Trước sự đa dạng rất lớn của loài, các phân tử sinh học và các con đường đồng hoá trên hành tinh này, kỹ thuật di truyền về nguyên tắc có thể là công cụ đắc lực trong việc tạo ra các lựa[r]
(1)VAI TRỊ CỦA CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG
1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP GEN ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1.1 Công nghệ sinh học cổ điển (hay CNSH đại phân tử) công nghệ sinh học đại (hay CNSH phân tử)
CNSH đại phân tử lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng sinh vật vi sinh vật (VSV) mức độ nguyên trạng, tức chưa sâu vào tìm hiểu ứng dụng mức độ cấu trúc phân tử mà tận dụng đặc tính kiểu gen (genotype) kiểu hình (phenotype) chúng để sử dụng chọn lọc loại tối ưu cho mục đích đặt
CNSH phân tử (Molecular Biotechnology) lĩnh vực tổng hợp có liên quan lớn đến ngành di truyền phân tử, tế bào học, VSV học, sinh hố học
CNSH phân tử có hai lĩnh vực CNSH phân tử CNSH phân tử ứng dụng
CNSH phân tử bản: bao gồm thao tác DNA mức độ phân tử cắt, nối, ghép, chuyển nạp, dẫn truyền loại gen ngoại lai hữu ích vào dịng tế bào chủ thích hợp để trì gen
CNSH phân tử ứng dụng: chọn lọc, nhân lên, sản xuất dòng tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm có ích cho người
CNSH phân tử CNSH ứng dụng hai bước để đưa nguyên lý tái tổ hợp gen thành thực, sản xuất thành phẩm hữu ích theo cơng nghệ mới- Cơng nghệ sinh học
1.2 Nguyên lý kỹ thuật tái tổ hợp gen ứng dụng CNSH 1.2.1 Mở đầu khái niệm:
Năm 1970, lần đầu tiên, Baltimore Temin độc lập phát loại enzyme có tác dụng chép ngược (reverse transcriptase) có tác dụng tham gia hoạt hố cho q trình tổng hợp ngược DNA từ khuôn RNA (reverse transcription) Điều cho phép có RNA thơng tin (mRNA) gen dạng sợi đơn, chuyển đổi thành gen hồn tồn (ở dạng DNA chuỗi xoắn kép) theo chế bổ sung chép ngược, có tham gia enzyme nói Đây nguyên lý tạo DNA bổ sung (complementary DNA-cDNA) từ mRNA
(2)loại enzyme có hoạt tính phân lập, người ta gọi enzyme hạn chế (restriction enzyme)
Cũng năm 70 tiếp theo, song song với phát triển hoàn thiện kỹ thuật thao tác vật liệu thông tin di truyền, việc phát sử dụng số thực thể vi sinh sống cộng sinh loại tế bào vi sinh vật nấm men, vi khuẩn có ý nghĩa ứng dụng to lớn Đó loại plasmid Chúng đóng vai trị quan trọng việc dẫn truyền gen ngoại lai tái tổ hợp vào tế bào vi sinh vật chủ tương ứng chúng Gần đây, năm 80, phản ứng nhân gen (Polymerase Chain Raction-PCR) phát nguyên lý: deoxyribonucleic acid (DNA) có cấu trúc chuỗi xoắn kép, gồm hai mạch nucleotide bổ sung cho theo quy luật A-T G-C mối liên kết hydro Giữa A-T có G-C có mối liên kết hydro Liên kết khơng phải liên kết hố học bền vững, tác dụng (ví dụ nhiệt độ cao 90oC, gần đến 100oC)
thì hai mạch nucleotide tách ra, hạ nhiệt hai mạch lạ xoắn trở lại Sự phát nâng cao kỹ thuật tái tổ hợp DNA ứng dụng thành kỹ thuật
Như vậy, enzyme hạn chế, ta cắt chuỗi DNA thành nhiều đoạn, ghép đoạn vào plasmid bị cắt enzyme tương tự để tạo nên plasmid mang đoạn DNA ngoại lai Nếu đoạn DNA gen hồn chỉnh có plasmid mang gen ngoại lai Kỹ thuật cắt-nối-ghép tạo nên thực thể vi sinh mới, mang hay nhiều đoạn DNA ngoại lai, gọi kỹ thuật tái tổ hợp DNA (recombinant DNA technology) Plasmid mang DNA ngoại lai gọi plasmid tái tổ hợp (recombinant plasmid) Khi pla smid đưa vào tế bào vi sinh vật chủ, q trình gọi q trình chuyển nạp (transformation) Plasmid mang DNA ngoại lai đóng vai trị chuyển DNA vào tế bào chủ gọi vector dẫn truyền (cloning vector)
Vector dẫn truyền plasmid hay loại thực thể vi sinh khác, virus chẳng hạn Khi vi sinh vật chủ (nấm men hay vi khuẩn ) tiếp nhận vector dẫn truyền để thực trình sinh học với DNA ngoại lai chuyển nạp, dịng VSV gọi VSV tái tổ hợp (recombinant microorganism)
Khi nuôi cấy VSV tái tổ hợp, DNA ngoại lai gen hồn chỉnh, bố trí điều kiện có cấu trúc vector dẫn truyền thích hợp, gen tổng hợp protein tế bào vật chủ Vector dẫn truyền có cấu trúc đặc biệt gọi vector biểu thị gen (expression vector)
