VI SINH vật lên MEN và ỨNG DỤNG đã chuyển đổi

CHUYÊN ĐỀ: VI SINH VẬT LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG MỤC LỤC MỤC LỤC PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN II: NỘI DUNG .4 I Khái niệm lên men: .4 1.1 Lên men gì? 1.2 Phân loại sản phẩm lên men: 1.3 Các kiểu lên men: II Các vi sinh vật tham gia trình lên men: 2.1 Nấm men: .8 2.2 Nấm sợi: .8 2.3 Nấm thể: 2.4 Vi khuẩn: 2.5 Xạ khuẩn: .9 2.6 Vi khuẩn lam III Một số phương pháp kỹ thuật lên men vi sinh vật: .9 3.1 Quá trình lên men: .9 3.1.1 Chọn giống vi sinh vật: .10 3.1.2 Chuẩn bị nguyên liệu cấy: 11 3.1.3 Nhân giống: 11 3.1.4 Lên men: 12 3.1.4.1 Nuôi không liên tục: 12 3.1.4.2 Nuôi cấy liên tục: 13 3.1.5 Thu nhận sản phẩm xử lí sau thu hoạch: 14 3.2 Cơ chất lên men: 14 3.2.1 Nguồn carbon lượng: .15 3.2.2 Nguồn Nitơ: 17 3.2.3 Nguồn phospho chất khoáng khác: 18 3.2.4 Vitamin yếu tố sinh trưởng khác: .18 IV Các trình lên men ứng dụng: 19 4.1 Lên men ethylic: 19 4.1.1 Khái niệm: 19 4.1.2 Cơ chế hóa học trình lên men rượu: .20 4.1.3 Ứng dụng trình lên men ethylic: 22 4.1.3.1 Sản xuất rượu ethanol: 22 4.1.3.2 Sản xuất bia: 29 4.1.3.3 Sản xuất rượu vang: 34 4.2 Lên men lactic: 36 4.2.1 Khái niệm lên men lactic: 36 4.2.2 Cơ chế trình lên men lactic: 37 4.2.2.1 Lên men lactic đồng hình: 37 4.2.2.2 Lên men lactic dị hình: 37 4.2.3 Ứng dụng lên men lactic: 39 4.2.3.1 Sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, củ, ủ thức ăn gia súc: 39 4.2.3.2 Lên men sữa chua: 40 4.2.3.3 Công nghệ sản xuất phomat: 41 PHẦN III: MỘT SỐ CÂU HỎI VẬN DỤNG 43 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .48 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật sinh vật nhỏ bé đặc trưng phổ khả trao đổi chất rộng Một số hoạt động bao gồm tổng hợp, chuyển hóa, phân hủy chất người sử dụng để sản xuất thực phẩm, đồ uống sản phẩm khác ứng dụng bảo vệ môi trường Ngay từ buổi đầu văn minh nhân loại, chưa nhận thức tồn vi sinh vật nhiều tác dụng vi sinh vật ứng dụng sản xuất đời sống Nhiều tài liệu khảo cổ cho thấy cách 6000 năm, người dân Ai Cập có tập quán nấu rượu, Trung Quốc rượu sản xuất từ thời đại văn hóa Long Sơn (cách 4000 năm) Việc muối dưa thực từ năm 3500 trước Cơng ngun Cùng với sản phẩm lên men khác rượu vang ủ từ nho loại trái khác, dấm, tương… Cùng với phát triển khoa học nói chung ngành Vi sinh vật học nói riêng, người phát chất trình lên men ứng dụng vào nhiều lĩnh vực đời sống sản xuất sản xuất cồn nhiên liệu, sản xuất acid hữu cơ… Chính tầm quan trọng ứng dụng thực tiễn mà chọn đề tài “Vi sinh vật lên men ứng dụng” Trong phạm vi chuyên đề này, xin sâu vào trình lên men vi sinh vật ứng dụng trình lên men PHẦN II: NỘI DUNG I Khái niệm lên men: 1.1 Lên men gì? Sự lên men hiểu theo nghĩa rộng trình trao đổi chất, qua chất hữu mà trước tiên đường bị biến đổi tác dụng enzyme vi sinh vật Lên men trình oxi hóa - khử sinh học giải phóng lượng hợp chất trung gian để cung cấp chovi sinh vật thực hoạt động sống sinh trưởng, sinh sản phát triển Trong q trình đó, lượng giải phóng phần cách sử dụng phân tử chất hữu làm chất nhận electron cuối