterol 3-O- -Dglucopyranosid (AS1D10b) Chất AS1D10 đƣợc phân lập từ phần chiết diclometan (AS1D) dƣới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,69 (TLC, sillica gel, n-hexan/axeton 5:2, v:v) 29 28 CH2CH3 21 23 20 19 11 13 14 H 17 25 H 26 16 15 10 24 22 18 12 CH2CH3 27 GlcO AS1D10a GlcO AS1D10b Phổ 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD) AS1D10 cho thấy chất hỗn hợp chất AS1D10a (β-sitosterol 3-O- -D-glucopyranosid) AS1D10b (stigmaterol 3-O- -D-glucopyranosid) với tỷ lệ 3:7 (theo phổ 1H-NMR) Các tín hiệu đáng xuất phổ 1H-NMR vùng trƣờng thấp bao gồm tín hiệu proton olefinic nối đơi ba lần H 5,37 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6) nhóm metin cacbinol H 3,83 (1H, d, J = 11,0 Hz, 3,0 Hz, H-3) Cặp tín hiệu proton olefinic vị trí vicinal nối đơi có dạng hình học trans (J = 15,0 Hz) mạch nhánh AS1D10b xuất H 5,01 (1H, dd, J = 15,0 Hz, 8,5 Hz, H-23) 5,15 (1H, dd, J = 15,0 Hz, 8,5 Hz, H-22); tín hiệu có cƣờng độ thấp tín hiệu tổng  -sitosterol 3-O- -Dglucopyranosid stigmasterol 3-O- -D-glucopyranosid Các tín hiệu cộng hƣởng nhóm metyl AS1D10a AS1D10b xuất dạng chồng khuất phần vùng trƣờng cao từ H 0,68 - 1,01 Các phân tích kỹ lƣỡng phổ dãn cho phép xác định cộng hƣởng hai nhóm metyl bậc ba C-18 H 0,69 (AS1D10a) 0,70 (AS1D10b), hai nhóm metyl bậc ba C-19 H 1,01 (AS1D10a AS1D10b), hai nhóm metyl bậc hai C-21 dƣới dạng doublet (d, J = 6,5 Hz) H 0,92 (AS1D10a AS1D10b), hai nhóm metyl bậc C-29 dƣới dạng triplet (t, J = 7,5 Hz) H 0,85 (AS1D10a) 0,84 (AS1D10b) hai nhóm isopropyl C-24 H 0,81 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26) 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, Luận văn Thạc sĩ 77 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 CH3-27) (AS1D10a) 0,79 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26) 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27) (AS1D10b) Ngồi ra, tín hiệu xác định nhóm glucopyranosid proton anomeric H 4,40 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1') H 3,24 - 3,78 (H-2', H-3', H4', H-5', H-6') Các kiện phổ hoàn toàn phù hợp với phổ chất chuẩn tài liệu tham khảo  -sitosterol 3-O- -D-glucopyranosid stigmasterol 3-O- -D-glucopyranosid [22] 4.4.9 N-trans-Caffeoyl-tyramin (ASE3.4.4) Hợp chất ASE3.4.4 đƣợc phân lập từ phần chiết etyl axetat (ASE) dƣới dạng bột vơ định hình màu trắng, Rf = 0,55 (TLC, sillica gel, CH2Cl2/MeOH 9:1, v:v) Phổ 1H-NMR ASE3.4.4 cho thấy tín hiệu cộng hƣởng từ proton nhóm caffeoyl với tín hiệu proton liên kết đơi α,β khơng no có cấu hình trans (J = 16,5 Hz) δH 6,35 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-2) 7,41 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-3) v ng enzen ba lần 1,3,4 δH 6,78 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-8), 6,91 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 2,0 Hz, H-9) 7,02 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5) Phần tyramin có tín hiệu cộng hƣởng từ proton hai nhóm metylen δH 2,76 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-2') 