Đánh giá hiệu quả việc thực hiện chính sách bồi thường hỗ trợ và tái định cư tại một số dự án trên địa bàn huyện thanh oai thành phố hà nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN    - PHẠM THỊ BÍCH PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Bích PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TÌM HIỂU VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1 Khái quát ung thƣ .3 1.1.2 Ung thƣ đại trực tràng 1.1.3 Các tác nhân gây ung thƣ đại trực tràng .4 1.1.4 Các hệ thống phân giai đoạn ung thƣ đại trực tràng .6 1.2 CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG .8 1.2.1 Chỉ thị sinh học 1.2.2 Một số biến đổi gen liên quan đến ung thƣ đại trực tràng .9 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƢ…………………………………………………………………12 1.4.CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG …………………………………………………………………… 16 1.4.1 Chemokine 16 1.4.2 Chemokine CXCL12 thụ thể CXCR4 19 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HĨA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG .21 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 NGUYÊN LIỆU 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô 24 2.2.2 Tách chiết ADN tổng số từ máu 25 2.2.3 Khuếch đại gen CXCL12 phƣơng pháp PCR 27 2.2.4 Phân tích RFLP 28 2.2.5 Khuếch đại vùng promoter gen CXCL12 kỹ thuật MSP .29 2.2.6 Điện di kiểm tra sản phẩm 32 2.2.7 Kỹ thuật nhuộm bạc 33 2.2.8 Dự đoán vùng promoter xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã gen CXCL12 34 2.2.9 Phân tích số liệu phƣơng pháp thống kê 34 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP .35 3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu 35 3.1.2 Kết khuếch đại đoạn gen CXCL12 PCR .36 3.1.3 Kết phân tích RFLP 37 3.1.4 Phân tích số liệu phƣơng pháp thống kê 41 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HĨA GEN CXCL12 .47 3.2.1 Kết tách chiết ADN từ mẫu mô 47 3.2.2 Kết xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã gen CXCL12 48 3.2.3 Khuyếch đại đoạn trình tự nằm đảo CpG thuộc vùng promoter gen CXCL12 kỹ thuật MSP 52 3.2.4 Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter gen CXCL12 bênh ung thƣ đại trực tràng 53 KẾT LUẬN .62 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC i PHỤ LỤC ii PHỤ LỤC iv PHỤ LỤC ix PHỤ LỤC x BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic AJCC American Joint Committee on Cancer APC Adenomatous polyposis coli APS Ammonium persulfate CEA Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thƣ) CIN Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể) CPG-CIMP CpG island methylator phenotype CRC Colorectal cancer (ung thƣ đại trực tràng) cs Cộng CXCL12 CXC ligand 12 (phối tử dạng CXC 12) CXCR4 CXC receptor (thụ thể dạng CXC 4) Denaturing high performance liquid chromatography DHPLC FAP Familial adenomatous polyposis (hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ) FOBT Fecal occult blood test (xét nghiệm máu phân) IUAC International Union Against Cancer HNPCC Hereditary nonpolyposis colon cancer (ung thƣ ruột kết không polyp di truyền) LOI Loss of imprinting (sự dấu ấn) MAPK Mitogen activated protein kinase MSI Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh) MSP Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl) NCBI National Center for Biotechnology Information PI3KCA Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit PCR- RFLP Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn) SSCP Single strand conformation polymorphism TBE Tris borate EDTA TE Tris - EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine TGF β Transforming growth factor β (yếu tố tăng trƣởng chuyển hóa β) TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố gây hoại tử khối u) TNM Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn) UTĐTT Ung thƣ đại trực tràng NST Nhiễm sắc thể DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Phân biệt hai khái niệm u lành tính ung thƣ theo đặc điểm sinh học Bảng Các chemokine thuộc họ CXC Bảng Các thành phần phản ứng PCR Bảng Các thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR enzyme FastDigest MspI Bảng Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl) Bảng Thành phần gel polyacrylamide 10% (bản 7cm) Bảng Phân bố genotype mẫu bệnh mẫu đối chứng theo vị trí khối u Bảng Phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân Bảng So sánh phân bố genotype nhóm ngƣời bệnh 70 tuổi dƣới 70 tuổi Bảng 10 Tần xuất alen gen CXCL12 mẫu đối chứng mẫu bệnh theo vị trí khối u Bảng 11 Tần xuất alen gen CXCL12 mẫu bệnh theo giới tính Bảng 12 Tần xuất alen gen CXCL12 mẫu bệnh theo độ tuổi Bảng 13 Tỷ lệ methyl hóa khơng methyl hóa vùng promoter gen CXCL12 mơ u mô lân cận u Bảng 14 Thống kê tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen CXCL12 theo đặc điểm lâm sàng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình ảnh đại trực tràng polyp đại tràng nội soi Hình Các giai đoạn phát triển ung thƣ đại trực tràng Hình Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CXCL12 Hình Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN enzyme MspI với băng 302bp, 202bp 100bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN enzyme MspI với băng 202bp 100bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN enzyme MspI với băng 302bp, 202bp 100bp (genotype dị hợp tử) Hình Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN enzyme MspI với băng 302bp Hình Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mơ Hình 10 Kết khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer Hình 11 Kết khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CXCL12 Hình 13 Tỷ lệ methyl unmethyl khảo sát loại mơ u lân cận u Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP củ a gen CXCL12 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học MỞ ĐẦU Ung thƣ trực tràng bệnh lý hay gặp ung thƣ đƣờng tiêu hóa, đứng hàng thứ hai sau ung thƣ dày chiếm 1,4 % tổng số ung thƣ Bệnh tiến triển tƣơng đối chậm, di muộn, phát sớm, điều trị kịp thời triệt để tỷ lệ sống năm đạt 60-80% [26] Tuy nhiên bệnh thƣờng đƣợc phát giai đoạn muộn di hay biến chứng, hiệu điều trị hạn chế Hàng năm, giới có khoảng 650.000 ngƣời đƣợc chẩn đoán mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng có khoảng 150.000 ngƣời chết bệnh này, loại ung thƣ nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong giới đứng hàng thứ hai gây tử vong Mỹ Tại Việt Nam, bệnh chiếm khoảng 15% số loại ung thƣ gia tăng cách rõ rệt Gần đây, thay đổi thói quen ăn uống giàu chất đạm, chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thƣ đại trực tràng ngày phổ biến Tuổi mắc bệnh chết ngƣời ngày trẻ hóa, nhiều trƣờng hợp 18 - 20 tuổi, chí có trẻ 12 mắc ung thƣ đại trực tràng [30] Trên giới ung thƣ đại trực tràng đƣợc nhà sinh y học quan tâm, có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đƣợc tiến hành Mục tiêu nghiên cứu nhằm tìm thị sinh học cho việc chẩn đoán bệnh sớm để điều trị kịp thời Tuy nhiên, đến nay, có carcinoembryonic antigen (CEA) thị sinh học thƣờng dùng cho chẩn đoán bệnh cho bệnh nhân giai đoạn III, IV, nhƣng chi phí cho xét nghiệm cịn tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm thị dễ nhận biết phát xác giai đoạn ung thƣ cần thiết Genomics proteomics lĩnh vực nghiên cứu cho phép xác định thị đặc trƣng cho bệnh, phục vụ cho công tác chẩn đốn, điều trị tìm ngun nhân bệnh Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi gen CXCL12 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng”, nhằm mục tiêu: Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Nhƣ Hiền (2005), Di truyền ung thư, NXB ĐH Quốc gia Hà Nội, Hà Nội, tr.12 Phạm Thu Huyền, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích tình trạng Methyl hóa Promoter gen CXCL12 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng”, Tạp chí y học Việt Nam tập 384(2), tr 72-77 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Hồng Vân, Trần Thị Thùy Anh, Lƣơng Tuấn Nghĩa, Lê Văn Quảng, Hà Hoài Nam (2011) “ Ứng dụng kỹ thuật PCR- SSCP để phát đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết khơng polyp di truyền”, Tạp chí khoa học ĐH Quốc gia Hà Nội số 27(2), tr 315 Tài liệu Tiếng Anh Anollés G.C., Gresshoff P.M (1994), “Staining Nucleic Acids with Silver: An Alternative to Radioisotopic and Fluorescent Labeling”, Promega Notes Magazine 40, pp 13 Cindy A.E., Kathleen D., Kazuyuki K., Leonard B.S., Corey B., Darryl S., Peter V.D., Peter W.L (2000), “MethyLight: a high-throughput assay to measure ADN methylation”, Nucleic Acids Research, 28(8), pp.32 Davuluri R.V., Grosse I., Zhang M.Q (2001), “Computational identification of promoters and first exons in the human genome”, Nature Genetics, 29, pp 412-417 64 Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học Dimberg J., Dienus O., Hugander A., Wågsäter D (2007), “Polymorphism and circulating levels of the chemokine CXCL12 in colorectal cancer patients”, International Journal of Molecular Medicine, 19(1), pp 11-15 Herman J.G., Graff J.R., Myöhänen B.D., Baylin S.B.(1996), “Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands ”, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 93, pp 9821–9826 10 Hidalgo-Pascual M, Galan J.J.,Chaves-Conde.M., Ramirez-Armengol J.A., Moreno C., Calvo E,Pelaez P., Crespo C., Ruiz A., Royo, and J.L (2007), “ Analysis of CXCL12 3'UTR G>A polymorphism in colorectal cancer”, Oncology Reports, 18(6), pp 1583-1588 11 Indrieux D., Escobar P., L azennec G (2009), “Emerging roles of chemokines in prostate cancer”, Endocrine-Related Cancer, 16(3), pp 663-673 12 Kim M.S., Lee J., Sidransky D (2010), “ADN methylation markers in colorectal cancer”, Cancer Metastasis Review, 29, pp 181-206 13 Li L.C., Dahiya R (2002), “MethPrimer: designing primers for methylation PCRs”, Bioinformatics, 18(11), pp 1427-1431 14 Neiva K., Sun Y.X., Taichman R.S (2005), “The role of osteoblasts in regulating hematopoietic stem cell activity and tumor metastasis”, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 38(10), pp 1449– 1454 15 Rot A., Andrian U.H (2004), “Chemokines in innate and adaptive host defense: Basic chemokinese grammar for immune cells”, Annual Review of Immunology, 22, pp 891–928 65 Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 16 Sanford D., Markowitz M.D., Bertagnolli M.M (2009), “Molecular Basis of Colorectal Cancer”, The New England Journal of Medicine, 361(25), pp 2449-2460 17 Sun X., Cheng G., Hao M., Zheng J., Zhou X., Zhang J., Taichman R.S., Pienta K.J., Wang J (2010), “CXCL12/ CXCR4 / CXCR7 chemokine axis and cancer progression”, Cancer Metastasis Review, pp.269-270 18 Tainsky M.A (2009), “Tumor Biomarker Discovery: Methods and Protocols”, Humana Press, New York, pp 