Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thuốc đông dược trên địa bàn tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THANH TẦNG PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THUỐC ĐÔNG DƢỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THANH TẦNG PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THUỐC ĐÔNG DƢỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 939/QĐ-ĐHNT ngày 01/11/2016 Quyết định thành lập hội đồng: 685/QĐ-ĐHNT ngày 02/8/2017 Ngày bảo vệ: 19/8/2017 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY Chủ tịch Hội đồng: TS VŨ KHẮC HÙNG Khoa sau đại học: KHÁNH HỊA - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Phân tích tiêu vi sinh vật gây bệnh thuốc đông dƣợc địa bàn tỉnh Khánh Hịa” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, ngày 28 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thanh Tầng iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý phòng, ban Trường Đại học Nha Trang, thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Môi trường tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Duy, người tận tình bảo hướng dẫn suốt thời gian thực nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 28 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thanh Tầng iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan thuốc đông dược 1.1.1.Khái niệm thuốc đông dược 1.1.2 Khái niệm quy định lấy mẫu thuốc 1.1.3 Phương pháp bào chế thuốc đông dược 1.1.4.Tình hình thuốc đơng dược, dược liệu Việt Nam 1.1.5 Tình hình thuốc đơng dược tỉnh Khánh Hịa 1.1.6 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm tiêu vi sinh vật gây bệnh nấm men, nấm mốc 1.1.7 Ảnh hưởng vi sinh vật chế phẩm từ dược liệu 1.1.7.1.Vi sinh vật làm thay đổi cảm quan thuốc 1.1.7.2 Vi sinh vật làm biến đổi chất lượng thuốc 1.2 Các nhóm vi sinh vật gây bệnh thuốc đơng dược 1.2.1 Escherichia coli .9 1.2.2 Staphylococcus aureus 10 1.2.3 Pseudomonas aeruginosa 11 1.2.4 Salmonella 11 1.2.5 Nấm men, nấm mốc 12 1.3 Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật 13 1.3.1 Trung hòa tác động ức chế thuốc bảo quản 13 1.3.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc .13 1.3.3 Phương pháp MPN 14 v 1.3.4 Phương pháp màng lọc 14 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng, vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu .17 2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.3.1 Vi sinh vật dùng thử nghiệm 17 2.1.3.2 Thiết bị hóa chất chuyên dụng .17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Chuẩn bị mẫu thử 20 2.2.1.1 Đồng mẫu 20 2.2.1.2 Phát chất ức chế có thuốc 20 2.2.2 Trung hòa chất ức chế có thuốc 22 2.2.3 Phân tích tiêu vi sinh vật 22 2.2.3.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 22 2.2.3.2 Tổng số nấm men, nấm mốc 23 2.2.3.3 Pseudomonas aeruginosa 23 2.2.3.4 Escherichia coli 24 2.2.3.5 Staphylococcus aureus 26 2.2.3.6 Salmonella 27 2.2.3.7 Tổng số Enterobacteria 27 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Thu thập xử lý mẫu 29 3.2 Tổng số vi khuẩn hiếu khí thuốc đơng dược địa bàn tỉnh Khánh Hòa 30 3.3 Tổng số nấm men, nấm mốc thuốc đông dược địa bàn tỉnh Khánh Hòa .35 3.4 Tổng số vi khuẩn đường ruột (Enterobacteria) thuốc đơng dược địa bàn tỉnh Khánh Hịa 41 3.5 