1.2.2 Các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen
Kỹ thuật tái tổ hợp gen bao gồm nhiều cơng đoạn khác nhau,có thể tóm tắt sau:
Cắt DNA enzyme hạn chế (RE) Phân lập đoạn DNA cắt
(3)Nối ghép đoạn DNA ngoại lai vào plasmid Chuyển nạp vào tế bào VSV chủ thích ứng
Chọn lọc dịng tái tổ hợp theo nguyên tắc kháng kháng sinh Nhân dòng chọn lọc
Kiểm tra xác định kết
Vì vậy, thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen rõ ràng có liên quan đến:
a) Nguồn cung cấp DNA
Nguồn cung cấp DNA bao gồm tất loại hình có chứa DNA vi sinh vật, nấm men, thực vật, động vật bậc cao Các loại DNA cần phải làm khỏi thành phần khác tế bào bảo quản nhiệt độ -20oC Cũng mRNA phải chuyển sang
dạng cDNA Ngoài ra, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen sản phẩm PCR tinh khiết Mối quan tâm hàng đầu kỹ thuật tách chiết nucleic acid thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ tác nhân học (phân tử bị gãy nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải enzyme nội bào giải phóng mơi trường tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (desoxyribonuclease-DNase ribonuclease-RNase)
- Phương pháp tách chiết DNA: gồm bước sau:
§ Bước 1: Phá màng tế bào màng nhân (tế bào eucaryote) Thông thường, tế bào, mô nghiền hỗn hợp chất tẩy (detergent SDS, sarcosyl) proteinase (proteinase K) Hỗn hợp phá vỡ màng tế bào màng nhân, giải phóng DNA môi trường đồng thời phân huỷ protein liên kết với DNA
§ Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, chủ yếu protein Mẫu lắc thật mạnh dung dịch phenol chloroform Dung dịch phenol chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời khơng hồ tan nucleic acid Protein biến tính khơng cịn hồ tan pha nước có chứa nucleic acid sau ly tâm tủa thành lớp nằm pha nước pha phenol:chloroform Pha nước có chứa nucleic acid thu nhận lại
(4)- Phương pháp tách chiết RNA toàn phần mRNA
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ enzyme ribonuclease (RNase) Phương pháp tách chiết RNA toàn phần bao gồm bước DNA:
Tế bào, mô nghiền dung dịch gồm chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl) nồng độ cao, tác nhân gây biến tính protein biến tính mạnh (guanidinium thiocyanate), chất khử (2-mercaptoethanol) Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động Rnase nội bào tách protein liên kết khỏi phân tử RNA
Các protein loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol:chloroform li tâm
RNA hoà tan pha nước kết tủa ethanol thu nhận lại qua li tâm RNA bảo quản năm dạng tủa dung dịch ethanol đông lạnh -70oC nước
có chứa RNasine (một chất ức chế RNase)
Sau mRNA phân lập khỏi tế bào, để đưa chúng tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen, trước hết chúng phải chuyển sang dạng cDNA kỹ thuật DNA bổ sung Chỉ dạng DNA cắt nối enzyme hạn chế ghép vào plasmid
- Phản ứng nhân gen PCR (Polymerase Chain Reation)
Như nói trên, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen cịn sản phẩm PCR tinh khiết
Phản ứng PCR phản ứng nhân tạo thực PTN với tham gia thành phần sau:
DNA làm khn
Oligonucleotide (hay cịn gọi primer): hai chuỗi nucleotide ngắn, tổng hợp nhân tạo, bám vào vùng đặc hiệu sợi DNA làm khuôn trượt theo chiều tiến lại gần
Taq DNA polymerase: loại enzyme bền hoạt động tốt đến nhiệt độ 96oC, chiết xuất từ Thermus aquaticus (Taq)- loại vi khuẩn
sống suối nước nóng
Hỗn hợp deoxyribo-nucleotide triphosphate (dNTP): bao gồm thành phần deoxyribo-adenine triphosphate (dATP), deoxyribo- thymine triphosphate (dTTP), deoxyribo-guanine nucleotide triphosphate (dGTP), deoxyribo-cytosine triphosphate (dCTP) hỗn hợp theo tỷ lệ thích hợp Hỗn hợp có nhiệm vụ cung cấp nguồn nucleotide cho trình tổng hợp DNA xảy PCR
Mơi trường đệm (buffer): đảm bảo độ pH cần thiết Mg2+ với hợp chất cung cấp MgCl
2 với nồng độ 1.5-2.0 mM phản
ứng PCR
(5)Bước 1: dung dịch phản ứng bao gồm tất thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 94-95oC vòng 30 giây đến 1-2 phút.
