Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng cung

ĐẠIHỌC HỌCQUỐC QUỐC GIA GIA HÀ HÀ NỘI ĐẠI NỘI TRƢỜNG ĐẠI ĐẠI HỌC HỌC KHOA KHOA HỌC HỌC TỰ TỰ NHIÊN NHIÊN TRƯỜNG KHOA SƯ PHẠM   Phạm Huy Cƣờng KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG Đề tài: LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực : Lớp : Hµ néi - 2009 Hà Nội - 2012 ĐẠIHỌC HỌCQUỐC QUỐC GIA GIA HÀ HÀ NỘI ĐẠI NỘI TRƢỜNG ĐẠI ĐẠI HỌC HỌC KHOA KHOA HỌC HỌC TỰ TỰ NHIÊN NHIÊN TRƯỜNG KHOA SƯ PHẠM   Phạm Huy Cƣờng THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực : Lớp NGƢỜI : HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VĂN ĐƠ Hµ néi - 2009 Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới cán hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Văn Đơ - Phó chủ nhiệm mơn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội người thầy tận tình bảo dẫn dắt tơi nghiên cứu khoa học, giải nhiều khó khăn, vướng mắc q trình thực luận văn, đóng góp ý kiến quý báu tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng q trọng biết ơn sâu sắc tới GS TSKH Phan Thị Phi Phi người thầy tận tình bảo đóng góp ý kiến quý báu tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm – Giám đốc Công ty TNHH Thiên Dược, tỉnh Bình Dương tạo điều kiện thuận lợi tình cảm kinh phí để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Phạm Đăng Khoa – Chủ nhiệm môn, PGS TS Nguyễn Thanh Thúy – Phó chủ nhiệm mơn, tồn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể cán bộ, nhân viên khoa Xạ Bệnh viện K Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Nhân dịp này, cho gửi lời cám ơn tới thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Các thầy cô cho kiến thức mẻ cần thiết để thấy thêm tự tin, bước tiếp đường nghiên cứu khoa học Và hết, muốn gửi tới lời cảm ơn chân thành đến người thân gia đình bạn bè bên động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập làm việc Chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên Phạm Huy Cƣờng NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribonucleic AIDS : Acquired Immunodeficiency Syndrome ARN : Acid Ribonucleic B2M : Beta microglobulin CD : Cluster of Differenciation cDNA : Complementary Deoxyribonucleic DDT : D-dopacchrome tautomerase dNTP : Deoxyribonucleotid Triphotphat EBV : Epstein Barr Virus ELISA : Enzyme – Linker Immunosorbent Assay HIV : Human Immunodeficiency Virus HLA : Human Leucocyte Antigen HPLC : High Perfomance Liquid chromatography IL-2 : Interleukin – IL-2R : Interleukin – Receptor KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể LGL : Larger gramilar lymphocyte MHC : Major Histocompatibility Complex NK : Natural Killer PCR : Polymerase Chain Reaction SCF : Stem cell factor SGMD : Suy giảm miễn dịch TNFα : Tumor Necrosis Factor alpha TNHC : Trinh nữ hoàng cung UTCTC : Ung thƣ cổ tử cung UTDD : Ung thƣ dày UTVMH : Ung thƣ vòm mũi họng MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung 1.1.1 Phân biệt TNHC với náng khác 1.1.2 Thành phần hóa học Crinum latifolium L 1.1.3 Tình hình nghiên cứu TNHC Việt Nam 1.2 Vai trò hệ thống đáp ứng miễn dịch ung thƣ 1.2.1 Đại cƣơng đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ 1.2.2 Suy giảm miễn dịch 1.2.3 Ung thƣ vòm mũi họng 11 1.2.4 Nguyên nhân ung thƣ vòm 11 1.3 Tình hình nghiên cứu thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 13 1.3.1 Vai trò cytokin 14 1.3.2 Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ 17 1.3.3 Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 24 1.3.4 Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thƣ TNHC 25 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.2.1 