520 19 Tones P.A., Baylin S.B (2002) The fundamental role of epigenetic events in cancer”, Nature Reviews Genetics, 3(6), pp 415–428 20 Van Dijk D., Oostindiër M., Kloosterman W., Krijnen P., Vasen H.W (2007), “Family history is neglected in the work-up of patients with colorectal cancer: a quality assessment using cancer registry data”, Familial Cancer, 6(1), pp 131-134 21 Weber G.F (2007), “Molecular Mechanisms of Cancer”, Springer, Ohio, pp 453-462 22 Wendt M.K., Johanesen P.A , Kang N., Binion D., Shah V., Dwinell M.B (2006), “Silencing of epithelial CXCL12 expression by ADN hypermethylation promotes colonic carcinoma metastasis”, Oncogene, 25, pp 4986–4997 23 Yu J.K., Chen Y.D., Zheng S (2004), “An integrated approach to the detection of colorectal cancer utilizing proteomics and bioinfomatics”, World Journal of Gastroenteraol, 10, pp 3127-3131 24 Zhou W., Jiang Z., Liu N., Xu F., Wen P., Liu Y., Zhong W., Song X., Chang X., Zhang X., Wei G., Yu J (2008), “Down-regulation of CXCL12 mRNA expression by promoter hypermethylation and its association with 66 Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học metastatic progression in human breast carcinomas”, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 135, pp 91-102 25 Zymo research EZ ADN Methylation- Gold TM Kit Tài liệu World Wide Web 26 http://www.benhhoc.com/content/1442-Ung-thu-truc-trang.html (2/2012) 27 http://rulai.cshl.edu/tools/FirstEF/) 28.http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/Patient/page2#k eypoint9 (11/2011) 29 http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol%E2%80%93chloroform_extraction (3/2012) 30 http://www.cancer.gov/cancertopics/types/colon-and-rectal (12/2011) 31 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_016861 (3/2012) 32 http://www.ungthuvn.org/ChuDe.aspx (11/2011) 33 http://www.rndsystems.com/chemokine_nomenclature.aspx (12/2011) 34 http://www.sggp.org.vn/suckhoecuaban/(1/2012) 35 http://ungthu.net.vn/ (11/2011) 36 http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan (3/2011) 37 http://www.urogene.org/methprimer/index1.html (3/2011) 38 http://yhth.vn/LibraryDetail/3002/vai-tro-chat-chi-diem-khoi-u-cea-ca19- 9-trong-chan-doan-va-dieu-tri-ung-thu-bieu-mo-tructrang.htm(3/2012) 39 http://www.ungbuou.vn/chi_tiet/821/ung_thu_dai_truc_trang (3/2012) 67 Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 68 Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học PHỤ LỤC Bảng kết phân tích MSP gen CXCL12 ST T 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Họ tên Nguyễn Trọng S Nguyễn Quốc L Bùi Văn P Lê Thị M Lê Thị Y Vũ Xuân C Dƣơng Thị H Lê Văn S Lê Bật X Nguyễn Văn T Phạm Trọng T Dƣơng Thị H Nguyễn Thị H Vũ Thị L Nguyễn Thế T Nguyễn Văn P Trần Văn B Hoàng Thị V Nguyễn Thị H Đặng Văn H Ngũ Thanh H Hồ Viết Ch Vũ Quang Nh Nguyễn Tiến Ƣ Lý Đức H Mô lân cận (A) Mô u (B) U M U M + + + - + + + - + + + - + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + - + + - + + - + + + - + + i - + + - + Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học PHỤ LỤC Trình tự RefSeqGene NG_016861.1 đoạn khảo sát để tìm đảo CpG gen CXCL12 sở liệu NCBI >gi|292658840:3001-6001 Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), RefSeqGene on chromosome 10 GGCCTCAGGGCGCCTGCGGGAGGGGCAGCGGCCAGGCCTGAATCCCTGGTTCGCCCTCGACTCAGCCCAC GCGGGCCTTTCAGGCTTCTGGGACAGATCCTAGGTCCAGCTGCCCACCTGATTTTGTGGCAAAGAAAAAA AGAAGAAGAAGAAGCGAGAGGCGATGGCGTTTGCTTTGGCCAGATTTAAGGGCAAGCGAGGCTGCGCGCG GCTCCCGCAGGGTCGGATCTCCGAGCTCCAGGGCGCCCCTCCACCCGGGTGTAGATTTCCCGCGGACCCC