thay chuỗi vận chuyển electron Hay nói cách khác, lên men phản ứng trao đổi chất oxi hóa NADH2 thành NAD+ khử phân tử hữu chất nhận electron cuối Tùy thuộc vào chất tiếp nhận H+ cuối mà phân biệt hô hấp lên men hô hấp yếm khí Tuy lên men hơ hấp yếm khí xảy điều kiện khơng có oxi khác với lên men, hơ hấp yếm khí H+ giải phóng chuyển qua chuỗi vận chuyển điện tử để đến chất nhận cuối nitrat sulfat Lên men trình thu lượng, qua H+ tách khỏi chất chuyển đến chất nhận cuối chất hữu Hợp chất hữu khử vào môi trường dinh dưỡng tích tụ lại Phụ thuộc vào sản phẩm tích tụ chiếm ưu sản phẩm đặc trưng mà người ta phân chia thành kiểu: lên men rượu, lên men lactic, lên men butyric… 1.2 Phân loại sản phẩm lên men: Các chất sản xuất đường lên men nhờ vi sinh vật đa dạng, dựa vào tiêu chuẩn sinh lý trao đổi chất vi sinh vật, phân loại cách đơn giản sau: - Sinh khối tế bào: Đó trường hợp nấm men dùng cho mục đích dinh dưỡng làm nở bột mỳ, trường hợp nấm ăn dùng làm thức ăn Các vi khuẩn vi tảo nuôi cho mục đích dinh dưỡng, song chưa có ý nghĩa lớn mặt thương mại Ở cần phân biệt hai trường hợp: Thuật ngữ ''protein đơn bào'' (SCP) thường dùng để tế bào vi sinh vật sản phẩm công nghiệp với lý hàm lượng protein chúng cao quan tâm mặt thương mại Còn ''giống khởi động'' (starter culture) sản phẩm công nghiệp thân tế bào vi sinh vật dùng làm nguyên liệu cấy Chẳng hạn giống vi khuẩn lactic bán dạng nguyên liệu cấy (inoculants) để sản xuất sản phẩm sữa lên men xúc xích - Các sản phẩm trao đổi chất: Gồm loại sản phẩm sau: + Các sản phẩm cuối trao đổi lượng: sản phẩm trình lên men ethanol, acid lactic, acid acetic, methane, acid propionic… + Các chất trao đổi bậc 1: chất có vai trò viên gạch cấu trúc nên vật chất tế bào, có trọng lượng phân tử thấp cao phân tử sinh học Có thể kể đến như: amino acid, nucleotide, đường, acid béo, vitamin… Ngoài cịn bao gồm sản phẩm q trình trao đổi chất trung gian acid hữu chu trình TCA (tricarboxylic acid) + Các chất trao đổi bậc 2: chất trao đổi có trọng lượng phân tử thấp, không diện tất thể sinh vật Những chất thường khơng có chức chung trao đổi chất tế bào, tế bào tồn mà khơng cần đến chúng, nhiên, chúng lại đóng vai trị quan trọng viêc trì lồi điều kiện sinh thái định Ví dụ: chất kháng sinh, độc tố, gibberellin, alkaloid… + Các loại enzyme: protein xúc tác cho biến đổi chất tế bào Một tế bào vi sinh vật chứa khoảng 1000 loại enzyme với số phân tử lên đến 106, gồm enzyme nội bào (chiếm đa số) enzyme ngoại bào Ví dụ: amylase, protease, cellulase… - Các sản phẩm chuyển hoá: bao gồm steroid sản phẩm oxi hố khơng hồn tồn tạo thành acid acetic socbose 1.3 Các kiểu lên men: Dựa sản phẩm tạo thành, chia thành kiểu lên men lên men rượu, lên men lactic, lên men propionic, lên men acid hỗn hợp, lên men butiric lên men homoacetic… Có nhiều trình lên men phân loại dựa chất lên men thay sản phẩm Chẳng hạn, nhiều vi khuẩn kỵ khí tạo thành bào tử (chi Clostridium) lên men amino acidvới sản sinh acetate, amoniac H2 Các loài Clostridium khác, C acidiurici C purinolyticum lên men purine xanthine adenine với tạo thành acetate, format, CO2, amoniac