Phần chiết AS1D (27,1 g) theo phương pháp 1 được phân tách bằng sắc kí cột thường (CC), kớch thước cột tỏch 3 40 cm trờn silica gel 63 - 200 àm. Cột được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong n-hexan và mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột là n- hexan/EtOAc 6:1 (70 ml), và gradient n-hexan/EtOAc/axeton 20:10:1 (400 ml), 10:10:1 (700 ml), 10:12:1 (450 ml) và 10:15:1 (300 ml). Rửa cột bằng MeOH (100 ml). Tổng cộng thu đƣợc 86 phân đoạn (mỗi phân đoạn 20 ml).
Các phân đoạn có sắc k đồ TLC giống nhau đƣợc gộp lại cho 12 nhóm phân đoạn: AS1D1(các phân đoạn 1-5), AS1D2(6-10), AS1D3(11-18), AS1D4(19-24), AS1D5(25-29), AS1D6(30-48), AS1D7(49-54), AS1D8(55-75), AS1D9(55-75, chất kết tinh từ AS1D8), AS1D10 (76-80), AS1D11 (76-80, chất kết tinh từ AS1D10), AS1D12 (76-80) và AS1D13(81-86).
Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu cơ – K22
Luận văn Thạc sĩ 44 2014 Các nhóm phân đoạn AS1D1 và AS1D2 (tổng khối lƣợng 2,5 g) nhận đƣợc ở dạng dầu màu vàng.
2,0 g nhóm phân đoạn AS1D3(khối lƣợng 5,87 g) đƣợc phân tách bằng sắc kí cột thường (CC, 2,5 cm 30 cm, silica gel 63 - 100 μm) với hệ dung môi gradient n-hexan/axeton 30:1 (60 ml), 15:1 (100 ml), 12:1 (600 ml), 9:1 (60 ml), cho 38 phân đoạn (20 ml). Dựa trên sắc kí đồ TLC, các phân đoạn đƣợc gộp lại cho tinh chế bằng Mini-C trờn silica gel (40-63 àm) với cỏc hệ dung mụi n- hexan/axeton 40:1, 30:1, 20:1, 15:1, 12:1, 9:1, 7:1, 5:1 và 3:1 (mỗi hệ 50 ml). Kết tinh các phân đoạn sắc ký cột trong các hệ dung môi chạy cột cho 4 chất bột vô định hình màu trắng: AS1D3.0 (25 mg), AS1D3.1 (94,4 mg), AS1D3.42 (23 mg) và AS1D3.7 (28 mg).
Các nhóm phân đoạn AS1D4 (2,56 g), AS1D5 (3,7 g) và AS1D6 (4,1 g) có sắc kí đồ TLC giống nhau. Phân đoạn AS1D5 (2,0 g) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột Mini-C (cột 1,0 cm 20 cm trên silica gel (40 - 63 μm) với hệ dung môi n- hexan/axeton 12:1 (340 ml), 9:1 (700 ml), 7:1 (400 ml), 5:1 (240 ml) và 3:1 (400 ml). Kết tinh các phân đoạn sắc ký cột trong các hệ dung môi chạy cột cho 2 chất bột vô định hình màu trắng: AS1D5.4 (10 mg) trùng với AS1D3.42 (phân tích TLC và co-TLC), và AS1D5.6 (30 mg).
Nhóm phân đoạn AS1D7 (0,581 g) sau phân tích TLC đƣợc tinh chế lại bằng sắc kí cột Mini-C trên silica gel 40 - 63 μm (cột 1,0 cm 25 cm) với các hệ dung môi n-hexan/EtOAc/axeton 10:5:1 (50 ml), 10:8:1 (150 ml) và 10:10:1 (100 ml).
Phân tích TLC gộp các phân đoạn phân tách thành 4 nhóm phân đoạn AS1D7.1 (68,0 mg), AS1D7.2 (91,3 mg), AS1D7.3 (173,9 mg) và AS1D7.4 (61,7 mg). Các nhóm phân đoạn AS1D7.2 và AS1D7.4 đƣợc tiếp tục tinh chế bằng sắc kí cột Mini- C trên silica gel 40 - 63 μm (cột 0,7 cm 20 cm). Nhóm phân đoạn AS1D7.2 đƣợc phân tách Mini-C trên silica gel với hệ dung môi n-hexan/axeton 3:1 (50 ml), 2,5:1 (50 ml), 2:1 (50 ml) và 1:1 (50 ml) cho chất bột vô định hình màu trắng AS1D7.2 (38,3 mg). Phân đoạn AS1D7.4 đƣợc phân tách Mini-C trên silica gel với hệ dung môi n-hexan/axeton 2,5:1 (50 ml), 2:1 (50 ml) và 1,5:1 (50 ml) cho chất bột vô định hình màu trắng AS1D7.4 ( 26,1 mg).
Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu cơ – K22
Luận văn Thạc sĩ 45 2014 Các nhóm phân đoạn AS1D8 (22,1 mg), AS1D10 (0,17 g), AS1D11 (0,164 g) và AS1D12 (9 mg) có sắc kí đồ TLC tương tự nhau. Tinh chế nhóm phân đoạn AS1D10 bằng Mini-C trên silica gel 40 - 63 μm (cột 1,0 cm 25 cm) với các hệ dung môi n-hexan/axeton 5:1 (500 ml), 3:1 (240 ml), 2:1 (230 ml) và 1:1 (100 ml) cho chất bột vô định hình màu trắng AS1D10 (30,4 mg).
3.5.2 Phân tách phần chiết diclometan (AS2D)
Phần chiết AS2D (13,1 g) theo phương pháp 2 được phân tách bằng sắc kí cột thường (CC), kớch thước cột tỏch 3 40 cm trờn silica gel 63 - 200 àm. Cột được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong n-hexan và mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột là CH2Cl2 (50 ml), và gradient n-CH2Cl2/MeOH 30:1 (400 ml), 25:1 (200 ml), 15:1 (400 ml), 9:1 (100 ml), 7:1 (100 ml), 5:1 (200 ml), 3:1 (200 ml) và 1:1 (200 ml).
Rửa cột bằng MeOH (100 ml). Tổng cộng thu đƣợc 37 phân đoạn (mỗi phân đoạn 50 ml).
Các phân đoạn có sắc k đồ TLC giống nhau đƣợc gộp lại cho 15 nhóm phân đoạn: AS2D1 (phân đoạn 1), AS2D2 (2), AS2D3 (3-5), AS2D4 (6-9), AS2D5 (10), AS2D6 (16-21), AS2D7 (15), AS2D8 (22-23), AS2D9 (26-29), AS2D10 (30-33), AS2D11(34-35), AS2D12 (36-37), AS2D13(24), AS2D14(25) và AS2D15(11-14).
Các phân tích TLC với các mẫu acetogenin chuẩn nhận đƣợc từ phần chiết AS1D cho thấy sự có mặt của các chất AS1D3.0, AS1D3.1, AS1D3.42, AS1D3.7, AS1D5.6, AS1D7.2 và AS1D7.4 trong các nhóm phân đoạn từ phân tách sắc ký cột phần chiết AS2D. Các nhóm phân đoạn này. Do đó, không đƣợc tiếp tục phân tách.
3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (ASE)
Phần chiết etyl axetat (ASE) (6,8 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột (CC) gradient trờn silica gel 40 - 63 àm (cột 3,0 cm 25 cm) với hệ dung mụi CH2Cl2/MeOH 49:1, 30:1, 19:1, 9:1, 3:1 và 1:1 cho 48 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn có sắc k đồ TLC giống nhau đƣợc gộp thành 6 nhóm phân đoạn: ASE1 (phân đoạn 1-5), ASE2 (6-7), ASE3 (10-12), ASE4 (13-29), ASE5 (30-35) và ASE6 (36-48).
Nguyễn Quang Hợp Cao học Hóa hữu cơ – K22
Luận văn Thạc sĩ 46 2014 Các nhóm phân đoạn ASE3 và ASE4 đƣợc gộp lại cho tinh chế bằng sắc ký cột Mini-C trờn silica gel 40 - 63 àm, với cỏc hệ dung mụi CH2Cl2/MeOH 25:1, 20:1 và 15:1 (mỗi phân đoạn 10 ml) cho chất bột vô định hình màu trắng ASE3.4.4 (30,4 mg).
Phân đoạn ASE5 đƣợc phân tách sắc ký cột Sephadex (CC) với metanol cho chất bột vô định hình màu trắng ASE5.2 (12 mg).