Chuỗi DNA bị bung mối liên kết hydro tạo nên hai sợi DNA làm khuôn Đây giai đoạn biến tính (denaturation)
Bước 2: Nhiệt độ hạ thấp xuống khoảng 37-65oC (thấp Tm của
các primer), thông thường 45-55oC (mà cho phép primer bắt cặp
với sợi DNA làm khuôn vị trí thích hợp chúng ), khoảng từ 30 giây đến phút Đây giai đoạn lai (hybridization) hay gắn (annealing)
Bước 3: Nhiệt độ tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt
hoá primer để chúng trượt sợi khuôn, lấy dNTP môi trường bổ sung vào sợi tạo nên DNA Thời gian bước tuỳ thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kép dài từ 30 giây đến nhiều phút Đây giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation)
Một chu kỳ gồm bước lặp lặp lại nhiều lần, thường sau 25-35 chu kỳ tốt
Sản phẩm PCR đoạn DNA có độ dài từ vài chục đến vài chục nghìn nucleotide, thơng thường đến 3000 Vì lẫn tạp nhiều thành phần khác tham gia phản ứng PCR, nên sau sản phẩm PCR, trước hết cần kiểm tra độ dài đoạn DNA sản phẩm có với đoạn ước định cần có khơng phương pháp điện di khuếch tán thạch (agarose gel electrophoresis) Sau đó, cần thiết phải tinh khiết trước sử dụng làm vật liệu DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen
- Phương pháp điện di:
Sau q trình tách chiết, nucleic acid tinh nhờ số kỹ thuật siêu ly tâm, sắc ký, hay điện di
Phương pháp điện di sử dụng phân tích định tính thu nhận mẫu nucleic acid Nguyên tắc phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc nucleic acid Đó đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt, nên chịu tác động điện trường, chúng di chuyển cực dương điện trường Tính linh động phân tử thạch (gel) tác động điện trường tính theo cơng thức:
Log u = Log uo- KrC
Trong đó: Log uo tính linh động phân tử môi trường lỏng, Kr
là số làm chậm cấu trúc gel đồng thời phụ thuộc vào khối lượng phân tử nucleic acid, C nồng độ gel
(6)các chất tạo thành gel tuỳ thuộc kích thước trung bình đoạn nucleic acid cần phân tách
Bảng Tương quan nồng độ gel kích thước đoạn cần phân tách % acrylamide
4 11
Kích thước đoạn cần phân tách (cặp nucleotide)
200-800 80-200 40-100 10-50 % agarose
0.6-0.8 0.9-1.2 1.2-1.5
Kích thước đoạn cần phân tách (kb)
1-20 0.5-7 0.2-5
§ Gel agarose:
Là loại gel thông dụng thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách đoạn có kích thước 0.5-20 kb Gel đổ giá thể nằm ngang điện di thực thep phương nằm ngang Sau điện di, nucleic acid gel agarose hình dạng vạch màu đỏ cam tia tử ngoại (UV có λ=300 nm) nhờ có mặt ethidium bromide (được cho vào gel trước đổ)-có khả gắn xen vào base nucleic acid tác dụng tia tử ngoại phát huỳnh quang Bên cạnh đó, để ước lượng kích thước trình tự nucleic acid gel agarose, thường dùng yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker) Đây tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết trước gọi thang DNA (DNA ladder), thông thường sử dụng thang DNA thực khuẩn thể λ thuỷ giải enzyme giới hạn Hind III
§ Gel acrylamide:
Được dùng để tách đoạn kích thước nhỏ (dưới 1000 cặp base Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp với gel agarose, nên sử dụng cho mục đích đặc hiệu như:
- Tinh oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA
- Tách đoạn DNA nhỏ có chiều dài 500 cặp base
(7)phải tự định hướng lại Phân tử có kích thước lớn thời gian tự đinh hướng lớn khiến cho di chuyển chậm phân tử kích thước nhỏ