Cịn vi sinh vật kỵ khí khác lên men hợp chất thơm Chẳng hạn, vi khuẩn Pelobacter acidigallici lên men hợp chất thơm phloroglucinol (1,3,5-benzenetriol, C6H6O3) theo đường sau: Phloroglucinol (C6H6O3) +3H2O → 3acetate + 3H+ Phản ứng tổng quát Kiểu lên men Nấm men Lên men ethylic Hexose→ ethanol + 2CO2 Lên men lactic đồng hình Lên men lactic dị hình Lên men propionic Vi sinh vật thực Zymomonas Streptococcus Hexose → lactate + 2H+ Một số Lactobacillus Hexose → lactate + ethanol + CO2 + H+ Lactate → propionate + acetate + CO2 Leuconostoc Một số Lactobacillus Propionibacterium Clostridium propionicum Các vi khuẩn đường ruột: Lên men acid hỗn hợp Hexose → ethanol + 2,3- butandiol + succinate + lactate + acetate + format + H2 + CO2 Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter Lên men butiric Hexose → butirate + acetate + H2 + CO2 Lên men Hexose → butanol + acetate + acetol + ethanol butanol + H2 + CO2 Lên men caproat Lên men homoacetic Lên men sinh methane Clostridium butyricum Clostridium acetobutylicum Ethanol + acetate + CO2→ caproat + butirate + H2 Fructose → acetate + 3H+ + H2 + CO2 → acetate + H2O Clostridium kluyveri Clostridium aceticum Acetobacterium Acetate + H2O → CH4 + HCO3- Methanothrix Methanosarcina Bảng 1: Các kiểu lên men Nhiều q trình lên men khơng thơng thường thực nhóm hạn chế vi khuẩn kị khí, số trường hợp vi khuẩn Một số ví dụ nêu bảng Nhiều số vi khuẩn xem chun gia trao đổi chất chúng có khả phân giải nhiều chất mà vi khuẩn khác không phân giải Phản ứng tổng quát Kiểu lên men Acetylen Glycerin Resocxinol C2H2 + H2O → ethanol + acetate + H+ Glycerin + HCO3-→ acetate + H+ + H2 O C6H4(OH)2 + H2O → acetate + butirate + (hợp chất thơm) H+ Xinamat C9H7O2 + H2O → C9H9O2 + benseat + acetate (hợp chất thơm) + H+ Phlorogluxinol (hợp chất thơm) Putresxin Citrate Aconitrate Glyoxylate Succinate Oxalate Malonate C6H6O3 + H2O → acetate + H+ 10 C4H12N2 + 26 H2O → acetate + butirate + 20 NH4+ + 16 H2 + 13 H+ Vi sinh vật thực Pelobacter acetylenicus Acetobacterium spp Clostridium spp Acetovibrio multivorans Pelobacter masiliensis Pelobacter acidigallici Các vi khuẩn kỵ khí gram dương không sinh bào tử chưa phân loại Citrate + H2O → format + acetate + HCO3- + H+ Aconitrate + H+ + H2O → CO2 + acetate + Bacteroides sp Acidaminococcus H2 fermentans glyoxylate + H+ + H2O → CO2 + H2 + Vi khuẩn gram âm chưa Glycolate phân loại Succinate + H2O → Propionat + HCO3Oxalate + H2O → format + HCO3Malonate + H2O → acetate + HCO3- Propionigenium modestum Oxalobacter formigenes Malonomonas rubra Sporomusa malonica Bảng 2: Một số q trình lên men khơng thơng thường II Các vi sinh vật tham gia trình lên men: 2.1 Nấm men: Nấm men (Yeast, Levure) thường tồn dạng đơn bào, đa số sinh sản theo lối nảy chồi, có theo hình thức phân cắt tế bào, nhiều loại có khả lên men đường thích nghi với mơi trường chứa đường cao, có tính acid cao Nấm men phân bố rộng rãi tự nhiên, mơi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn hoa quả, rau dưa, rỉ đường, đất trồng loại ăn quả, đất có nhiễm dầu mỏ Nhiều loại nấm men sử dụng