Bệnh nhân 28 2.2.2 Ngƣời bình thƣờng 29 2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 29 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Nuôi cấy tế bào lympho 30 2.3.2 Đếm số lƣợng bạch cầu dòng bạch cầu lympho 31 2.3.3 Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy 31 2.3.4 Tổng hợp cADN 33 2.3.5 Kỹ thuật RT-PCR 33 2.3.6 Sơ đồ nghiên cứu 39 2.3.7 Kỹ thuật ELISA định lƣợng IL-2 TNFα dịch nuôi cấy tế bào lympho 39 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 Kiểm tra chất lƣợng ARN chiết tách đƣợc 41 3.2 Phản ứng RT-PCR đơn mồi gen B2M, IL-2 TNFα 42 3.3 Phản ứng RT-PCR đa mồi gen B2M với IL-2/TNFα 44 3.4 Sự biểu lộ IL-2 mức độ mARN lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với thuốc thử 45 3.5 Sự biểu lộ mARN TNFα lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử 48 3.6 So sánh biểu lộ protein gen IL-2 dịch nuôi cấy lympho bào đƣợc xác định ELISA 51 3.7 So sánh biểu lộ protein gen TNFα dịch nuôi cấy với thuốc thử 56 3.8 Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch Crilin T so với nhóm chứng dƣơng Levamisol 58 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM THAM KHẢO 62 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh TNHC Lan huệ Bảng 1.2 Các hỗn hợp alkaloid TNHC Bảng 2.1 Thành phần dung dịch PBS 30 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 35 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR đa mồi 36 Bảng 2.4 Tƣơng quan nồng độ gel agarose kích thƣớc đoạn ADN cần phân tách 37 DANH MỤC HÌNH Cây trinh nữ hồng cung Những khác họ với Crinum Cấu trúc hóa học số Alkaloid RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ gen B2M, IL-2 TNFα tế bào dòng chuẩn 44 Hình 3.2 Hình ảnh PCR đa mồi cặp gen nội chuẩn 45 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR IL-2 lympho ngƣời bình thƣờng ni cấy 46 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR IL-2 lympho ni cấy bệnh nhân ung thƣ vịm mũi họng 47 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR TNFα lympho ngƣời bình thƣờng ni cấy 49 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR TNFα lympho bệnh nhân ung thƣ vịm mũi họng ni cấy 50 Hình 3.7 So sánh biểu lộ IL-2 Levamisol với chứng âm bệnh nhân 51 Hình 3.8 So sánh nồng độ IL-2 chứng dƣơng 0,25mg Crilin T tế bào bệnh nhân in vitro 52 Hình 3.9 So sánh nồng độ IL-2 chứng dƣơng 0,5mg Crilin T dịch nuôi cấy in vitro tế bào lympho từ bệnh nhân 52 Hình 3.10 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào lympho in vitro 53 Hình 3.11 So sánh biểu lộ IL-2 lympho đƣợc kích thích Levamisol với chứng âm ngƣời thƣờng 54 Hình 3.12 So sánh nồng độ IL-2 chứng dƣơng 0,25mg Crilin T dịch nuôi cấy ngƣời thƣờng in vitro 54 Hình 3.13 So sánh nồng độ IL-2 chứng dƣơng 0,5mg Crilin T dịch nuôi cấy ngƣời thƣờng in vitro 55 Hình 3.14 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào ngƣời bình thƣờng in vitro 55 Hình 3.15 So sánh nồng độ IL-2 tế bào bệnh nhân ung thƣ vịm mũi họng ngƣời bình thƣờng in vitro 56 Hình 3.16 So sánh nồng độ TNFα liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào lympho in vitro 57 Hình 3.17 So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào ngƣời bình thƣờng in vitro 57 Hình 3.18 So sánh biểu lộ TNFα hai mức độ mARN Protein tế bào lympho ngƣời bình thƣờng 58 Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 3.1 MỞ ĐẦU Trinh nữ hoàng cung (THNC) loại thuốc đƣợc sử dụng thuốc cổ truyền nhiều nƣớc nhiệt đới cận nhiệt đới toàn giới [12] Hiện nay, ngƣời ta phát đến 130 loài khác nhau, phân bố nƣớc nhiệt đới 150 alkaloid loài đƣợc chiết tách [17], [18] TNHC (Crinium latifolium (L.) đƣợc dùng nhƣ loại