Một DNA đơn giản tạo băng Nếu DNA ban đầu lớn phức tạp, việc nhuộm gel cho thấy băng đại diện cho biến thiên liên tục kích thước đoạn Băng phần chứa đoạn mong muốn định vị với kỹ thuật Southern blotting chuyển Bởi một băng đại diện cho hỗn hợp vài đoạn, điện di gel với nồng độ khác để tách đoạn có kích thước tương tự - Thu nhận acid nucleic:
Điện di gel agarose sử dụng để thu nhận mẫu Sau điện di, vạch tương ứng với DNA cần tinh phát thu nhận lại theo phương pháp sau:
Phương pháp 1: phần agarose chứa vạch cắt DNA được thu nhận sau khuếch tán từ gel agarose vào dung dịch đệm thích hợp
Phương pháp 2: Một giếng nhỏ khoét agarose trước vạch DNA Giếng bơm dầy dung dịch đệm điện trường tái lập DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dịch đệm thu nhận lại
Phương pháp 3: Điện di thực gel agarose đặc biệt có điểm nóng chảy thấp (65oC) Sau điện di, vạch DNA cắt ra, ủ ở
trong dung dịch đệm nhiệt độ 65oC Khi agarose hoàn toàn tan
chảy, DNA thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết tủa b) Các enzyme thông dụng kỹ thuật di truyền
Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme-RE)
Các thực khuẩn thể (phage) xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn sinh sôi nhờ máy sinh tổng hợp vi khuẩn Khi số luợng phage tăng lên đến hàng triệu sao, chúng phá vỡ tế bào vi khuẩn Tuy nhiên số trường hợp, tế bào vi khuẩn nguyên vẹn mà phage khơng sinh sơi Hiên tượng DNA phage bị hệ thống bảo vệ vi khuẩn tiêu diệt vừa xâm nhập Hệ thống bảo vệ RE DNA vi khuẩn khơng bị RE chúng cắt nhờ chế gắn nhóm methyl vào A hay C vị trí cắt RE enzyme methylase Khi RE khơng cịn nhận biết vị trí cắt Đây tượng giới hạn RE hợp thành hệ thống bảo vệ tế bào procaryote
Các RE endonuclease có khả nhận biết cắt DNA mạch đôi cách lặp lại vị trí (trình tự) xác định, ứng dụng chủ yếu phương pháp tạo dịng
Ví dụ RE:
(8)↓
EcoRI 5’G A ATT C3’ 3’C TTA A G5’ ↑
(Dấu mũi tên thẳng đứng vị trí cắt)
Các enzyme thơng dụng khác: - Các polymerase: gồm nhóm:
Các DNA polymerase xúc tác cho tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’ Phần lớn DNA polymerase dùng DNA làm khuôn mẫu cho tổng hợp DNA (DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase) Một DNA polymerase đặc biệt enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) laị sử dụng khuôn RNA để tổng hợp DNA Cuối Terminal transferase)- DNA polymerase không tổng hợp mạch từ khuôn mà thêm nucleotide vào đầu phân tử DNA có sẵn Các DNA polymerase, để hoạt động, phải cần mồi (primer) Mồi đoạn oligonucleotide bắt cặp bổ sung với phần đầu khn, để từ polymerase nối dài tạo cặp bổ sung
Các RNA polymerase tham gia tổng hợp RNA, thông dụng SP6, T7 T3 RNA polymerase
Cả hai nhóm sử dụng cần tạo số lượng lớn nucleic acid (tạo mẫu dò, xác định trình tự nucleotide, )
- Các ligase
Đây enzyme xúc tác hình thành liên kết nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) thường sử dụng lĩnh vực tạo dịng - Các nuclease
Đây nhóm enzyme phân cắt DNA (DNase) RNA (RNase)n cách không chuyên biệt Trong RE đề cập phần nuclease mang tính chuyên biệt trình tự cao
c) Plasmid vector:
Plasmid thực thể vi sinh đơn giản nhất, có cấu trúc DNA khép kín tạo thành vịng trịn, độ dài plasmid thay đổi từ vài nghìn nucleotide đến vài trăm nghìn nucleotide, nằm ngồi hệ gen vi khuẩn hay VSV, có liên hệ chặt chẽ với tế bào vật chủ theo lối cộng sinh, nhân lên với nhân lên NST
(9)sinh Đó nguyên lý chọn lọc dựa khả kháng kháng sinh kỹ thuật tái tổ hợp gen
