Đang tải... (xem toàn văn)
Kính hiển vi điện tử truyền qua ( transmission electron microscopy , viết tắt: TEM) là một thiết bị nghiên cứu, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫ[r]
(1)MỤC LỤC
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 2
PHẦN II: NỘI DUNG 3
I Kính hiển vi 3
II Các nguyên lí loại kính hiển vi
III Kính hiển vi điện tử 5
1 Kính hiển vi điện tử truyền qua 5
Kính hiển vi điện tử qt đầu dị (Scanning Probe Microscope - SPM) 8
Kính hiển vi hiệu ứng đường hầm 9
IV Phương pháp nguyên tử đánh dấu 10
V.Phương pháp phóng xạ tự ghi 11
VI Phương pháp ly tâm 12
VII Máy vi quang phổ 13
VIII Phương pháp điện di 14
IX Đánh dấu phân tử tế bào đồng vị phóng xạ chất kháng thể 15
PHẦN: KẾT LUẬN 16
(2)PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
(3)PHẦN II: NỘI DUNG
I Kính hiển vi.
Kính hiển vi thiết bị dùng để quan sát vật chất nhỏ bé so với kích thước người mà mắt thường không quan sát Những kính hiển vi quan sát vật thể nhỏ bé ánh sáng, sử dụng thấu kính quang học hay gương quang học để tăng độ phóng đại hệ quang học Chúng gọi kính hiển vi quang học Ngày có nhiều phương pháp khác không sử dụng ánh sáng để quan sát vật thể nhỏ bé kính hiển vi thuộc loại có tên gọi đặc trưng cho phương pháp quan sát
II Các nguyên lí loại kính hiển vi
* Cấu tạo loại kính hiển vi sử dụng tia sáng thấy.
Kính hiển vi quang học thơng thường gồm hai phận chủ yếu học quang học Bộ phận quang học gồm hệ thống thấu kính kính vật mắt kính • Vật kính O1 : Là thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn dùng để tạo ảnh thật A1B1 lớn vật cần quan sát
• Thị kính O2 : Đóng vai trị kính lúp có tiêu cự ngắn • Hai kính đặt đồng trục khoảng cách chúng khơng đổi • Bộ phận tụ sáng : dùng để chiếu sáng vật cần quan sát
Cách ngắm chừng
(4)Độ bội giác
• ngắm chừng Cc Cv
• ngắm chừng vơ
(5)các tia tán xạ tối ví dụ: ta để lên tiêu giọt nước cất, có cấu tạo đồng nhìn vào kính hiển vi khơng thấy Ngược lại, để mâm kính vâth thể có cấu tạo khơng đồng ( ví dụ: tế bào ) tế bào nhiễu xạ ánh sáng(ánh sáng tán xạ), chiếu vào vật kính tạo ảnh ảo tế bào nhân, bào quan, thể vùi đen thể suốt nên cho ảnh rõ
III Kính hiển vi điện tử
Ta biết kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát vật nhỏ, độ phân giải kính hiển vi bị giới hạn bước sóng ánh sáng khả kiến, khơng thể cho phép nhìn thấy vật có kích thước nhỏ
Một điện tử chuyển động với vận tốc v, có xung lượng p = m0.v, tương ứng
với sóng có bước sóng cho hệ thức de Broglie:
Ta thấy bước sóng điện tử nhỏ nhiều so với bước sóng ánh sáng khả kiến nên việc sử dụng sóng điện tử thay cho sóng ánh sáng tạo thiết bị có độ phân giải tốt nhiều kính hiển vi quang học Người phát minh kính hiển vi điện tử Ruska, sinh năm 1906 kỹ sư điện tử viện đại học kỹ thuật Berlin Năm 1934 đạt học vị tiến sĩ vật lý Năm 1959 đạt học hàm giáo sư viện đại học Berlin Kính hiển vi điện tử phát minh năm 1932, đến năm 1939 kính hiển vi điện tử sử dụng vào lĩnh vực nghiên cứu sinh học Về nguyên tắc, nguyên lý cấu tạo kính hiển vi điện tử giống kính hiển vi quang học Đường tia điện giống tia sáng thấy vây cơng thức tính tốn kính hiển vi điện tử giống kính hiển vi quang học gọi “quang điện tử” khác nguồn lượng kính hiển vi điện tử chùm điện tử, kính hiển vi quang học chùm tia sáng mặt trời ánh sáng điện…
1.Kính hiển vi điện tử truyền qua.