thuốc y học cổ truyền để điều trị bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thƣ, lao, viêm vi khuẩn sinh mủ…Ở Trung quốc Việt nam, thuốc sắc nƣớc nóng lồi dùng để điều trị nhờ hoạt tính chống virut chống ung thƣ, đặc biệt ung thƣ tuyến tiền liệt ngày [41] Một số nghiên cứu chiết xuất từ TNHC, xác với tên Trinh nữ Crila [16] thử nghiệm in vitro in vivo [8], [39], [40] Trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi đƣợc nuôi cấy chuột thực nghiệm cho thấy chất chiết hoạt hóa tế bào lympho T ni cấy chuột Balb/c Nhiều hoạt chất có tác dụng chống phân bào, ức chế phát triển tế bào ung thƣ đồng thời phục hồi chức miễn dịch Viên nang Crila biệt dƣợc Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ Trinh nữ Crila đƣợc sản xuất từ alkaloid có hoạt tính sinh học Thuốc đƣợc đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi Việt Nam số nƣớc để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt u xơ tử cung Ngồi ra, viên Crila cịn đƣợc nghiên cứu sử dụng để điều trị thực nghiệm tế bào dòng ung thƣ vú, tử cung, dày, phổi, tuyến tiền liệt số bệnh nhân ung thƣ tự nguyện [17], [30] Các phân đoạn chứng minh có tác dụng tăng cƣờng miễn dịch chống ung thƣ mạnh (gồm alkaloid flavonoid) đƣợc chiết làm thành viên nén có tên Crilin T Các đặc tính hóa, lý tác dụng độc tính cấp, bán cấp…của thuốc đƣợc đánh giá Chúng tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cƣờng miễn dịch in vitro mơ hình bệnh nhân ung thƣ có suy giảm miễn dịch, cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng giai đoạn muộn thử nồng độ thuốc khác theo dõi đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ dấu ấn biểu lộ IL-2, TNFα mức độ ARN protein phƣơng pháp RT-PCR ELISA cách tƣơng ứng Đề tài nhằm mục đích: Xác định biểu lộ IL-2 TNF-α mức độ mARN protein tế bào lympho nuôi cấy in vitro bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng giai đoạn muộn ngƣời bình thƣờng lâm sàng với hai liều thuốc khác Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch Crilin T so với Levamisol Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Trinh nữ hồng cung Cây Trinh nữ hồng cung (TNHC) cịn đƣợc gọi Náng rộng, Tỏi rộng, Tây nam văn châu lan, Thập bát học sĩ - Crinum latifolium L., thuộc họ Náng Amaryllidaceae [18], [50] TNHC lồi có thân nhƣ củ hành tây to, đƣờng kính 10-15 mm, bẹ úp vào thành thân giả dài khoảng 10-15 cm, có chiều mỏng kéo dài từ 80100 cm, rộng 3-8 cm, hai bên mép lƣợn sóng Gân song song mặt lõm thành rãnh, mặt dƣới có có sống rõ, đầu bẹ nơi sát đất có màu đỏ tím Hoa mọc thành tán gồm 6-18 hoa, cán dài 30-60 cm Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ [14], [41] Cây TNHC có nhiều nƣớc Đơng Nam Á Nhật bản, gồm Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào [25], [31], [50] Ở Việt Nam mọc hoang ven suối rừng thƣờng phát triển mạnh vùng có khí hậu nóng khơ từ Đà Nẵng đến tận mũi Cà Mau, đặc biệt số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai Bà Rịa - Vũng Tàu [9], [14], [18] Hình 1.1 Cây trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.) Hình 3.10 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào lympho in vitro (p=0,23) Khi so sánh biểu lộ IL-2 lympho bào bệnh nhân với nồng độ Crilin T với levamisol, cho thấy 6/9 mẫu liều thấp 7/9 (77.7%) mẫu liều cao có biểu lộ cao so với Levamisol (Hình 3.8 hình 3.9) Với tỷ lệ này, chứng tỏ Crilin T có tác dụng kích thích miễn dịch cao Levamisol Khi xem xét liều thuốc Crilin T khác nhau, liều thấp cho đáp ứng so với liều cao (Hình 3.10) Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, cỡ mẫu thấp Các kết phù hợp với biểu lộ mARN phát RT-PCR Vì đối