Để tạo plasmid vừa có khả dẫn truyền (cloning plasmid vector), từ plasmid tổ tiên, trước tiên người ta tiếp tục đưa vào vùng mới, đặc biệt vùng chứa tổ hợp gen thị (chẳng hạn gen thị gen kháng tetracyclin hay tổ hợp gen sản xuất loại protein định), mà thơng thường gen lại có dãy vị trí cắt RE (dãy gọi polylinker hay multiple cutting site-MCS) Đó nơi để thực thao tác cắt, nối, ghép DNA, hay gọi tái tổ hợp DNA Nguyên lý chọn lọc dòng tế bào chủ tiếp nhận plasmid tái tổ hợp dựa nguyên lý kháng kháng sinh hay đặc tính hình thành màu khuẩn lạc khơng có tổng hợp loại protein thị
d) Tế bào chủ thích ứng cho plasmid (host cell)
Trong kỹ thuật tái tổ hợp gen, tế bào chủ phải loại có khả thu nhận plasmid dễ dàng, lưu giữ bền vững tạo điều kiện cho plasmid nhân lên nhiều sản xuất tốt sản phẩm tái tổ hợp
Hiện có nhiều dịng tế bào E coli JM 101, JM 102, JM 109 sử dụng làm tế bào chủ kỹ thuật tái tổ hợp gen (còn gọi tế bào dưỡng-competent cell) Quá trình xâm nhập vào tế bào E coli dưỡng gọi trình biến nạp (transformation)
Nếu sản xuất theo lối công nghệ vi sinh, plasmid vi khuẩn tổng hợp hay nhiều sản phẩm mong muốn
Lai phân tử- Lai pha rắn Nguyên tắc
Hai trình tự bổ sung (thường trình tự đích- trình tự cần tìm) cố định giá thể rắn
2 Các yếu tố kỹ thuật
Giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid màng lai Có hai loại màng lai:
- Màng lai nỉtro-cellulose: loại giá thể sử dụng đầu tiên-hiện khơng cịn thơng dụng hai nhược điểm độ bền học nên thao thác khó khăn, khơng thể tách rời phân tử lai màng lai để lai trở lại với mẫu dò (probe) khác
- Màng lai nylon, có độ bền học cao cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác (cần loại bỏ mẫu dò cũ trước lai với mẫu dò mới) Phương pháp Southern blot
Phương pháp sử dụng để định vị trình tự đặc biệt DNA gen, hay DNA kích thước nhỏ DNA plasmid
(10)- Các đoạn DNA phân tách làm biến tính (biến thành hai mạch đơn ) gel chuyển lên màng lai theo bước sau: Từ bồn chứa, dung dịch đệm hút giấy thấm dày, di chuyển theo lực mao dẫn lên phía Khi qua gel, dung dịch đệm kéo theo acid nucleic chuyển chúng lên màng lai Ngoài kỹ thuật chuyển nhờ lực mao dẫn, người ta sử dụng kỹ thuật chuyển nhờ dòng điện chuyển chân khơng cho hiệu cao địi hỏi số điều kiện kỹ thuật đặc biệt - DNA cố định màng lai đem lai với mẫu dị có đánh dấu phóng xạ Vật nặng đặt giúp nén sát thành phần tham gia vào trình Sau trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ mẫu dị khơng bắt cặp chun biệt với DNA cố định màng
- Cuối cùng, dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) hay sử dụng film nhạy cảm với tia xạ áp sát màng lai để định vị phân tử lai (DNA gen: mẫu dò)
Sanger Dideoxy Sequencing
Sản phẩm kéo dài phát triển hình thành cầu nối phosphodiester nhóm 3´-hydroxyl đầu cuối kéo dài primer nhóm 5´-phosphate deoxynucleotide gắn Sự kéo dài tiến hành theo hướng 5´-3´ Điều đáng lưu ý DNA polymerases gắn chất tương tự với nucleotide bases Phương pháp dideoxy sequencing DNA phát Sanger (1977) lợi dụng khả việc sử dụng ´,3´-dideoxynucleotides chất Khi dideoxynucleotide gắn vào vị trí 3´ tận chuỗi kéo dài, kéo dài chuỗi kết thúc cách chọn lọc A, C, G, hay T chuỗi thiếu nhóm 3´-OH tận chuỗi kéo dài
Fluorescent Sequencing
Các nhãn gắn vào sản phẩm DNA kéo dài cách sử dụng dideoxynucleotide triphosphates dán nhãn thuốc nhuộm đầu 3´ Applied Biosystems DNA sequencers phát hùynh quang từ loại thuốc nhuộm khác mà sử dụng để xác định phản ứng kéo dài A, C, G, and T Mỗi thuốc nhuộm phát sáng bước sóng khác chiếu argon ion laser Vì vậy, tất màu bases phát phân biệt gel đơn hay truyền mao dẫn
2.1 PHỤC HỒI SINH HỌC (BIOREMEDIATION)