3,47 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1'), có nhóm liên kết với nitơ chuyển dịch phía trƣờng thấp (δH 3,47) v ng enzen 1,4 với tín hiệu doublet hai proton đặc trƣng δH 6,73 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-4', H8') 7,06 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-5', H-7') Các kiện phổ NMR xác định cấu trúc N-trans-caffeoyl-tyramin ASE3.4.4 Các kiện phổ 1H-NMR chất hoàn toàn phù hợp đƣợc so sánh với phổ dẫn xuất phenolic tyramin từ Annona cherimola [41, 42] Hợp chất ASE3.4.4 lần đƣợc phân lập từ Annona squamosa Luận văn Thạc sĩ 78 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 4.4.10 Squamin A (ASE5.2a) Squamin B (ASE5.2b) Hợp chất ASE5.2 đƣợc phân lập từ phần chiết etyl axetat (ASE) dƣới dạng ột vơ định hình màu trắng, Rf = 0,55 (TLC, sillica gel, CH2Cl2/MeOH 9:1, v:v) ASE5.2a/ASE5.2b Các kiện phổ H-NMR ASE5.2 cho nhiều thơng tín hữu ích đơn vị amino acid chất peptid đƣợc so sánh với phổ chất peptid đƣợc phân lập từ số loài Annona [8, 14, 21, 44] Sự xuất số tín hiệu kép phổ 1H-NMR 13 C-NMR cho thấy có cặp đồng phân cấu hình chất peptid ASE5.2, tƣợng gặp với peptid có nhiều gốc amino acid [44] Trong khoảng từ δH 0,76 đến 1,40 tín hiệu nhóm metyl ao gồm nhóm metyl dạng triplet nhóm metyl khác dạng dou let, từ δH 1,80 đến 2,80 tín hiệu nhóm metylen metin, từ δH 3,40 đến 5,20 nhóm metin liên kết với oxy từ δH 6,60 đến 7,10 cụm hai nhóm metin v ng thơm tƣơng tác với Sự phân tích kỹ lƣỡng phổ 1H-NMR kết hợp với giá trị độ chuyển dịch hóa học phổ 13 C-NMR tính ội phổ DEPT cho phép xác định gốc amino acid chất peptid ASE5.2 Gốc Ile hai đồng phân xuất tƣơng ứng δH 0,76 (3H, t, J = 6,5 Hz, Ile- CH3), 0,88 (3H, dd, J = 7,0 Hz, 2,5 Hz, Ile-' CH3) 0,76 (3H, t, J = 6,5 Hz, Ile- CH3), 0,90 (3H, dd, J = 7,5 Hz, 2,5 Hz, Ile-' CH3), 1,80-2,55 (3H, m, Ile- H, 2Ile- H) 4,10-4,40 (1H, m, Ile- H) Hai gốc Ala xuất δH 0,99 (3H, d, J = 7,5 Hz, Ala- CH3) 4,10-4,40 (1H, m, Ala- H) Hai gốc Val đƣợc nhìn thấy δH 1,03 (3H, d, J = 7,0 Hz, Val- CH3) 1,18 (3H, d, J = 7,5 Hz, Val- CH3), 1,80-2,55 (1H, m, Val- H) Luận văn Thạc sĩ 79 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 4,70 (1H, t, J = 7,5 Hz, Val- H) Hai gốc Thr δH 1,40 (3H, d, J = 7,5 Hz, Thr-  CH3) 5,06 (1H, m, Thr- H) Hai gốc Tyr cộng hƣởng δH 6,70 (2H, d , J = 8,0 Hz, Tyr- H), 7,0 (2H, t , J = 8,0 Hz, Tyr- H) δH 6,70 (2H, d , J = 8,0 Hz, Tyr- H), 7,01 (2H, t , J = 8,0 Hz, Tyr- H), 3,40-3,80 (2H, m, 2Tyr- H) 4,82 (1H, m, Tyr- H) Sự khác iệt hai nhóm S(O)CH3 δH 2,38 (3H, s) 2,51 (3H, s) đặc iệt đáng , điều cho phép xác định tồn hai đồng phân cấu hình nhƣ đƣợc mô tả cho squamin A squamin B tài liệu [44] Các nhóm metyl thuộc hai gốc amino acid OMet (methionine sulfoxide); nhóm khác gốc amino acid cộng hƣởng δH 4,10-4,40 (1H, m, OMet- H) 1,80-2,55 (4H, m, 2OMet- H, 2OMet- H) Ngoài gốc amino acid c n có hai gốc amino acid khác Gly với nhóm metylen xuất δH 3,40-3,80 (2H, m, 2Gly- H) Pro δH 1,80-2,55 (4H, m, 2Pro- H, 2Pro- H) 4,10-4,40 (3H, m, Pro- H, 2Pro- H) Sự xác định gốc amino acid đƣợc khẳng định ởi tín hiệu cac on-13 tƣơng ứng Sau gốc amino acid đƣợc xác định cấu trúc ASE5.2a ASE5.2b đƣợc xác định dựa so sánh phổ NMR với chất octapeptid từ loài Annona cho thấy phù hợp lần lƣợt với chất squamin A (cyclic-Gly-Thr-Val-Ala-Ile-Pro-OMet-Tyr) squamin B (cyclicGly-Thr-Val-Ala-Ile-Pro-OMet-Tyr) [44] Do gốc amino acid đƣợc cho tiếp nhận cấu hình L, khác iệt cấu hình gốc OMet Hai octapeptid lần đƣợc phân lập từ A squamosa Trung Quốc [44] Luận văn Thạc sĩ 80 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 KẾT LUẬN Luận văn thạc sĩ "Nghiên cứu hợp chất acetogenin thành phần khác từ hạt Na (Annona squamosa L., Annonaceae)" đƣợc thực nhằm xác định thành phần hóa học, đặc biệt acetogenin, hạt Na (Annona squamosa L.) Việt Nam Hạt Annona squamosa đƣợc xác định nguồn acetogenin có hoạt tính chống ung thƣ với chế tác dụng mới; nhiên, chƣa có nghiên cứu hệ thống xác định thành phần hạt Na Việt Nam Luận văn hoàn thành nhiệm vụ chiết tách, phân tích phân tách sắc ký phần chiết hữu từ hạt Na nghiên cứu cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập Luận văn đạt đƣợc kết nghiên cứu sau: Đã xây dựng đƣợc quy trình chiết acetogenin từ hạt Na (Annona squamosa L.) Việt Nam theo hai phƣơng pháp chiết phân bố hợp chất hữu vào phần chiết n-hexan (AS1H 5,57% AS2H 5,89%), diclometan (AS1D 2,51% AS2D 0,48%) etyl axetat (AS1E 0,30% AS2E 0,10%) Kết cho thấy hai phƣơng pháp chiết đƣợc nhóm acetogenin phân cực trung bình vào phần chiết diclometan Đã phân tích TLC chất có phần chiết diclometan etyl axetat cho phân tích định tính acetogenin lựa chọn hệ dung mơi phù hợp cho sắc kí điều chế gradient Bằng phƣơng pháp sắc ký điều chế phân lập đƣợc chín hợp chất acetogenin sterol từ phần chiết diclometan theo phƣơng pháp chiết (AS1D) hai hợp chất amid peptid từ phần chiết etyl axetat gộp hai phƣơng pháp (ASE) Quy trình phân lập acetogenin từ phần chiết diclometan theo phƣơng pháp chiết (AS2D) cho số thành phần acetogenin tƣơng tự Đã xác định đƣợc cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập phƣơng pháp phổ đại Các chất acetogenin đƣợc phân lập chất aetogenin mono-THF: solamin (AS1D3.0) chất acetogenin bis-THF: squamocin J (AS1D3.1), squamocin G (AS1D3.4.2 AS1D5.4), hỗn hợp hai chất 4-dehydroxyannonin IV Luận văn Thạc sĩ 81 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 4-dehydroxyannonin VIII (AS1D3.7), squamocin (AS1D5.6), hỗn hợp hai chất annonin IV annonin VIII (AS1D7.2), annonin XVI (AS1D7.4); với sterol glucosid: hỗn hợp  -sitosterol 3-O- -D-glucopyranosid stigmasterol 3O- -D-glucopyranosid (AS1D10); chất amid: N-trans-caffeoyl-tyramin (ASE3.4.4); hỗn hợp chất octapeptid squamin A squamin B (ASE5.2) Đã sử dụng mơ hình hóa học lập thể dựa độ chuyển dịch hóa học proton cacbon-13 để xác định hóa lập thể tƣơng đối acetogenin Đây lần acetogenin nêu đƣợc xác định hạt Na Việt Nam Các chất acetogenin solamin, 4-dehydroxyannonin IV, 4-dehydroxyannonin VIII, chất amid N-trans-caffeoyl-tyramin