TTCGCCCTCCCGGGTTTCATCAGCTGCGCAGGAATGGAGCTGGCCAGAGCTCTGGGAGCGGGGAGGGAGG CGCCGCCACCAGAGGGCGCCGGAGCCCCAGCGCTGCGGCCGGTGAGCGGCCAGGCTCCCCGGCCCAGCCC AGCAAAGGCCTGGGGACGCCCGACGGCTGCCTTCTTCACTGGACCTCACTGCCTTCAGTTCTTTAAGAGC AGGGCCAAGTCAGTGGGGTTCCCGGCTCCAAGCCCAGTGCCCAGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGG TGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGAGTGCCGGCCCACAGCCATCTAACGGCCAAAGTGGTTTTGGAA AAAAAATGCACAGAAGACACCTACTCCCACCAGCGGAGTTCCGGAGCCCTCGCAGCCTCCTGTTGACCGC TCCCGCCTAATGCAGCCGCTGACCGCCCACTCCCCGACGGCCAGGACTCCCCAGGGACAGGGACGTGTCC CCAGGGCAGGCCCCTGGATGGACGCGGCGACTGACCCCACTTCGCTGGACGCTGTGCTGGGAAGGACACA GAGAGGTGGCTGGGGCAGCCTGCGGTCACAAAGCGAGGCCCAAAGGGGCGCTCTCCTCACCCCCACGTCT CCTGGGTGCCGACCTGCACCCTCCCTTCGCCACCGGACTGGGGCCATCTGGGATGTCTCGGGGGTATCCG GAGGGCTAAGCACCGCCGAGGGACGGCTCCGTGGGAAGAGTTTTCTGGACCCAGAAGGCAGACGCCAGTA GTACTGTCCTAGGAGTCGGAGGTCGGGGTGGGGGAGTTCTCAGCTCTTTGGGTCGCACGGAGCTTTTCTT GGGTAAGGCAGTAAGTACTTAGGTTTAAAGGACTTACTTACAGCTACCATTTATTGAGTACTGTCTGCTT GTCAGACACGATGCAGAGAATTTCGCGGCGTGGGGCGGGTCTCATTGAATCTCCCGTCCCACTCCGCGGG GTGGGCCTGTGATTAGCTCATTTCACCATTGAGAGGTCGGAAGTACAAAGGCTACATTCGCTTTTACTGA GAGCCGCCGGCGCCTTCTGCTTTGTTTGTACAGGCGAGGAAACTGAGGCTCGGCTGGTGGCGCCGTGGGC TTGGAGTCCGAGCCACGCTGACTGCAAAGACGGGTCTCATTCCCGCAGATCGAGCTCTGCCGGCGGCTGC GCCGCAAGCCGGGCAGGTGGCGAGCTTGAGCCCCCACGCACAGAAAGCAGGACCCCCTCGGCTGCCTTGG GCCGCCACCGCCAGCAGGCCCTCCGCCCGGGACTAACTTGTTTGCTTTTCATTGGTTCTCATTCAGTTCC CGCCATCGAAAGGCCCCGTCCCGCAGCTTTCCACGCGCGCCCCACTTTACGCCTAAGGTCCTCAGTCTCT CCAGTGGGGCCCTGTCACAGGGACAATAAGCGGCCCTCCAGCCGGCGTCGCTCAGGCTGCGGACCTCACT GCAGACCGGGCCAGCGGTGCGGGGCCCAGCGGAGCCTGAGAAGGTCAAAGGCCGGAGCGCACTGCGCCTC GGGAGCACAGAGGGAGCGGAGGAGGGGCGAAGGGGATGGGTGGGGGGTGCCGCCGAGGGAGTCGCGCGTC AGAGACCCCGGCCACGGCCAGCACTCGGCTCCGGGCCCGCCCCTCACCGCGCGCCCCGCCCCGCCCCGCC TGGCTCTCCCCTCTAAAGCGCCCGGCGCGCGCCTCCCACCGCCGCACTTTCACTCTCCGTCAGCCGCATT GCCCGCTCGGCGTCCGGCCCCCGACCCGCGCTCGTCCGCCCGCCCGCCCGCCCGCCCGCGCCATGAACGC ii Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học CAAGGTCGTGGTCGTGCTGGTCCTCGTGCTGACCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGTAAGTGCGCTCGGCGG GGAGGCCCTGGCGAGGCTCTGGGCTTCGGCTCCCGCCCGGCGCAGAGCCGCGGCTCCTCTGCCTGCGCCC GCAGTTTGCGCCGCCCGACACAGTGGGGGTGGAGGCAGCTCGCTTAGCTGGGCGCTCTGGTGCGGTGTCG CGTTCAAAGCCCTACTTTTGCGCCGAGGGTTTGTGACCTGCAGAGAGCGACCGCCTGACCTCAAGCTGGC TGCAGAGCGAGGTCAGCCGGGACAACTGGGCAGGAACGCCCCAAGAGAGCGTTCGGGACTGGCGCGGGAA GGCGCGAGGGTGGGGAGCCGCGGACCCCAGACCCCTGCCTGCCCACCCTCCACCCACTGCCTTCCCGCTG CGGGCTCGGTTTCCACAGGCGAATGGGCTCCGAGGTCCTGCTGCGCACAGTGCTGGAGGTCGGGCGGTGC ATGGCGAGAGCGCGCTTTGCAAAGTTCGCCTCATGCCGCGACTTGAGGCTGTGAGGTCCGATGCAGCCGC GCAGCCTCCGCTCCCTGCGAAGCCGATCCTCTCCCCACACCCTCGCGGGGCTCTTGGCCAGGCGCGGGCG GGCTGCGCGGCGCAGCTGTCGGGCTTGTGCCACCCGCCAGGCCGCGCTTCTGCACAGCTCCGCGGTCCGC AGCGACGCGGACCTGGGCGCGCGTCCAGCCGCTGTCTTCCTGTCTCTTCTCGGGTTCACCTGAGAGAGGC CCAGGGACCCTCCGAGCCTCACACGCCCCCTCCCCAGCTCCCCAAACACACCTGCAGACAGGCTCTTTTG TCACCAGCTGGCCAAGCGCTTTGCCCCAGAATGAGAGCTGCAGCAAAGTTCAATCTCCAAG iii Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học PHỤ LỤC Trình tự tham khảo RefSeqGene NG_016861.1 gen CXCL12 sở liệu NCBI Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), RefSeqGene on chromosome 10 NCBI Reference Sequence: NG_016861.1 FASTA Graphics LOCUS NG_016861 21941 bp DEFINITION Homo sapiens chemokine RefSeqGene on chromosome 10 ACCESSION NG_016861 VERSION NG_016861.1 KEYWORDS RefSeqGene SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM ADN (C-X-C linear motif) PRI 15-MAY-2011 ligand 12 (CXCL12), GI:292658840 Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo FEATURES source Location/Qualifiers 21941 /organism="Homo