tƣợng nghiên cứu máu bệnh nhân ung thƣ vòm họng giai đoạn muộn hay ngƣời bình thƣờng khác di truyền học, khả đáp ứng tế bào lympho nuôi cấy với tác nhân sinh học khác nhau, cho kết khác Tuy tỷ lệ đáp ứng số mẫu nghiên cứu cao kích thích Crilin T Đối với đối tƣợng ngƣời thƣờng, thu đƣợc kết nhƣ sau: Nhóm chứng có biểu lộ tốt, Levamisol cao chứng âm (Hình 3.11), liều thấp cao kích thích cao Levamisol (4/5) (Hình 3.12 hình 3.13) liều cao lại cho biểu lộ cao liều thấp (Hình 3.14) Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 53 Hình 3.11 So sánh biểu lộ Il-2 lympho kích thích Levamisol với chứng âm người thường (p=0,18) Hình 3.12 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,25mg Crilin T dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,42) 54 Hình 3.13 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,5mg Crilin T dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,30) Hình 3.14 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào người bình thường in vitro (p = 0,34) 55 Để xem xét tổng hợp biểu lộ IL2 nhóm ngƣời thƣờng nhóm ngƣời bệnh, chúng tơi thấy biểu lộ nhóm ngƣời bệnh tốt nhóm ngƣời thƣờng (Hình 3.15) Điều phù hợp với sinh học đáp ứng miễn dịch bình thƣờng tốt kích thích miễn dịch, khả tăng đáp ứng thấp tình trạng hệ miễn dịch suy yếu đƣợc kích thích có đáp ứng tốt nhƣ bệnh nhân ung thƣ Nhận xét đƣợc chứng minh nhiều tác giả khác trƣớc dùng chất kích thích miễn dịch khác [4], [5] Hình 3.15 So sánh nồng độ IL-2 tế bào bệnh nhân ung thư vịm mũi họng người bình thường in vitro 3.7 So sánh biểu lộ protein gen TNFα dịch ni cấy có sử dụng thuốc thử Khác với IL-2, TNFα biểu lộ cao tế bào ni cấy in vitro, dù có 4h sau ni cấy Và thuốc Crilin T có tác dụng cao nhóm chứng nhiều Trong hai liều sử dụng liều cao thấy tốt (Hình 3.16 hình 3.17) Khi so sánh bệnh nhân ngƣời thƣờng cho thấy bệnh nhân đáp ứng tốt Sự biểu lộ cao TNFα có nhiều tế bào tiết ra, khơng giống nhƣ IL-2 có tế bào lympho T hoạt hóa kháng ngun 56 Hình 3.16 So sánh nồng độ TNFα liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào lympho in vitro (p=0,17) Hình 3.17 So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào người bình thường in vitro (p=0,42) 57 (A) (B) Hình 3.18 So sánh biểu lộ TNFα hai mức độ mARN Protein tế bào lympho người bình thường Sự biểu lộ TNFα mức độ mARN khơng có khác biệt nhóm chứng âm dƣơng Sự biểu lộ thấp so với kích thích Crilin T hai nồng độ 0,25mg 0,5mg Ở mức độ protein cho kết tƣơng tự (Hình 3.18A hình 3.18B) Nhƣ vậy, kỹ thuật ELISA RT-PCR cho kết tốt biểu lộ TNFα 3.8 Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch Crilin T so với nhóm chứng dƣơng Levamisol IL-2 TNFα hai cytokin đƣợc nghiên cứu nhiều với mục đích liệu pháp điều trị miễn dịch IL-2 có chức kích thích phân chia tế bào lympho T gây độc, lympho T giúp đỡ, tế bào diệt tự nhiên đại thực bào Tất chức tham gia vào chế chống ung thƣ hệ miễn dịch TNFα, 58 peptid, có vai trị quan trọng chế bảo vệ thể Nó làm tăng chức tế bào mônô đại thực bào để gây độc cho tế bào ung thƣ, gây biểu lộ nhiều chất trung gian chống viêm điều hòa miễn dịch Theo Gan cs 2003 việc tiết TNFα sớm nhƣng không kéo dài nhƣ tiết IL-2 dùng chất kích thích miễn dịch từ thực vật [23] Kết tƣơng tự vài mẫu số thời điểm nghiên cứu Tuy nhiên, số mẫu thấp, thời điểm cịn q nên việc theo dõi động học cơng trình chƣa thể có kết luận thống kê Qua kết thu đƣợc hai biểu lộ IL-2 TNFα thực nghiệm trên, ta thấy Crilin T có tác dụng mạnh Levamisol, đặc biệt TNFα có chế tiết cao sớm nhiều so với Levamisol Kết phù hợp với tác giả nghiên cứu chế phẩm Crila nƣớc quốc tế tác dụng tăng cƣờng miễn dịch [19], [26], [40] Levamisol