(11)này cần hay khơng cần khơng khí Trong số trường hợp, đường đồng hoá mà thể thường sử dụng cho sinh trưởng, phát triển nguồn lượng sử dụng để phân giải phân tử gây ô nhiễm Trong trường hợp mà biết đồng-đồng hố (co-metabolism), vi sinh vật khơng đem lại lợi ích trực tiếp Các nhà nghiên cứu tận dụng tượng sử dụng cho mục đích phục hồi sinh học Một q trình phân huỷ sinh học hoàn toàn đưa đến việc khử độc tố việc khoáng hoá chất gây ô nhiễm thành CO2, nước muối vô vơ hại
Q trình phân huỷ khơng hồn tồn tạo sản phẩm bị phân giải mà (hay khơng thể) độc hại so với chất nhiễm ban đầu Ví dụ, q trình phân huỷ khơng hồn tồn tri- hay tetrachloroethylene tạo vinylchloride mà độc có tính gây ung thư cao so với hợp chất ban đầu
Phân huỷ sinh học xuất cách tự phát mà trường hợp thành ngữ “phục hồi sinh học cố hữu- intrinsic bioremediation” hay “phân giải tự nhiên- natural attenuation” thường sử dụng Tuy nhiên, nhiều trường hợp hồn cảnh tự nhiên khơng đủ thuận lợi cho điều xảy thiếu hụt chất dinh dưỡng, oxygen hay vi khuẩn thích hợp Tình trạng cải thiện cách bổ sung hay nhiều điều kiện tiên Ví dụ, chất thêm vào sử dụng để đẩy nhanh tốc độ phân giải dầu bị tràn 1000 miles đường bờ biển Alaska vào 1989 Xu hướng tương lai phục hồi sinh học nhìn vào tốc độ phân huỷ sinh học khơng hỗ trợ trước tiên thực có hoạt động khơng thích hợp cho việc loại bỏ chất gây nhiễm cách nhanh chóng đủ để ngăn chặn nguy lường trước chất gây ô nhiễm
Các kỹ thuật phục hồi sinh học sử dụng để giảm thiểu hay để loại bỏ chất thải độc hại gây ô nhiễm môi trường Chúng sử dụng để xử lý dòng chất thải trước chúng thải khỏi nhà máy Một số ứng dụng phục hồi sinh học bàn luận sau
2.1.1 Nước thải chất thải công nghiệp:
(12)xuất penicillin Hầu hết hệ thống xử lý nước thải kị khí sản xuất khí sinh học (biogas) có ích
2.1.2 Nước uống:
Một phương diện quan trọng cơng nghệ sinh học tiềm việc phục hồi tinh nước thải cho tái sử dụng Sự quan tâm cộng đồng chất lượng nước uống tăng lên Không nước cần quay vòng phát triển việc sử dụng bền vững nguồn tài nguyên mà chất lượng toàn diện phải cải thiện để thoả mãn người tiêu dùng Trong nhiều vùng nông nghiệp giới, chất thải động vật phân bón dư thừa dẫn đến nồng độ cao nitrate nước uống Công nghệ sinh học cung cấp phương pháp thành cơng mà hợp chất loại bỏ khỏi nước sử dụng trước phân phối đến người tiêu dùng
2.1.3 Khơng khí khí thải:
Ban đầu, hệ thống xử lý khí thải cơng nghiệp dựa phận lọc rẻ tiền chứa đầy phân hữu (compost) mà loại bỏ mùi Các hệ thống tồn Tuy nhiên, tốc độ thực chậm thời hạn sử dụng phận lọc ngắn đưa nghiên cứu tìm phương pháp tốt bioscrubbers mà chất gây ô nhiễm rữa cách sử dụng dịch huyền phù tế bào lọc nhỏ giọt sinh học (biotrickling) mà chất gây ô nhiễm phân huỷ vi sinh vật cố định giá thể cố định cung cấp với lớp mỏng chất dinh dưỡng lỏng mà nhỏ giọt qua thiết bị Sự chọn lựa vi sinh vật mà có hiệu việc đồng hố chất gây nhiễm tạo lọc sinh học làm không khí khí thải tốt Ví dụ bioscrubber dựa hệ thống loại bỏ đồng thời nitrogen sulphur oxides từ khí ống khói lị cao mà phát triển lựa chọn cho q trình nung vơi truyền thống, loại bỏ styrene từ khí thải ngành cơng nghiệp sản xuất polystyrene lọc sinh học chứa nấm
2.1.4 Xử lý đất mặt đất:
(13)dưới trạm xăng dầu trở nên phổ biến, dung môi chứa clo tri- tetrachloroethylene, việc phục hồi sinh học chỗ Khả ứng dụng việc phục hồi sinh học phụ thuộc vào thông số lý học đất, chủ yếu đặc điểm vận chuyển Phục hồi sinh học sử dụng thực vật gọi phytoremediation Kỹ thuật sử dụng để loại bỏ kim loại từ đất nước ngầm bị ô nhiễm tương lai ứng dụng cho việc xử lý chất ô nhiễm khác Việc sử dụng kết hợp thực vật vi khuẩn Các vi khuẩn cộng sinh với rễ thực vật phụ thuộc vào chất tiết rễ Các vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) thế, mà số lượng chúng lớn nhiều so với số lượng vi khuẩn đất khác, biến đổi di truyền để phá vỡ chất ô nhiễm Nghiên cứu tiến hành để kiểm tra giả thuyết
2.1.5 Chất thải rắn (Solid waste): chất thải rắn nội địa vấn đề xã hội tiêu dùng Việc loại bỏ chúng theo dõi thường xuyên liên quan đến ô nhiễm nước ngầm khơng khí Tuy nhiên, chúng bao gồm phần lớn chất hữu dễ phân huỷ sinh học Vì vậy, nguồn phân biệt chất thải sinh học chuyển thành nguồn tài nguyên có giá trị việc ủ phân giải kỵ khí Trong năm gần đây, q trình có bước phát triển đáng ghi nhận thiết kế điều chỉnh trình Cụ thể là, phân giải kị khí chất thải rắn bể phân giải kị khí tốc độ cao đạt chấp nhận ngày tăng cơng chúng cho phép phục hồi số lượng lớn khí sinh học có giá trị cao với cặn bã hữu ổn định có chất lượng cao điều khơng làm tăng khó chịu cho mơi trường Hơn nữa, phân giải kỵ khí chất thải rắn hỗn hợp tập trung phát triển tương lai gần, bước quan trọng vịng tuần hồn chất thải rắn giải pháp chọn lựa cho phân huỷ rác
2.2 NGĂN CHẶN (PREVENTION)
Càng ngày có nhiều nhà máy cơng nghiệp phát triển quy trình với khả tác động đến mơi trường giảm thiểu đáp ứng với lời kêu gọi toàn cầu phát triển xã hội bền vững Có khuynh hướng rộng khắp sản phẩm quy trình gây hại; cách xa việc xử lý “end-of-pipe” dòng thải Cơng nghệ sinh học thích hợp hẳn để đóng góp vào khuynh hướng nhiều trường hợp, việc cải thiện quy trình tồn phát triển quy trình
2.2.1 Cải tiến quy trình:
(14)hiệu cao Các phương pháp sản xuất mà ứng dụng enzymes nói chung khơng an toàn so với phương pháp khác, mà kinh tế lượng tiêu dùng tài nguyên Tuy nhiên, tính đặc hiệu chúng ngụ ý thường khơng dễ dàng tìm thấy enzyme thích hợp cho ứng dụng cần thiết Các enzymes ứng dụng rộng rãi công nghiệp nhiều năm qua Các kỹ thuật hướng tiếp cận liên quan đến thiết kế protein mơ hình phân tử tạo điều kiện cho nhà nghiên cứu phát triển enzyme mong muốn hoạt động nhiệt độ cao, dung môi không lỏng dạng chất rắn
2.2.2 Đổi sản phẩm (Product innovation):
Cơng nghệ sinh học giúp cho việc sản xuất sản phẩm mà tác động đến môi trường tiền nhiệm chúng Việc sản xuất vật liệu sinh học nhựa sinh học tránh việc sử dụng nguồn tài nguyên tái tạo lượng hố thạch Khoai tây bình thường chứa 80% amylopectin chứa khoảng 20% amylose mà không mong muốn nhiều ứng dụng Để phân lập amylopectin tinh khiết, lượng lớn nước lượng tiêu thụ Một công ty Hà Lan phát triển giống khoai tây biến đổi di truyền mà không chứa amylose có quy trình hoạt động với tác động đến mơi trường Việc sử dụng giống thực vật biến đổi gen mà có khả kháng trùng và/hoặc dịch bệnh hạn chế đáng kể việc sử dụng thuốc trừ sâu mà không ngăn chặn việc sử dụng vật liệu thô tái tạo được, lượng nhu cầu lao động cho việc sản xuất chúng, mà làm giảm tác động có hại việc tích luỹ chúng Có nhiều giả pháp cơng nghệ sinh học cho ô nhiễm phát triển Chẳng hạn, lợn gà sử dụng phosphate từ phytate có thức ăn chúng, diện phân chúng Bằng việc thêm enzyme phytase vào thức ăn chúng, lượng phosphate mà thải động vật giảm gần 30 % Ở Nam Phi, vi khuẩn sử dụng để phân lập vàng từ quặng vàng Điều gọi biomining tiết kiệm số lượng lớn lượng gây nóng chảy tạo chất thải nhiều Việc sản xuất hoá chất indigo, thuốc nhuộm mà sử dụng cho quần jean xanh tiến hành qua bước, việc sử dụng hoá chất độc quy định bảo vệ đặc biệt cho người vận hành quy trinh môi trường Việc sản xuất indigo công nghệ sinh học mà sử dụng vi khuẩn biến đổi di truyền chứa enzymes phù hợp, tiến hành bước, proceeds nước, sử dụng vật liệu thô đơn giản đường muối tạo indigo, carbon dioxide sinh khối mà phân giải sinh học