(6)hàng triệu lần), ảnh tạo huỳnh quang, hay film quang học, hay ghi nhận máy chụp kỹ thuật số (Hình trên: Sơ đồ ngun lý kính hiển vi điện tử truyền qua)
Nguyên tắc tạo ảnh TEM gần giống với kính hiển vi quang học, điểm khác quan trọng sử dụng sóng điện tử thay cho sóng ánh sáng thấu kính từ thay cho thấu kính thủy tinh Sóng điện tử phát từ súng phóng điện tử, sợi đốt tức điện tử phát xạ nhiệt, phát lượng nhiệt đốt nóng ca tốt (thường dùng sợi tungsten, Wolfram, LaB6 ); đầu phát xạ trường (field emission gun), điện tử
phát hiệu điện cao đặt vào Sau tăng tốc điện trường V, động điện tử thu là:
Và xung lượng p cho cơng thức:
Như vậy, bước sóng điện tử quan hệ với tăng tốc V theo công thức
Với tăng tốc V = 100 kV, ta có bước sóng điện tử 0,00386 nm Nhưng với tăng tốc cỡ 200 kV trở nên, vận tốc điện tử trở nên đáng kể so với vận tốc ánh sáng, khối lượng điện tử thay đổi đáng kể, phải tính theo cơng thức tổng qt (có hiệu ứng tương đối tính):
(7)chân khơng cao Kính hiển vi điện tử truyền qua truyền thống (conventional transmission electron microscopy) sử dụng chùm điện tử song song chiếu qua mẫu
Một loại kính hiển vi điện tử truyền qua khác kính hiển vi điện tử truyền qua quét (scaning transmission electron microscopy - STEM) sử dụng chùm điện tử hội tụ chiếu xuyên qua quét mẫu, tạo độ phân giải cao nhiều Các hãng kính hiển vi điện tử tiếng Jeol, Hitachi, FEI, Philips
Sự tạo ảnh TEM: Độ tương phản TEM khác so với tương phản hiển vi quang học điện tử ảnh tạo điện tử bị tán xạ nhiều bị hấp thụ hiển vi quang học Ảnh trường sáng (bright field image) ảnh tạo giống nguyên tắc quang học thông thường, nhạy với sai hỏng mạng tinh thể Một kiểu tạo ảnh khác ảnh trường tối (dark field image) tạo từ việc thu chùm tia tán xạ lệch xa trục quang học Một chế độ tạo ảnh mạnh TEM ảnh hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (high resolultion electron microscopy - HRTEM) cho phép ta quan sát mặt tinh thể với độ tương phản cao Chế độ thực mẫu đủ mỏng quang sai kính đủ nhỏ cho phép Khi mẫu có từ tính, điện tử cịn bị tán xạ lực Lorentz (tương tác với đơmen từ), ta có ảnh Lorentz cấu trúc đômen vật rắn (chế độ Fresnel, Foucault, toàn ảnh điện tử )
Để quan sát ảnh TEM, mẫu phải đủ mỏng cho không làm hấp thụ hết chùm điện tử Bởi phải xử lý cho mẫu đủ mỏng Các phép xử lý mài học (sơ cấp mẫu dày), ăn mòn điện hóa, ăn mịn chùm ion (để tạo mẫu đủ mỏng), cắt lát mỏng chùm ion hội tụ (focused Ion beam - FIB - hình vẽ)
Hạn chế TEM: Hạn chế lớn kính hiển vi điện tử truyền qua phải xử lý mẫu đủ mỏng chùm điện tử xuyên qua mẫu quan sát Để hoạt động chế độ HRTEM, mẫu phải mỏng Vì thế, cần phải có cách xử lý thích hợp