rộng rãi là: Saccharomyces cerevisiae (làm men nở bánh mỳ, làm đồ uống vang, rượu, bia…, thu sinh khối protein), Candida Utilis (thu sinh khối dùng làm thức ăn cho chăn nuôi) 2.2 Nấm sợi: Nấm sợi (Microfilamentous fungi) tất nấm nấm men khơng sinh mũ nấm Nấm sợi cịn gọi nấm mốc, có dạng sợi phân nhánh, khơng có vách ngăn, lối sống hiếu khí, chủ yếu hoại sinh Nấm sợi phân bố rộng rãi tự nhiên, tham gia tích cực vào vịng tuần hồn vật chất, trình phân giải chất hữu hình thành chất mùn Rất nhiều lồi nấm sử dụng rộng rãi công nghiệp lên men như: Eremothecium asbyii (thu Riboflavin có tính chất vitamin), Blakeslea trispora (thu làm chất tạo màu thực phẩm)… 2.3 Nấm thể: Nấm thể mang lại nhiều giá trị cho người, đặc biệt, số nấm thể tạo chất trao đổi bậc trình lên men cung cấp cho cơng nghiệp dược phẩm Có thể kể đến chất ecgotamin ecgotoxin tạo trình lên men Claviceps purpurea dùng sản khoa điều trị bệnh mạch máu hay bệnh đau nửa đầu 2.4 Vi khuẩn: Vi khuẩn (Bacteria) có nhiều hình thái cách xếp khác nhau, kích thước nhỏ so với nấm sợi nấm men Phần lớn vi khuẩn thuộc nhóm dị dưỡng, đời sống hiếu khí, kị khí dạng sống tuỳ nghi Nhiều vi khuẩn có ứng dụng sản xuất Methanomonas methanica (sản xuất sinh khối dùng sản xuất thức ăn chăn nuôi), Acetobacter suboxydans (vi khuẩn lên men acetic dùng chế biến thực phẩm đồ uống), nhóm vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sử dụng nhiều chế biến thực phẩm, Corynebacterium glutamicium (vi khuẩn tham gia chủ yếu quy trình sản xuất mỳ chính)… 2.5 Xạ khuẩn: Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Phần lớn xạ khuẩn hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ti) Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật đóng vai trị quan trọng tự nhiên Chúng tham gia vào q trình chuyển hóa nhiều hợp chất tự nhiên Trên 80% chất kháng sinh phát xạ khuẩn sinh (ví dụ dịng xạ khuẩn thuộc chi Penicillium, Streptomyces) Xạ khuẩn dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, vitamin, acid hữu (như Actinomyces) 2.6 Vi khuẩn lam Trước vi khuẩn lam (Cyanobacteria) gọi tảo lam (Cyanophyta) hay tảo lam lục Thực nhóm vi sinh vật nhân nguyên thủy thuộc vi khuẩn thật Vi khuẩn lam có khả tự dưỡng quang nhờ có chứa sắc tố quang hợp Vi khuẩn lam phân bố rộng rãi tự nhiên, nhiều lồi có ý nghĩa sản xuất sinh khối giàu protein, cố định đạm hay sử dụng cơng nghiệp xử lí nước thải III Một số phương pháp kỹ thuật lên men vi sinh vật: 3.1 Quá trình lên men: Lên men trình phức tạp bao gồm nhiều giai đoạn, tóm tắt giai đoạn q trình lên men sơ đồ sau: nguyên tốt cần có tỷ lệ thích hợp thơ, mịn bột, tỷ lệ phụ thuộc vào thiết bị lọc dịch đường hoá +Nấu nguyên liệu (Đường hố ngun liệu): Mục đích q trình nấu bia chuyển chất malt nguyên liệu thay từ trạng thái khơng hồ tan sang trạng thái hoà tan nhờ tác động hệ enzyme thuỷ phân Đểtăng hiệu suất nấu người ta áp dụng nhiều phương pháp đường hoá khác Tuy nhiên, tất phương pháp theo nguyên tắc chung điều khiển nhiệt độ thích hợp cho enzyme thuỷ phân, chủ yếu hệ amylase protease hoạt động Nhiệt độ thích hợp để α-amylase hoạt động khoảng 70 - 