hỗn hợp chất octapeptid squamin A squamin B lần đƣợc phân lập từ Annona squamosa Luận văn Thạc sĩ 82 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mẫn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Hồng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất Trẻ - Thành phố Hồ Chí Minh Đồn Thị Mai Hƣơng, Triệu Quý Hùng, Phạm Văn Cƣờng, Nguyễn Văn Hùng, Marc Litaudon, Pascal Retailleau, Isabelle Schmitz-Afonso, Châu Văn Minh (2013), Áp dụng phƣơng pháp phổ khối lƣợng việc xác định cấu trúc acetogenin từ Giác đế đài to Goliothalamus macrocalyx ban họ Na (Annonaceae), Tạp chí Hóa học, 51 (6ABC), tr 31-35 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh Alali F Q., Liu X X., McLaughlin J L (1999), Annonaceous Acetogenins: Recent Progress, J Nat Prod., 62 (3), pp 504-540 Araya H (2004), Studies of Annonaceous tetrahydrofuranic acetogenins from Annona squamosa L seeds, Bull Nat Inst Argo-Environ Sci., 23, pp 77-149 A Wele, Y Zhang, I Ndoye, J -P Brouard, J -L Pousset, B Bodo (2004), A cytotoxic cyclic heptapeptide from the seeds of Annona cherimola, J Nat Prod., 67, pp 1577-1579 Araya H., Sahai M., Singh S., Singh A K., Yoshida M., Hara N., Fujimoto Y (2002), Squamocin-O (1) and squamocin-O (2), new adjacent bis- Luận văn Thạc sĩ 83 2014 Nguyễn Quang Hợp tetrahydrofuran Cao học Hóa hữu – K22 acetogenins from the seeds of Annona squamosa, Phytochemistry, 61 (8), pp 999-1004 10 Ba Ndob I B , P Champy, C Gleye, G Lewin, B Akemdengué (2009), Annonaceous acetogenins: precursors from the seeds of Annona squamosa, Phytochemistry Lett., 2, pp 72-76 11 Craig Hopp D., Alali F Q., Gu Z M., McLaughlin J L (1998), Mono-THF ring Annonaceous acetogenins from Annona squamosa, Phytochemistry, 47 (5), pp 803-809 12 Chavan M J., Wakte P S., Shinde D B (2011), Analgesic and antiinflammatory activities of 18-acetoxy-ent-kaur-16-ene from Annona squamosa L bark Inflammopharmacology, 19 (2), pp 111-115 13 Chen Y., Xu S S., Chen J W., Wang Y., Xu H Q., Fan N B., Li X (2012), Anti-tumor activity of Annona squamosa seeds extract containing annonaceous acetogenin compounds, J Ethnopharmacol., 142 (2), pp 462-466 14 C M Li, N H Tan, Q Mu, H L Zheng, X J Hao, Y Wu, J Zhou (1997), Cyclopeptide from the seeds of Annona squamosa, Phytochemistry, 45, pp 521523 15 Fujimoto Y., Eguchi T., Kakinuma K., Ikekawa N., Sahai M., Gupta Y K (1988), Squamocin, a new cytotoxic bis-tetrahydrofuran containing acetogenin from Annona squamosa, Chem Pharm Bull., 36 (12), pp 4802-4806 16 Gleye C., Duret P., Laurens A., Hocquemiller R., Cavé A (1998), cisMonotetrahydrofuran acetogenins from the roots of Annona muricata, J Nat Prod., 61 (5), pp 576-579 17 Hopp D C., Zeng L., Gu Z., McLaughlin J L (1996), Squamotacin: an annonaceous acetogenin with cytotoxic selectivity for the human prostate tumor cell line (PC-3), J Nat Prod., 59 (2), pp 97-99 18 Hopp D C., Zeng L., Gu Z M., Kozlowski J F., McLaughlin J L (1997), Novel mono-tetrahydrofuran ring acetogenins, from the bark of Annona