(8)để không phá hủy cấu trúc mẫu, cơng việc xử lý tốn nhiều thời gian công sức Một điều sử dụng chùm điện tử lượng cao, nên hiển vi điện tử truyền qua hoạt động chế độ chân khơng cao
2.Kính hiển vi điện tử quét đầu dò (Scanning Probe Microscope - SPM)
Kính hiển vi qt đầu dị tên gọi chung cho họ kính hiển vi nhà vật lý giới phát minh thời gian gần Đây loại thiết bị tiên tiến giới nay, có nhiều ứng dụng, đặc biệt cơng nghệ nano sinh học phân tử Chúng ta biết kính hiển vi quang học khơng thể phóng đại mẫu vật có kích thước tí hon nhỏ phần triệu met, chẳng hạn virút phân tử Kính hiển vi điện tử, sử dụng chùm electron, khắc phục nhược điểm hiển vi quang học song ''khó tính'', cồng kềnh đắt tiền Mọi mẫu vật phải đặt điều kiện chân khơng, chẳng hạn muốn nhìn ảnh virus trước tiên phải làm chết virus, sấy khơ phủ lên virus loại màng để dễ dàng ảnh
Do vậy, với kính hiển vi điện tử người nhìn thấy hình ảnh mẫu vật “khơng cịn ngun dạng” mà thơi Cịn kính hiển vi qt đầu dị phóng đại mẫu vật mơi trường khơng khí mà khơng cần xử lý trước phủ, mạ thực tế tiền thân SPM kính kính hiển vi STM (Scanning Tuneling Microscope ) mà cán khoa học Viện hợp tác với nhà khoa học Đức chế tạo năm 2000 nhằm mục đích học tập nghiên cứu Tuy nhiên, STM hữu ích nhà nghiên cứu vật lý phóng đại mẫu vật chất dẫn điện Chính lý mà nhà khoa học giới phát triển họ kính hiển vi qt đầu dị (SPM), có phạm vi ứng dụng rộng lớn hơn, dựa nguyên lý STM Kỹ thuật SPM công cụ mạnh giúp người nhìn xử lý mẫu vật kích thước nano (1 nano phần tỷ mét) Nó giúp cho nghiên cứu tiêu siêu hiển vi hình thái
(9)= phần tỷ mét) mà không cần dùng tới chân không Đây việc đáng ghi nhớ trong khoa học công nghệ Việt Nam". GS Trần Xuân Hoài, Viện trưởng chủ nhiệm đề tài, cho biết: SPM tên chung họ kính hiển vi hoạt động theo nguyên lý mới, nhà vật lý giới phát minh gần đây, dùng để nghiên cứu đặc điểm bề mặt cấp độ cực nhỏ (nguyên tử) Kính hoạt động theo nguyên lý quét mũi dò nguyên tử bề mặt mẫu khoảng cách nguyên tử Hình ảnh hiển thị máy tính với hệ số phóng đại lớn dạng chiều, hai chiều ba chiều.Chiếc kính hiển vi SPM "made in Việt Nam" thử nghiệm để đo cấu trúc màng TiO2 (mẫu Viện Ứng dụng công nghệ gửi) xác định hình dạng, cấu trúc virus gây bệnh xoăn cà chua (mẫu Viện Công nghệ sinh học gửi), cho hình ảnh rõ nét Những hình ảnh hỗ trợ đắc lực nhà nghiên cứu việc đánh giá chất lượng sản phẩm, tìm hiểu đặc tính gây bệnh loài sâu bệnh
( Kính hiển vi qt đầu dị) (Giáo sư Trần Xn Hồi)