(15)nghiệp nên kèm theo tập huấn bảo vệ thích hợp cho công nhân làm việc với hệ thống này, phận khác công nghệ
2.3 PHÁT HIỆN VÀ GIÁM SÁT (DETECTION AND MONITORING)
2.3.1 Phát giám sát chất ô nhiễm (Detection and monitoring of pollutants):
Một phạm vi rộng phương pháp sinh học rõ ràng sử dụng để phát biến cố ô nhiễm giám sát cách liên tục chất gây ô nhiễm Các thước đo thiết lập từ lâu bao gồm: đếm số lượng loài thực vật, động vật vi sinh vật, đếm số lượng cá nhân lồi hay phân tích nồng độ oxygen, methane hay phức hợp khác nước Gần hơn, phương pháp phát sinh học sử dụng cảm biến sinh học (biosensors) xét nghiệm miễn dịch (immunoassays) phát triển thương mại hoá Hầu hết biosensors kết hợp thiết bị sinh học điện tử-thường hay xây dựng microchip Hợp phần sinh học đơn giản là enzyme hay kháng thể, chí khuẩn lạc vi khuẩn, màng, điểm nhận thần kinh, hay thể toàn vẹn Được cố định chất, đặc tính chúng thay đổi tương ứng với số ảnh hưởng môi trường cách mà phát điện hay quang học Sau số lượng chất gây nhiễm xác định với xác hay nhay cảm cao Các cảm biến thiết kế có chọn lựa kỹ lưỡng, hay nhạy cảm phổ rộng phức chất Ví dụ, phổ rộng chất diệt cỏ phát nước sông cách sử dụng biosensors từ tảo; áp lực tác động lên thể đánh giá dựa vào thay đổi đặc tính quang học chlorophyll thực vật Các biosensors vi sinh vật vi sinh vật mà sinh phản ứng tiếp xúc với chất nhận biết Thông thường chúng phát sáng ngừng lại để thực phản ứng tiếp xúc với chất mà độc chúng Cả hai loại vi sinh vật phát sáng xuất cách tự nhiên vi sinh vật phát triển cách đặc biệt sử dụng Các biosensors vi khuẩn hoạt động cách chắn tạo mà bắt đầu phát sáng tiếp xúc (và sau phản ứng) với chất gây ô nhiễm đặc hiệu Ở Mỹ, vi khuẩn phát sáng chấp nhận cho mục đích phát polyhalogenated aromatic hydrocarbons test thực địa
(16)của chúng đơn giản thay đổi màu sắc, khiến cho chúng đặc biệt thích hợp cho test thực địa có độ nhạy cảm cao, nơi mà thời gian trang thiết bị lớn cần cho việc kiểm tra truyền thống không thực tế Tuy nhiên việc sử dụng chúng bị giới hạn chất gây nhiễm mà phá vỡ kháng thể sinh học Nếu chất ô nhiễm phản ứng mạnh, chúng tàn phá kháng thể kiềm chế hoạt động kiềm chế hiệu việc kiểm tra
2.3.3 Phát giám sát vi sinh vật sử dụng cho phục hồi sinh học: Khi vi sinh vật ni cấy phịng thí nghiệm gây cấy vào vị trí phục hồi sinh học (bioaugmentation), thường cần giám sát diện chúng và/hoặc tăng số lượng để kiểm tra tiến trình trình Điều đặc biệt chí yêu cầu liên quan đến vi sinh vật biến đổi di truyền Các kỹ thuật truyền thống nhằm phát diện vi sinh vật đất đặt trực tiếp đĩa chứa môi trường đặc hiệu (selective media) Điều thuận lợi lớn thể chứa dấu hiệu (marker) mà tuyển chọn Các kỹ thuật bao gồm kỹ thuật thiết bị cảm biến sinh học dựa vào miễn dịch ánh sáng đề cấp Sự phân bố mặt không gian vi sinh vật đặc biệt mẫu vật xác định kính hiển vi non-invasively việc sử dụng fluorescent in situ hybridisation (FISH) vi sinh vật Kỹ thuật nhạy cảm đặc hiệu phân lập trực tiếp khuếch đại DNA từ đất, mà ngày sử dụng rộng rãi
2.3.4 Phát giám sát ảnh hưởng sinh thái học:
(17)2.4 KỸ THUẬT DI TRUYỀN (GENETIC ENGINEERING)
(18) Biotechnology