Phát nhóm vi khuẩn gây bệnh thuốc đông dược địa bàn tỉnh Khánh Hòa 42 vi 3.6 Đánh giá chung kết phân tích tiêu vi sinh vật gây bệnh đề xuất giải pháp nâng cao công tác quản lý chất lượng thuốc đông dược địa bàn tỉnh Khánh Hòa .44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 51 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Chữ viết tắt Ghi (-) Âm tính (+) Dương tính CFU Colony Forming Unit LKN Lấy kiểm nghiệm DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV TCN Tiêu chuẩn ngành BP British Pharmacopoeia Dược điển Anh USP United States Pharmacopoeia Dược điển Hoa Kỳ YDHCT Y dược học cổ truyền GMP Good Manufacturing Practices Thực hành sản xuất tốt Thực hành tốt bảo quản GSP Good Storage Practice thuốc Tổng sản phẩm quốc nội hay GDP Gross Domestic Product tổng sản phẩm nội địa GPP Good Pharmacy Practice Thực hành tốt nhà thuốc KPH Không phát VSV Vi sinh vật VKGB Vi khuẩn gây bệnh TSEn Tổng số Enterobacteria ATCC American Type Culture Collection viii E coli Escherichia coli P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S.aureus Staphylococcus aureus A.niger Aspergillus niger A.flavus Aspergillus flavus S.cerevisiae Saccharomyces cerevisiae g Gram KIA Môi trường thạch Kligler Iron Agar MR-VP Canh thang Methyl Red - Voges proskauer TSA Tryptose sulfite Agar TSB Tryptic Soy Broth SDA Sabouraux Dextrose Agar XLD Xylose lysin desoxycholat NA Nutrient Agar ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Số mẫu thuốc đông dược, dược liệu kiểm tra qua năm nước .7 Bảng 1.2 Số mẫu thuốc đông dược kiểm tra qua năm tỉnh Khánh Hòa Bảng 2.1 Số lượng dạng thuốc thử nghiệm 16 Bảng 2.2 Địa điểm lấy mẫu, số mẫu lấy 16 Bảng 3.1 Kết phân tích tiêu vi sinh vật thuốc đông dược 44 Bảng 3.2 Tỉ lệ mẫu thuốc đông dược kiểm tra qua năm tỉnh Khánh Hòa 45 x  Lactose 10g  Eosin Y 0,4g  Xanh methylen 0,065g  Nước cất 1000ml Pha chế: Pha chế theo hướng dẫn nhà sản xuất Môi trƣờng Thạch - sắt – ba đƣờng  Casein thủy phân pancreatic 10,0 g  Sắt (II) amoni sulfat 0,2g  Pepton 20g  Natri clorid 5,0g  Lactose 10g  Natri thiosulfat 0,3g  Đường trắng 10g  Đỏ phenol 0,025g  D –glucose monohydrat 1,0g  Thạch 13,0g  Nước cất 1000ml Pha chế: Đun nóng, hịa tan hồn tồn Đem hấp tiệt trùng 1210C/15phút pH sau hấp 7,3  0,2 Môi trƣờng Enterobacteria –Mossel  Genlatin thủy phân pancreatic 10,0g  D –glucose monohydrat 5,0g  Mật bị khơ 20g  Kali dihydrophosphat 2,0g  Dinatri hydrophosphat dihydrat 8,0g  Xanh brilliant 15mg  Nước 1000ml Pha chế: Điều chỉnh pH cho sau đun 7,0 đến 7,4 Đun sôi 30 phút làm lạnh Môi trƣờng muối mật Violet-Red  Genlatin thủy phân pancreatic 7,0g  Cao nấm men 3,0g  Muối mật 1,5g  Lactose monohydrat 10g  NaCl 5g  D –glucose monohydrat 10g  Đỏ trung tính 30mg  Tím tinh thể 2mg  Nước 1000ml  Thạch 15g Pha chế: Điều chỉnh pH cho sau đun 7,2 - 7,6 Đun sôi để tiệt trùng, không hấp Dung dịch đệm phosphat pH 7,2 Lấy 50ml dung dịch katri dihydrophosphat 0.2M (TT), thêm 35ml dung dịch natri hydroxyd 0.2M, thêm nước vừa đủ 200ml Phụ lục KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THUỐC ĐƠNG DƢỢC Kết vi sinh vật có mL thuốc nƣớc Stt Mã mẫu Tổng số Tổng số vi sinh vật nấm men, hiếu khí nấm mốc (CFU/mL) (CFU/mL) Tổng số Vi Đánh Enterobacteria khuẩn giá gây kết bệnh (vi khuẩn/mL) 01 052/16LKN