3 Kính hiển vi hiệu ứng đường hầm.
(10)(Sơ đồ giải thích chế làm việc kính hiển vi lực nguyên tử)
Sau kính hiển vi đường hầm điện tử chế tạo, cho phép quán sát nguyên tử bề mặt mẫu vật, người ta nhận kính hiển vi đường hầm điện tử cịn số hạn chế Hạn chế rõ kính hiển vi nghiên cứu mẫu dẫn điện (như kim loại bán dẫn), cần có di chuyển (xuyên hầm lượng tử) điện tử mũi nhọn máy quét mẫu.
Theo lời tự thuật nhà sáng chế kính hiển vi lực nguyên tử, việc mũi nhọn kính hiển vi đường hầm điện tử nằm gần bề mặt mẫu khiến họ nghĩ đến việc tính lực nguyên tử đầu mũi nguyên tử bề mặt Họ thấy lực đủ lớn để đo thể rõ khoảng cách đầu đo bề mặt Ví dụ, mũi nhọn nguyên tử, bị hút mạnh; vào khoảng hai nguyên tử, bị hút yếu Như vậy, việc đo lực quét mũi nhọn mẫu vật cho phép dựng lại độ lồi lõm bề mặt.Phương pháp áp dụng cho bề mặt, khơng thiết phải dẫn điện, khơng cần có dòng điện đầu đo mẫu vật Vấn đề lại máy phải đủ nhạy với biến đổi lực hút nguyên tử, vốn yếu
IV Phương pháp nguyên tử đánh dấu.
(11)số đếm lớn nhất(đến 80% lớn nữa) nhận trường hợp dùng máy đo nhấp nháy thể lỏng Việc đo ống đếm Geiger hoạt độ chất đồng vị thường để đạt tới hệ số đếm nhỏ 10%.Hoạt độ đánh dấu cịn tính theo nhiệt độ hoạt độ riêng, theo mức độ thị hoạt độ, đơn vị liều lượng xạ V.Phương pháp phóng xạ tự ghi.
Phương pháp nghiên cứu nguyên tố hóa học phóng xạ kính hiển vi tế bào sở chụp ảnh xạ ion lên vật cảm quang tốt, cho người ta định tính phân bố chất phóng xạ, xác định cấu trúc sinh hóa phức tạp định khu tế bào, mà cịn cho phép nghiên cứu hình thành cấu thành chất mà cần nghiên cứu Với điều kiện chặt chẽ việc bảo quản, cách đặt phim, hình phim việc dùng mẫu chuẩn thích hợp cho phép ta định lượng chất tế bào Hết sức tránh chất khử tính cảm quang bạc, làm cho phim đen, nghĩa phải có mẫu khơ thật Để tránh tác dụng hóa học lên phim phải để mẫu phim cách khoảng 5-7 micromet lớp pôlyetylen Phim phải có thuốc hình hai mặt Thời gian giữ để chụp phụ thuộc vào độ nhạy vật liệu ảnh độ phóng xạ mẫu thí nghiệm Chất phóng xạ mạnh Co60, P32, Cu64, Fe59, Zn65, cách chụp phim
chụp khác Chất phóng xạ yếu C14, S35, Ca45 phải có cách chụp tương ứng.