sapiens" /mol_type="genomic ADN" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="10" /map="10q11.1" gene 5001 19941 /gene="CXCL12" /gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B; TLSF; TPAR1" /note="chemokine (C-X-C motif) ligand 12" /db_xref="GeneID:6387" /db_xref="HGNC:10672" /db_xref="MIM:600835" mRNA join(5001 5153,9218 9335,11375 11461,16755 19941) /gene="CXCL12" /gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B; iv Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học TLSF; TPAR1" /product="chemokine (C-X-C motif) ligand 12,transcript variant 2" /transcript_id="NM_000609.5" /db_xref="GI:291045299" /db_xref="GeneID:6387" /db_xref="HGNC:10672" /db_xref="MIM:600835" exon 5001 5153 /gene="CXCL12" /gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B; TLSF; TPAR1" /inference="alignment:Splign:1.39.8" /number=1 CDS join(5093 5153,9218 9335,11375 11461,16755 16770) /gene="CXCL12" /gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B; TLSF; TPAR1" /note="isoform beta is encoded by transcript variant2; intercrine reduced in hepatomas; pre-B cell growth-stimulating factor" /codon_start=1 /product="stromal cell-derived factor isoform beta" /protein_id="NP_000600.1" /db_xref="GI:10834988" /db_xref="CCDS:CCDS44373.1" /db_xref="GeneID:6387" /db_xref="HGNC:10672" /db_xref="MIM:600835" >gi|292658840|ref|NG_016861.1| Homo sapiens chemokine ligand 12 (CXCL12), RefSeqGene on chromosome 10 (C-X-C motif) ctcccaaagt gctgggatta cagccgtgag ccaccacgcc cagcccataa tacccttttt 61 aataaaccag taaacataag tgcttccctg agttccatga gctgtggtag caaattaatg 121 aaacccaagg atggggtcat agaaacccta atttatggtc atttggtcag aagcactggg 181 aaaacaaccc agggcttgca actggtatct gaagtagggg cagccttgtg ggactggggc 241 ctcaacatgt ggggcctgag cctacctcca ggtagatcat ctcagagttg aattgaatta v Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 1981 ttaactcagc agccagaccc ctgcctccca ccttgaactg tgcttaacaa ggcatccctg 2041 aggagccgct gtgccctgca ttacctggta gagcggcaca gagtctgaag acttcaggag 2101 aaggtggggc tctatgggga gtaagagtcc ccaggcagag aaagaaaggt ggagcctttt 2161 gagcataagc ataagcaaag gacacaggga aaggggtggg gaacttcgct gacccgaatt 2221 tgagaggtac ccctgtggcc gagtgagctg gagacatgtc aaaatggcct ggtctgatgg 2281 ccgcctgcct gtgcaggcgg tgcggaggcc cccagagtgt acagggtttt attttatttt 2341 atttacatat ttacatattt atttatttat ttacatattt gtttatttat ttatttttga 2401 gacggagtct cgctttgtca cccaggctgg agtgcagtgg cgccatctcg gctcactgca 2461 agctccgcct cccgggttca cgccattttc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta 2521 caggcgcccg ccaccacggc cggctaattt ttttgtattt ttagtagaga cggggtttca 2581 ccgtgttagc caggatggtc tcgaactcct gacctcgtga tccgcccgcc tcggccttcc 2641 aaagtgctgg gattacaggc atgagccacc gtgcccggcc agggttttaa atttcaatcg 2701 ccaattgtaa aattgtgagg cttgtaccta aaatatggat ccttggccac cctatttaaa 2761 atcctaactc ccaccccact ttcctctgct ccatcttccc ctagcattta atggccttct 2821 aagtatttta tgcgtaatta cttatgctta gcgccatgtg cttctaaacg tttagtgcct 2881 tttctaaact acttcaaaca tgtagcccag gtctagcaca tagtgggtgc tcagtaagta 2941 tttaacgaac gactagcgga agggatggcc ccatgggtgc cacagtagct tctgttctgg 3001 ggcctcaggg cgcctgcggg aggggcagcg gccaggcctg aatccctggt tcgccctcga 3061 ctcagcccac gcgggccttt caggcttctg ggacagatcc taggtccagc tgcccacctg 3121 attttgtggc aaagaaaaaa agaagaagaa gaagcgagag gcgatggcgt ttgctttggc 3181 cagatttaag ggcaagcgag gctgcgcgcg gctcccgcag ggtcggatct ccgagctcca 3241 gggcgcccct ccacccgggt gtagatttcc cgcggacccc ttcgccctcc cgggtttcat 3301 cagctgcgca ggaatggagc tggccagagc tctgggagcg gggagggagg cgccgccacc 3361 agagggcgcc ggagccccag cgctgcggcc ggtgagcggc