chất tổng hợp nên có nhiều tác dụng phụ nặng biết rõ sử dụng lâm sàng, đó, Chế phẩm Crilin T đƣợc chiết từ dƣợc thảo có nhiều tác dụng tăng cƣờng miễn dịch Có thể hỗ trợ cho điều trị số bệnh ung thƣ Việc nghiên cứu cách có hệ thống với số mẫu lơn giúp đánh giá tồn diện tìm hiểu chế tác dụng thuốc vào tế bào đích ung thƣ cần thiết 59 KẾT LUẬN Từ kết mơ hình thực nghiệm ni cấy tế bào suy giảm miễn dịch bệnh nhân UTVMH giai đoạn muộn ngƣời bình thƣờng lâm sàng rút kết luận sau: - Sự biểu lộ IL-2 mẫu nuôi cấy tế bào lympho có mặt Crilin T nhóm ngƣời ung thƣ vịm họng cao nhóm ngƣời bình thƣờng, liều thấp Crilin T cho kết tốt - TNFα mẫu ni cấy tế bào lympho nhóm ngƣời ung thƣ vịm họng cao nhóm ngƣời bình thƣờng, liều cao Crilin T cho kết tốt Đáp ứng TNFα xảy sớm, sau 4h nuôi cấy tế bào lympho in vitro với Crilin T - Crilin T có xu hƣớng đáp ứng tốt so với Levamisol hai cytokin IL-2 TNFα 60 KIẾN NGHỊ - Cần phải tăng số mẫu nghiên cứu để đánh giá xác - Thử tác dụng thuốc liều lƣợng khác - Xây dựng mơ hình thực nghiệm ung thƣ hóa chất để thử tác dụng miễn dịch in vivo 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Vũ Triệu An, Jean Claude Homberg, (1997), Miễn dịch học NXB Y học, 1997 Trần Ngọc Anh, Phan Thu Giang, Trần Văn Quy (2006), Nghiên cứu định tính, định lượng crinamidin dược liệu viên nang trinh nữ hoàng cung phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Kiểm nghiệm thuốc, 4(14), tr 10-14 Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Hoài Nga, Trần Hồng Trƣờng cs (2000), “Tình hình bệnh ung thƣ Hà nội giai đoạn 1996-1999” Tạp chí Y học thực hành chuyên đề ung thư học, Số 431, tr 4-7 Đỗ Hịa Bình (2003), Một số thay đổi số lượng chức tế bào lympho tần suất biểu lộ Protein LMP1, P53, MDM2 bệnh nhân ung thư vòm họng Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội Đỗ Hịa Bình, Phan Thị Phi Phi, Phan Thu Anh cs (1993), “Nghiên cứu tình trạng suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào bệnh nhân ung thƣ vòm họng trƣớc điều trị”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 9, tr 1-5 Đỗ Hịa Bình, Phan Thị Phi Phi, Bạch Khánh Hòa cs (2001), “Sự thay đổi nồng độ IL2 IL-10 nƣớc nuôi cấy lympho bào máu ngoại vi bệnh nhân UTVH” Tuyển tập cơng trình NCKH NCS,Tập 5, tr 2-5 Trần Ngọc Dung (2000), Nghiên cứu thông số miễn dịch - sinh học giúp tiên lượng, phát sớm tái phát UTVH kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giảm tái phát, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội Nguyễn Nam Hải, Nguyễn Tiến Vững (2006), “Phân lập xác định cấu trúc hai flavonoid từ Crium latifolium L”, Tạp chí Dược học, Số 1, tr 7-8 62 Võ Thị Bách Huệ, N.K.Q.C., Ngô Văn Thu, Delome Frederic, Daniel F Michel Becchi (1999), “Khảo sát alcaloid chiết từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) kỹ thuật sắc ký ghép với khối phổ (GC - MS)”, Tạp chí Dược học 10 Nguyễn Ngọc Lanh, Văn Đình Hoa cs (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất y học 11 Nguyễn Ngọc Lanh, Vũ Triệu An, Phan Thị Phi Phi, Văn Đình Hoa, Phan Thị Thu Anh, Trần Thị Chính, Dƣơng Ngọc Quý (2003), Miễn dịch học Xuất lần II Nhà xuất Y học 12 Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà Nội, tr 511-512 13 Phan Thị Phi Phi (1997), “Đại cƣơng Cytokin”, Giáo trình giảng dạy sau đại học 14 Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phƣơng Thảo, Hoàng Minh Châu, Trần Văn Sung (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) trồng Đồng Nai, Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, Số 49 (6A), tr.355-361 15 Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2009), Nghiên cứu khả kích