75oC, β-amylase 63 – 65oC, protease 50-60oC +Đun sôi dịch đường với hoa Houblon (quá trình Houblon hố): Mục đích q trình houblon hố để ổn định thành phần dịch đường, truyền cho bia mùi vị hoa Houblon, keo tụ protein, vô hoạt enzyme trùng dịch đường Trong q trình phải đảm bảo khơng để nhiệt độ dịch đường hạ xuống 70oC để tránh oxy khơng khí tiếp xúc với dịch đường xảy phản ứng oxy hoá làm giảm chất lượng bia Hoa Houblon dùng để nấu bia dùng loại hoa nguyên, hoa ép cao hoa phải cho hoa chia làm nhiều đợt nhằm tăng mùi thơm cho bia.Lượng hoa sử dụng để nấu bia phụ thuộc vào dạng loại bia, vào lượng acid đắng có hoa mà dao động 1-4g/l bia - Lên men bia: Trong trình lên men bia, lượng lớn chất, chủ yếu đường dextrin bậc thấp bị nấm men hấp thụ để tạo thành rượu etylic, khí carbonic sản phẩm phụ Quá trình lên men chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố như: chất lượng nấm men, lượng nấm men gieo cấy ban đầu, nồng độ chất hoà tan dịch đường Houblon hoá, nhiệt độ dịch lên men, áp suất bề mặt, hàm lượng oxy, cường độ khuấy đảo dịch lên men nồng độ sản phẩm lên men + Chất lượng nấm men: Trong sản xuất bia thường dùng nịi men chìm thuộc giống Saccharomyces carlbergensis có dùng loại men thuộc giống Saccharomyces cerevisiae Men chìm thường lên men nhiệt độ 6-10oC, cịn men 14-25oC Khi chọn men bia cần dựa vào tiêu như: Tốc độ mức độ lên men,hàm lượng sản phẩm bậc hai tạo thành,tốc độ khả kết lắng,mức độ thoái hoá,khả chống chịu điều kiện 31 ngoại cảnh Một số chủng nấm men phù hợp có chất lượng tốt tái sử dụng đến đời thứ bảy, thử tám + Lượng nấm men gieo cấy ban đầu liên quan mật thiết đến q trình lên men Nói chung, lượng nấm men gieo cấy ban đầu q thời gian lên men kéo dài Mật độ nấm men gieo cấy ban đầu lớn chất lượng bia nâng cao lượng sản phẩm bậc hai giảm Tuy nhiên, mật độ tối đa lượng nấm men gieo cấy ban đầu vượt qua ngưỡng 70.106 tế bào/cm3 hiệu mang lại khơng rõ nét + Nồng độ chất hồ tan dịch đường Houblon hoá 11-12% làm cho trình lên men tốt so với loại dịch đường có nồng độ cao thấp + Nhiệt độ dịch lên men môi trường xung quanh có ảnh hưởng mạnh đến tiến q trình lên men Nếu nhiệt độ cao thời gian lên men nhanh, mật độ tối đa đạt cao so với nhiệt độ thấp, lên men triệt để hơn; nhiên sản phẩm bậc hai (đặc biệt diacetyl) tạo nhiều hơn, lượng tế bào chết nhiều tốc độ suy thoái nhanh nên chất lượng bia giảm + Áp suất bề mặt dịch lên men xác định mức độ bão hoà CO2, hợp chất gây ức chế trình lên men, ảnh hưởng đến lượng sinh khối tạo thành, trạng thái sinh lý cảu nấm men, ảnh hưởng trực tiếp đến trình lên men Trong thực tế sản xuất, người ta thường khống chế để áp suất không tăng kg/cm2 + Lượng oxy dịch lên men cần thiết cho trình phát triển sinh khối giai đoạn đầu trinh lên men đồng thời yếu tố tác động mạnh đến tốc độ suy thối nấm men Chính vậy, lượng oxy hồ tan dịch đường Houblon hố nên khống chế nồng độ 6,7-7mg/l + Cường độ khuấy đảo dịch lên men yếu tố thúc đẩy q trình lên men, nhiên làm cho bia chứa nhiều sản phẩm bậc hai cần phải chọn phương án chế độ khuấy dịch lên men thích hợp Hiện nay, thùng lên men