squamosa, showing cytotoxic selectivities for the human pancreatic carcinoma cell line, PACA-2 J Nat Prod., 60 (6), pp 581-586 Luận văn Thạc sĩ 84 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 19 Hopp D C., Alali F Q., Gu Z M., McLaughlin J L (1998), Mono-THF ring annonaceous acetogenins from Annona squamosa, Phytochemistry, 47 (5), pp 803-809 20 Hopp D C., Alali F Q., Gu Z M., McLaughlin J L (1998), Three new bioactive bis-adjacent THF-ring acetogenins from the bark of Annona squamosa, Bioorg Med Chem., (5), pp 569-575 21 H Morita, Y Sato, J Kobayashi, Cyclosquamosins A-G (1999), Cyclic peptides from the seeds of Annona squamosa, Tetrahedron, 55, pp 7509-7518 22 Khaled Nabih Rashed, Randy Chi Fai Cheung, Tzi Bun Ng (2013), Bio-active phytoconstiennts from non-polar extracts of Diospyros lotus stems and demonstration of antifungal activity in the extracts, World Journal of Pharmaceutical Scienses., (4), pp 99-108 23 Li X H., Hui Y H., Rupprecht J K., Liu Y M., Wood K V., Smith D L., Chang C J., McLaughlin J L (1990), Bullatacin, bullatacinone, and squamone, a new bioactive acetogenin, from the bark of Annona squamosa, J Nat Prod., 53 (1), pp 81-86 24 Lieb F., Nonfon M., Wachendorff-Neumann U., Wendisch D (1990), Annonacins and Annonastatin from Annona squamosa, Planta Med., 56 (3), pp 312-316 25 Liaw C C., Yang Y L., Chen M., Chang F R., Chen S L., Wu S H., Wu Y C (2008), Mono-tetrahydrofuran annonaceous acetogenins from Annona squamosa as cytotoxic agents and calcium ion chelators J Nat Prod., 71 (5), pp 764-771 26 Mukhlesur R M., Parvin S., Ekramul H M., Ekramul I M., Mosaddik M A (2005), Antimicrobial and cytotoxic constituents from the seeds of Annona squamosa, Fitoterapia, 76 (5), pp 484-489 27 Morita H., Sato Y., Chan K L., Choo C Y., Itokawa H., Takeya K., Kobayashi J (2000), Samoquasine A, a benzoquinazoline alkaloid from the seeds of Annona squamosa, J Nat Prod., 63 (12), pp 1707-1708 Luận văn Thạc sĩ 85 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 28 Nonfon M., Lieb F., Moeschler H., Wendish D (1990), Four annonins from Annona squamosa, Phytochemistry, 29 (6), pp 1951-1954 29 Pandey N., Barve D., Phytochemical and pharmacological review on Annona squamosa Linn, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, (4), pp 1404-1412 30 Panda S., Kar A (2007), Antidiabetic and antioxidative effects of Annona squamosa leaves are possibly mediated through quercetin-3-Oglucoside, Biofactors, 31 (3-4), pp 201-210 31 Rieser M J (1996), Five novel mono-tetrahydrofuran ring acetogenins from the seeds of Annona muricata, J Nat Prod., 59 (2), pp 100-108 32 Sahai M., Singh S., Singh M., Gupta Y K., Akashi S., Yuji R., Hirayama K., Asaki H., Araya H., Hara N., Eguchi T., Kanikuma K., Fujimoto Y (1994), Annonaceous acetogenins from the seeds of Annona squamosa Adjacent bistetrahydrofuranic acetogenins, Chem Pharm Bull., 42 (6), pp 1163-1174 33 Sun L., Zhu H., Gan L., Mo J., Feng F., Zhou C.