Chúng ta sử dụng đối tượng nghiên cứu trạng thái sống với chất đồng vị phóng xạ Các chất tế bào hấp thụ vào Sau tiến hành định hình mẫu vật chuẩn bị cắt lát Người ta để tiêu tối phết lên tiêu nhũ tương hạt nhân đặc biệt thời gian dài Sau rửa phim, phải quan sát kính hiển vi quang học Trên phim nơi mà chất phóng xạ tập trung nhiều, xuất chấm đen Ví dụ người ta dùng chất timidin có đánh dấu trium(H3) cho vào tế bào, sau thời gian ta xem phim, nơi đen lại
(12)trị tính chất chất đánh dấu Sắc ký phóng xạ tự ghi dùng để nghiên cứu đường trao đổi cácbon quang hợp.Phóng xạ tự ghi sắc đồ lớp mỏng tiện lợi phương pháp phóng xạ tự ghi Sau thu tự ghi ứng với vị trí sắc đồ, cắt thành dùng trực tiếp để xác định mức độ phóng xạ máy nhấp nháy thể lỏng hay ống đếm Geiger Phương pháp định hình mẫu chế phẩm sắc kí tự ghi phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm tính chất yếu tố đánh dấu Ví dụ, để nghiên cứu tổng hợp ADN, dùng dung dịch định hình để bảo vệ chất nhân, cho phép rửa tiểu thể khơng đồng hóa ADN-timidin đánh dấu khỏi tế bào Khi nghiên cứu tổng hợp protein cách đưa axit amin đánh dấu vào phân tử cần sử dụng dung dịch định hình giữ lại tất protein, lại hòa tan hết axit amin tự do.Độ lớn tinh thể halogen-bạc đặc điểm quan trọng nhũ tương hạt nhân Điều giải thích khơi phục tinh thể xảy trường hợp rơi trúng dù hạt β Vì với nhũ tương hạt lớn, xảy tượng tinh thể khôi phục, che điện tử tự ghi, lớn cấu trúc nơi có tập trung chất đánh dấu Vì thế, cần sử dụng nhũ tương với tinh thể có kích thích bé nhiều kích thước cấu trúc cần để quan sát phóng xạ tự ghi Có loại thuốc hình cho X quang, có thuốc hình metol hạt nhỏ, thuốc hình metol hạt nhỏ hydroquinon với borat, có loại thuốc định hình tương ứng cho thuốc nói
VI Phương pháp ly tâm
(13)trong mơi trường thích hợp nhiệt độ, hóa chất, độ pH định Đầu năm 40, máy siêu li tâm phân tích đời giúp tách phân tử tế bào tốc độ cao Để lắng chất kỹ hơn, phương pháp thang nồng độ đường saccaroza hay cloritcesium sử dụng Để đánh giá tốc độ lắng xuống đáy ống li tâm người ta dùng hệ số lắng S Hệ số tính đơn vị S (Svedberg ) S= 1cm 10-13giây
VII Máy vi quang phổ.
Đây phương pháp kiểm tra định lượng Trong máy vi quang phổ hấp thụ ánh sáng tế bào hay thành phần cấu tạo nên tế bào, dựa tia sáng có bước sóng khác Người ta chiếu chùm tia sáng qua tiêu với độ dài sóng tia sáng xác định nhờ có nguồn sáng thích hợp phận lọc ánh sáng Người ta đo thay đổi cường độ ánh sáng qua tiêu để vào kính hiển vi, nhờ quang kế tế bào nhạy cảm để xung quanh trường hiển vi Độ hấp thụ ánh sáng phụ thuộc vào tỉ lệ nồng độ chất hấp thụ ánh sáng độ dày chúng Từ kết nhận được, rút kết luận định lượng chất mà ta cần biết Ví dụ từ tế bào, xác định tỉ lệ định lượng chất bắt màu phần tế bào ta dùng fucsin kiềm phản ứng Feulgen kết hợp với phương pháp quang phổ kế, ta có định lượng hàm lượng ADN tế bào Ngày nay, với phương pháp quang phổ kế tế bào, người ta xác định chất tế bào với lượng 10-12- 10-14 trên diện tích µ2 Kết hợp phương pháp hóa tế bào và
kính hiển vi huỳnh quang cho phép nghiên cứu phân bố tế bào chất protit, lipit, axit nucleic chất pôlisaccarit phương pháp áp dụng tìm hiểu sâu đặc tính trao đổi protit tế bào
VIII Phương pháp sắc kí.