caggctcccc ggcccagccc 3421 agcaaaggcc tggggacgcc cgacggctgc cttcttcact ggacctcact gccttcagtt 3481 ctttaagagc agggccaagt cagtggggtt cccggctcca agcccagtgc ccagggtggg 3541 tgggtgggtg ggtgggtggg tggatggatg gatggatgga tggatggagt gccggcccac 3601 agccatctaa cggccaaagt ggttttggaa aaaaaatgca cagaagacac ctactcccac 3661 cagcggagtt ccggagccct cgcagcctcc tgttgaccgc tcccgcctaa tgcagccgct 3721 gaccgcccac tccccgacgg ccaggactcc ccagggacag ggacgtgtcc ccagggcagg 3781 cccctggatg gacgcggcga ctgaccccac ttcgctggac gctgtgctgg gaaggacaca 3841 gagaggtggc tggggcagcc tgcggtcaca aagcgaggcc caaaggggcg ctctcctcac 3901 ccccacgtct cctgggtgcc gacctgcacc ctcccttcgc caccggactg gggccatctg 3961 ggatgtctcg ggggtatccg gagggctaag caccgccgag ggacggctcc gtgggaagag 4021 ttttctggac ccagaaggca gacgccagta gtactgtcct aggagtcgga ggtcggggtg 4081 ggggagttct cagctctttg ggtcgcacgg agcttttctt gggtaaggca gtaagtactt 4141 aggtttaaag gacttactta cagctaccat ttattgagta ctgtctgctt gtcagacacg 4201 atgcagagaa tttcgcggcg tggggcgggt ctcattgaat ctcccgtccc actccgcggg vi Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 4261 gtgggcctgt gattagctca tttcaccatt gagaggtcgg aagtacaaag gctacattcg 4321 cttttactga gagccgccgg cgccttctgc tttgtttgta caggcgagga aactgaggct 4381 cggctggtgg cgccgtgggc ttggagtccg agccacgctg actgcaaaga cgggtctcat 4441 tcccgcagat cgagctctgc cggcggctgc gccgcaagcc gggcaggtgg cgagcttgag 4501 cccccacgca cagaaagcag gaccccctcg gctgccttgg gccgccaccg ccagcaggcc 4561 ctccgcccgg gactaacttg tttgcttttc attggttctc attcagttcc cgccatcgaa 4621 aggccccgtc ccgcagcttt ccacgcgcgc cccactttac gcctaaggtc ctcagtctct 4681 ccagtggggc cctgtcacag ggacaataag cggccctcca gccggcgtcg ctcaggctgc 4741 ggacctcact gcagaccggg ccagcggtgc ggggcccagc ggagcctgag aaggtcaaag 4801 gccggagcgc actgcgcctc gggagcacag agggagcgga ggaggggcga aggggatggg 4861 tggggggtgc cgccgaggga gtcgcgcgtc agagaccccg gccacggcca gcactcggct 4921 ccgggcccgc ccctcaccgc gcgccccgcc ccgccccgcc tggctctccc ctctaaagcg 4981 cccggcgcgc gcctcccacc gccgcacttt cactctccgt cagccgcatt gcccgctcgg 5041 cgtccggccc ccgacccgcg ctcgtccgcc cgcccgcccg cccgcccgcg ccatgaacgc 5101 caaggtcgtg gtcgtgctgg tcctcgtgct gaccgcgctc tgcctcagcg acggtaagtg 5161 cgctcggcgg ggaggccctg gcgaggctct gggcttcggc tcccgcccgg cgcagagccg 5221 cggctcctct gcctgcgccc gcagtttgcg ccgcccgaca cagtgggggt ggaggcagct 5281 cgcttagctg ggcgctctgg tgcggtgtcg cgttcaaagc cctacttttg cgccgagggt 5341 ttgtgacctg cagagagcga ccgcctgacc tcaagctggc tgcagagcga ggtcagccgg 5401 gacaactggg caggaacgcc ccaagagagc gttcgggact ggcgcgggaa ggcgcgaggg 5461 tggggagccg cggaccccag acccctgcct gcccaccctc cacccactgc cttcccgctg 5521 cgggctcggt ttccacaggc gaatgggctc cgaggtcctg ctgcgcacag tgctggaggt 5581 cgggcggtgc atggcgagag cgcgctttgc aaagttcgcc tcatgccgcg acttgaggct 5641 gtgaggtccg atgcagccgc gcagcctccg ctccctgcga agccgatcct ctccccacac 5701 cctcgcgggg ctcttggcca ggcgcgggcg ggctgcgcgg cgcagctgtc gggcttgtgc 5761 cacccgccag gccgcgcttc tgcacagctc cgcggtccgc agcgacgcgg acctgggcgc 5821 gcgtccagcc gctgtcttcc tgtctcttct cgggttcacc tgagagaggc ccagggaccc 5881 tccgagcctc acacgccccc tccccagctc cccaaacaca cctgcagaca ggctcttttg 5941 tcaccagctg gccaagcgct ttgccccaga atgagagctg cagcaaagtt caatctccaa 6001 ggccctgggc cactgggaac cgtggtgtcc cgtttcactg ggagagggct tttttctttt 21661 cagggcactg ggtttcagct tccttattcc catcacttgt gggaggcaca aacacagctg 21721 agaaagctgg acccccacgg tgatggggtc ccctcagcac ggctgattgc atggagtgga 21781 cactggatgc atattgcagg ccgatctgat tttctgtcac aggagtacaa ggctgtgatt 21841 caacagcatc gggctttgct ccctttctct gtgcctgcag ctgaggactc ggcactctgg 21901 agtgtgggct gccgggagac agaagcagag ggagccccca c // vii Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học PHỤ LỤC Kết dự đốn trình tự promoter gen CXCL12 theo chƣơng trình FirstEF (http://rulai.cshl.edu/tools/FirstEF/) FirstEF Results - Sat Mar 24 12:47:03 2012 >gi|292658840:1-6001_1 Predictions on the direct strand No Promoter P(promoter) Exon P(exon) P(donor) CpG Window Rank 00004474 00005043 1.0000 00004974 00005153 1.0000 0.9999 00004898 00005099 1 00004571 00005140 1.0000 00005071 00005391 1.0000 0.9937 00004898 00005099 >gi|292658840:1-6001_1 Predictions on the complementary strand No Promoter P(promoter) Exon 00005584 00005015 1.0000 00005084 00004938 00005779 00005210 1.0000 00005279 00005134 00005325 00004756 1.0000 00004825 00003924 00005243 00004674 1.0000 00004743 00003724 00005324 00004755 1.0000 00004824 00003806 00005638 00005069 1.0000 00005138 00005056 00005323 00004754 1.0000 00004823 00003901 P(exon) P(donor) CpG Window Rank 1.0000 0.9998 00005139 00004938 1.0000 0.9880 00005139 00004938 1.0000 0.9737 00005139 00004938 1.0000 0.9302 00005139 00004938 1.0000 0.9264 00005139 00004938 1.0000 0.9122 00005139 00004938 1.0000 0.9085 00005139 00004938 viii Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học PHỤ LỤC Kết dự đốn trình tự promoter gen CXCL12 theo chƣơng trình Proscan (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/) Proscan: Version 1.7 Processed Sequence: >gi|292658840:1-6001_1 6001 Base Pairs Promoter region predicted on forward strand in 4696 to 4946 Promoter Score: 59.64 (Promoter Cutoff = 53.000000) Significant Signals: Name UCE.2 GCF T-Ag AP-2 UCE.2 PuF JCV_repeated_sequenc AP-2 SDR_RS AP-2 AP-2 UCE.2 Sp1 Sp1 GCF Sp1 Sp1 Sp1 GCF APRT-mouse_US EARLY-SEQ1 (Sp1) AP-2 TFD # S00437 S01964 S00974 S01936 S00437 S02016 S01193 S01936 S01561 S00346 S01936 S00437 S00801 S00802 S01964 S00781 S00978 S00979 S01964 S00216 S01081 S01187 S00346 Strand + + + + + + + + + + + + + + + ix Location 4715 4769 4771 4775 4800 4858 4858 4860 4862 4867 4896 4903 4926 4927 4930 4931 4932 4933 4939 4943 4944 4944 4946 Weight 1.216000 2.361000 1.086000 1.108000 1.278000 1.082000 1.427000 1.091000 1.554000 1.672000 1.108000 1.216000 2.755000 3.292000 2.284000 2.772000 3.361000 6.023000 2.361000 6.003000 6.322000 8.117000 1.355000 Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học Promoter region predicted on reverse strand in 5296 to 5046 Promoter Score: 54.66 (Promoter Cutoff = 53.000000) Significant Signals: Name JCV_repeated_sequenc Sp1 GCF Sp1 GCF JCV_repeated_sequenc Sp1 AP-2 Sp1 EARLY-SEQ1 AP-2 AP-2 Sp1 Sp1 KROX24 Sp1 Sp1 EGR-1 AP-2 Sp1 Sp1 T-Ag UCE.2 Strand + + + + + + + + + + + - Location 5267 5256 5254 5251 5248 5208 5207 5203 5202 5201 5184 5172 5171 5166 5091 5087 5086 5083 5082 5082 5081 5051 5049 x Weight 1.658000 3.013000 2.361000 3.061000 2.284000 1.427000 3.191000 1.672000 3.119000 5.795000 1.355000 1.108000 2.755000 2.772000 2.151000 3.013000 3.191000 2.294000 1.672000 3.061000 3.119000 1.086000 1.278000 ... bisulfite chuyển thành uracil cytosine đƣợc chuyển thành timine thiết kế mồi [25] Thành phần phản ứng PCR nhƣ sau (bảng 5): Bảng Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl) Thành phần Thể tích... phải) đại tràng Khi có thành viên gia đình đƣợc chẩn đốn mắc ung thƣ đại trực tràng nguy thành viên khác mắc bệnh cao gấp nhiều lần so với bình thƣờng, phụ thuộc nhiều vào số thành Luận văn cao học... định trình tự biến đổi với bisulfite vị trí CpG đặc hiệu vùng Tỷ lệ C chuyển thành T vị trí riêng biệt đƣợc định lƣợng dựa tỷ lệ kết hợp C T suốt trình kéo dài chuỗi Hạn chế phƣơng pháp giá thành