(2012), Constituents from the bark of Annona squamosa and their anti-tumor activity, China Journal of Chinese Material Medical (Zhongguo Zhong Yao Za Zhi), 37 (14), pp 21002104 34 Vohora S B., Kumar I., Naqvi S A (1975), Phytochemical, pharmacological, antibacterial and anti-ovulatory studies on Annona squamosa, Planta Med., 28 (1), pp 97-100 35 Wu Y C., Hung Y C., Chang F R., Cosentino M., Wang H K., Lee K H (1996), Identification of ent-16β,17-dihydroxykauran-19-oic acid as an antiHIV principle and isolation of the new diterpenoids annosquamosins A and B from Annona squamosa, J Nat Prod., 59 (6), pp 635-637 36 Yang X J., Xu L Z., Sun N J., Wang S C., Zheng (1992), Studies on the chemical constituents of Annona squamosa, Yao Xue Xue Bao (Acta Pharmaceutica Sinica), 27 (3), pp 185-190 Luận văn Thạc sĩ 86 2014 Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu – K22 37 Yang Y L , Chang F R., Wu C C., Wang W Y., Wu Y C (2002), New entkaurane diterpenoids with anti-platelet aggregation activity from Annona squamosa, J Nat Prod., 65 (10), pp 1462-1467 38 Yang Y L., Chang F R., Hwang T L., Chang W T., Wu Y C (2004), Inhibitory effects of ent-kauranes from the stems of Annona squamosa on superoxide anion generation by human neutrophils, Planta Med., 70 (3), pp 256-258 39 Yu J G., Luo X Z., Sun L., Li D Y., Huang W H., Liu C.Y (2005), Chemical constituents from the seeds of Annona squamosa, Yao Xue Xue Bao (Acta Pharmaceutica Sinica, 40 (2), pp 153-158 40 Yu-Liang Yang , Fang-Rong Chang , Chin-Chung Wu , Wei-Ya Wang , and Yang-Chang Wu (2002), New ent-Kaurane Diterpenoids with Anti-Platelet Aggregation Activity from Annona squamosa, Journal of Natural Products., 65 (10), pp.1462-1467 41 Y C Chen, F R Chang, H F Yen, Y C Wu (1998), Amides from stems of annona cherimola, Phytochemistry, 49, pp 1443-1447 42 Wu Y C (2006), New research and development on the Formosan Annoncaeous plants, in Studies in Natural Products Chemistry, ed Atta-urRahman, Elsevier B.V., Amsterdam 43 Yang H J., Li X., Zhang N., Chen J W., Wang M Y (2009), Two new cytotoxic acetogenins from Annona squamosa, J Asian Nat Prod Res., 11 (3), pp 250-256 44 Yang Y L., Hua K F., Chuang P H., Wu S H., Wu K Y., Chang F R., Wu Y C (2008), New cyclic peptides from the seeds of Annona squamosa L and their anti-inflammatory activities, J Agric Food Chem., 56 (2), pp 386-392 Trang Web 45 http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/na.htm Luận văn Thạc sĩ 87 2014 ... hexapetala  Annona humboldtiana  Annona humboldtii  Annona hybrid  Annona hypoglauca MART  Annona hystricoides A  Annona incana  Annona jahnii SAFF  Annona longiflora S  Annona lutescens  Annona. .. diversifolia D  Annona dolabripetala  Annona echinata D  Annona excellens R.E.FR  Annona glabra L. (bình bát)  Annona glaucophylla R.E.FR  Annona haematantha MIQ  Annona hayesii SAFF  Annona. ..  Annona phaeoclados MART  Annona pubescens  Annona purpurea MOC & SESSÉ EX DUNAL  Annona pygmaea  Annona reticulata L  Annona salzmannii L  Annona scleroderma LAM  Annona sericea D  Annona