Phương pháp đời vào năm 40 cách mạng hóa phân tích hóa sinh thời
1 Phương pháp sắc kí giấy.
Mẫu phân tích đặt lên đầu giấy thẩm phơi khơ Sau nhúng đầu giấy có mẫu vào dung dịch có hai chất dung môi khác Theo lực mao dẫn chất lỏng thấm lên phía Các thành phần mẫu di chuyển lên phí theo độ hịa tan tương đối dung mơi chiếm vị trí định giấy
(14)Cũng dựa theo nguyên tắc khác dùng mỏng plastic hay thủy tinh có phủ lớp mỏng chất hấp thụ xenlulo hay gelsilicat
3 Phương pháp sắc ký cột.
Mẫu đặt phía cột phastic hay thủy tinh có chứa chất thấm nước xenlulo ngâm dung môi Một số lớn dung môi bơm chậm qua cột phía thu lại Các thành phần khác qua cột thu đoạn khác
VIII Phương pháp điện di.
Các protein có điện tích âm hay dương Nếu người ta lập điện trường dung dịch chứa phân tử protein, di chuyển với tốc độ phụ thuộc vào điện tích nó, kích thước hình dạng phân tử Kỹ thuật gọi điện di Việc tách hỗn hợp protein tiến hành nước hay dung dịch chất rắn xốp tinh bột giữ lại Hiện phương pháp điện di gel polyacrymit SDS sử dụng rộng rãi Phương pháp hoàn thiện điện di hai chiều gel, kết hợp hai kiểu tách khác Nó có dung dịch độ tách cao 1000 protein khác gel
IX Đánh dấu phân tử tế bào đồng vị phóng xạ chất kháng thể.
Đây hai phương pháp giúp phát chất đặc hiệu hỗn hợp với độ nhạy cao: điều kiện tối ưu, 1000 phân tử mẫu Phần lớn nguyên tố tự nhiên chứa hỗn hợp chất đồng vị khác khối lượng nhân, có số lượng điện tử có tính chất hóa học Nhân chất đồng vị phóng xạ khơng bền vững phân rã ngẫu nhiên tạo nguyên tử khác nhau, đồng thời phát hạt điện tử hay phóng xạ a, b Các chất phóng xạ thường dùng P32, S35, C14, H3, Ca15 chúng tham gia vào thành phần tế bào
như nguyên tố thơng thường Khi nằm tế bào vị trí nào, chất phát tia giúp ta phát vị trí q trình mà chúng tham gia Dấu phóng xạ liên tục đợt ngắn thay chất khơng phóng xạ vào Có thể đo độ phóng xạ ống đếm Geiger hay thường dùng phóng xạ đồ tự ghi Để làm phóng xạ đồ tự ghi giấy ảnh úp lên mẫu, hạt phát làm biến đổi giấy ảnh cho thấy rõ vị trí chỗ đồng vị phóng xạ nằm Ví dụ: ủ tế bào thymidine H3 cho thấy ADN tổng hợp
trong nhân lại Dùng Uridine H3(tiền thân uracil) cho thấy ARN được
(15)(16)PHẦN: KẾT LUẬN
Tóm lại, ngun tắc tất tính chất phần tử tế bào sống phát phương pháp tinh vi khác, tùy vào điều kiện trang thiết bị cấu trúc tiêu mà lựa chọn phương pháp cho phù hợp để kết nghiên cứu đạt kết cao
(17)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Sinh học tế bào- Nguyễn Như Đối. 2 Cơng nghệ sinh học- Trịnh Đình Đạt.
3. Các trang web:
- Wikipedia.
- Vietnamnet.
kích thước người mắt ánh sáng, thấu kính quang học gương quanghọc độ phóng đại hệ quang học. kính hiển vi quang học hệ thức de Broglie điện tử quang học, vận tốc ánhsáng tối ( lực Lorentz c ấ u trúc vi nguyênt nanômét, Gerd Calvin Quate Christoph Gerber 1986. ) ) lực nguyên tử lực khoảng cách dòng điện