thích hệ miễn dịch chống ung thư alkaloid va Flavonoid chiết xuất từ trinh nữ hoàng cung (crinum latifonium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bổ trợ điều trị ung thư Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ theo nghị định thư Việt nam Bungari, Bộ khoa học công nghệ 16 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Trần Công Khánh (2012), “Trinh nữ CRILACrinum latifolium L var crilae Tram & Khanh, var n.: Một thứ loài Trinh nữ Hoàng cung-Crinum latofolium L (Họ náng -Amaryllidaceae) Việt nam”, Tạp chí Sinh học, 34(2), tr 190-193 63 17 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Z.K., V Bankova, S Popov, E Zvetkova, E Katzarovo, Lê Văn Hƣơng (2001), “Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn alkaloid từ trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.,Amaryllidaceae)” Tạp chí Dược học, số 11, tr 21-23 18 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Bảo Lộc (2001), “Khảo sát thực vật, nuôi trồng thu hái trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L)” Tạp chí Dược học, Số 2, tr 21-22 19 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Phan Thị Phi Phi., Phan Thị Thu Anh cs (2008), “Tác dụng phục hồi tổn thƣơng tế bào lympho T dịng tủy viên nang Crila Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Dược học, Số 5, tr 12-14 20 Cao Hữu Vinh (2009), Nghiên cứu nồng độ TNFα bệnh nhân nhồi máu não giai đoạn cấp, Luận văn Y học, tr 40-60 Tiếng Anh 21 Chuchawankul, S., N Khorana, and Y Poovorawan (2012), “Piperine inhibits cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells” Genet Mol Res, 11(1), pp 617-27 22 Dong, H., et al (2010), “Selective effects of Lactobacillus casei Shirota on T cell activation, natural killer cell activity and cytokine production”, Clin Exp Immunol, 161(2), pp 378-88 23 Gan, L., et al (2003), “A polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum upregulates cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells” Eur J Pharmacol, 471(3), pp 217-22 24 Geng, X., et al.(2012), “Interleukin-2 and autoimmune disease occurrence and therapy”, Eur Rev Med Pharmacol Sci, 16(11), pp 1462-7 25 Ghosal Sh., S.K.S.a.F.A.W (1983), “Alkaloids of Crinum latifolium” Phytochemistry, 22, pp 2305-2309 64 26 Ghosal Sh., S.K.S.a.R.S (1985), “Crinum alkaloids: their chemistry and biology.” Phytochemistry, 24, pp 2141-2156 27 Ghosal Sh., S.K.S.a.A.V.K (1984), “1,2-beta-Epoxyambelline, an immunostimulant alkaloid from Crinum latifolium”, J Chem Research (S), pp 232-233 28 Henegariu, O., et al (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and stepby-step protocol”, Biotechniques,23(3), pp 504-11 29 Hu, L.F., et al (1991), Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1 gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma J Gen Virol, 72 ( Pt 10), pp 399-409 30 Jenny, M., et al (2011), “Crinum latifolium leave extracts suppress immune activation cascades in peripheral blood mononuclear cells and proliferation of prostate tumor cells”, Sci Pharm, 79(2), pp 323-35 31 Kobayashi Sh., T.T., Kihara M., Imakura Y.,Shingu T and Taira Z (1984), “Alkaloidal constituents of Crinum latifolium and Crinum bulbispermum (Amaryllidaceae)”, Chem Pharm Bul, 32, pp 3015-3022 32 Kobayashi Sh., T.T.a.T.Z.(1984), “Lati-fine, a biogenetic isomer of cherylline, from Crinum latifolium L.”, J Chem Soc.Chem Commun, pp 1043-1044 33 Lai K.N., H.S., et al (1991), “Soluble interleukin-2 receptors in patiens with nasopharyngeal carcunima” Cancer, 67, pp 2180-2185 34 Liu, Y., et al (2009), “Immunostimulatory properties and enhanced TNFalpha mediated cellular immunity for tumor therapy by C60(OH)20 nanoparticles” Nanotechnology, 20(41), pp 415-419 35 Li, W., H Li, and F Gu (2012), “CRP and TNF-alpha induce PAPP-A expression in human peripheral blood mononuclear cells”, Mediators Inflamm, 32, pp 697-702 65 36 Marchetti, G., et al (2004), “Interleukin-2 immunotherapy exerts a differential effect on CD4 and CD8 T cell dynamics”, AIDS, 18(2), pp 211-217 37 Markoulatos, P., N Siafakas, and M Moncany (2002), “Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach”, J Clin Lab Anal, 16(1), pp 47-51 38 Moran-Utrera, Y., et al.(2012), “Trypanosoma cruzi SSP4 Amastigote Protein Induces Expression of Immunoregulatory and Immunosuppressive Molecules in Peripheral Blood Mononuclear Cells”, J Trop Med, 6(2), pp 829-939 39 Nguyen Thi Ngoc Tram, et al (2002), GC-MS of Crinum latifolium L Alkaloids, Z Naturforsch C, 57(3-4), pp 239-242 40 Nguyen Thi Ngoc Tram, E.Z., E Nikolova, E Katzarova, G Kostov, I Yanchev, O Baicheva (1999), “A novel in vitro and invio T-lymphocyte activating factor in Crinum latifolium L aqueous extracts”, Experimental Pathology and Parasitology, 3, pp 21-26 41 Nguyen Thi Ngoc Tram, Z.G.K., Nedyalka V Handjieva, Vassya S Bankova and Simeon S Popov (2003), “Volatiles from Crinum latifolium”, J Essent Oil Res, 15, pp 195-197 42 Nguyen-Van, D., et al (2011), “Epstein-Barr virus-positive diffuse large Bcell lymphoma of the elderly expresses EBNA3A with conserved CD8 T-cell epitopes”, Am J Blood Res, 1(2), pp 146-59 43 Mutch – RS, Hutson – PR (1991), “Levamisol in the adjiuvant treatmen of colon cancer”, Clin - Pharm, 10, pp 95-109 44 Roux, K.H (2009), “Optimization and troubleshooting in PC”, Cold Spring Harb Protoc, 2009(4), pp 66 66 45 S Davila-Velazque-JR; Santos - Preciado - JI; Martinez - Cairo – S (1998), “Effect of levamisol on microbicidal activity and chemotaaxis in polymorphonuclear cells”, Rev - Alerg - Mex, 45(2), pp 43-80 46 Theze, J., P.M Alzari, and J Bertoglio (1996), “Interleukin and its receptors: recent advances and new immunological functions”, Immunol Today, 17(10), pp 481-487 47 Vivitskii – VM, Kyia - ES; Dziubak – ST (1991), “Immunomodullating of levamisol in antibiotic therapy”, Antibiot - Khimioter, 21, pp 25-28 48 Wang, S., et al.(2011), “Subcellular resolution mapping of endogenous cytokine secretion by nano-plasmonic-resonator sensor array” Nano Lett, 11(8), pp 3431-3435 49 Zajac, P., A Schutz, D Oertli Ch Noppen, C Scheafer, M Hebere, G Spagnoli, W.R Marti (1991), “Enhancerd generation of cytotoxic T lymphocytes using recombinant vaccinia virus expressing human tumor assocciated antigents ang B7 costimulatory moleccules” Cancers, 58(20), pp 4567-4571 50 Zhang, X., et al.(2009), "Analysis of Amaryllidaceae alkaloids from Crinum by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry", Rapid Commun Mass Spectrom, 23(18), p 2903-2919 51 Zvetkova, E., et al.(2001), “Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia sinensis show immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear cells”, Int Immunopharmacol, 1(12), pp 2143-50 67 ...  Phạm Huy Cƣờng THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HỒNG CUNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30... với hai liều thuốc khác Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch Crilin T so với Levamisol Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung Cây Trinh nữ hồng cung (TNHC) cịn đƣợc gọi Náng rộng,... hỗ trợ (Th), tế bào lympho T ức chế (Ts),… Các cytokine có tác dụng tăng cƣờng ức chế đáp ứng miễn dịch Tác dụng cytokin thƣờng khơng đặc hiệu Các cytokin có tác dụng kích thích thƣờng thơng qua