người ta trang bị nhiều áo lạnh có nhiệt độ khác đối lưu dịch lên men thực nhờ vào chênh lệch nhiệt độ vùng 32 + Nồng độ sản phẩm lên men: Sản phẩm q trình lên men rượu etylic khí carbonic Khi hợp chất tích tụ đến nồng độ định dịch lên men hoạt động sống nấm men bị ức chế Nếu nồng độ cồn lên đến 12% trình lên men bị đình hồn tồn Lên men bia thực theo hai giai đoạn: giai đoạn lên men giai đoạn lên men phụ (tàng trữ) Hiện nay, có hai phương pháp lên men sử dụng phổ biến nhà máy lên theo phương pháp cổ điển lên men theo phương pháp đại Đối với lên men theo phương pháp cổ điển q trình lên men q trình lên men phụlà hai giai đoạn tách biệt nhau, diễn hai loại thiết bị khác nhau, xếp mặt khác gọi công nghệ lên men hai pha.Theo phương pháp này, trình lên men tiến hành thùng lên men kín hở nhiệt độ 8oC lớn hơn, thời gian kéo dài 6-10 ngày Ở giai đoạn này, nấm men lên men mạnh, dịch sủi bọt nhiều Cuối giai đoạn này, lên men giảm xuống, phần lớn nấm men lắng xuống đáy thùng Ta có sản phẩm bia non bao gồm rượu etylic, CO2, sản phẩm phụ cịn đường (khoảng 1,5-2,5%) Bia non tiếp tục bơm vào thùng lên men phụ tàng trữ Nhiệt độ lên men phụ giữ 1-4oC Giai đoạn này, nấm men lên men phần đường lại để bổ sung CO2 cho bia, đồng thời hoàn thiện chất lượng bia trình lắng cặn nấm men kết tủa tạo thành làm cho bia đồng thời xảy phản ứng oxy hoá khử chất có bia làm tăng hàm lượng este, rượu bậc cao giảm hàm lượng diacetyl Sự tự phân nấm men sinh peptit, acid amin, vitamin giai đoạn góp phần tăng chất lượng bia Sản xuất bia theo cơng nghệ cổ điển có ưu điểm sản phẩm có chất lượng cao, nhược điểm lớn chu kỳ lên men dài Sản xuất bia theo công nghệ đại rút ngắn 50-70% chu kỳ lên men mà chất lượng bia tiệm cận với phương pháp cổ điển Ở công nghệ lên men đại, hai giai đoạn lên men lên men phụ thực thiết bị nên gọi lên men pha Thiết bị lên men theo công nghệ tank thân trụ-đáy côn có kích thước lớn Thể tích chúng dao động từ 100-1500m3; chế tạo thép không gỉ với góc đáy 70o Trên thân thiết bị trang bị 3-5 áo lạnh có chất làm lạnh với nhiệt độ -6oC, thường chất làm lạnh glycol Các áo lạnh vừa có tác dụng điều hồ nhiệt độ trình 33 lên men đồng thời cịn có tác dụng giúp cho dịch lên men thiết bị đối lưu chênh lệch nhiệt độ vùng khác tạo thay đổi nhiệt độ áo lạnh - Hoàn thiện sản phẩm: Bia thành phẩm thu sau trình lên men tank lên men lọc, chiết chai, trùng, dán nhãn để hoàn thiện sản phẩm Lọc bia thường thực thiết bị lọc khung có diatomit chất trợ lọc Q trình chiết chai thường thực qua hệ thống máy chiết thực nhiều giai đoạn hút chân không, thổi CO2, cân áp suất, chiết bia, phun nước nóng để đuổi O2 cịn lại đóng nắp Bia chai từ máy chiết trùng hệ thống tunen có vịi phun nước phía theo khoảng nhiệt độ tăng dần sau giảm dần nhằm hạn chế phát triển vi khuẩn trình bảo quản bia 4.1.3.3 Sản xuất rượu vang: Rượu vang loại đồ uống có cồn thu nhờ trình lên men dịch không qua chưng cất Trong rượu vang chứa đầy đủ chất dinh dưỡng có sẵn từ lượng cồn vừa phải chất thơm, acid hữu cơ, chất khoáng vitamin Trước đây, rượu vang thường chế biến từ nho, vậy, rượu vang gọi rượu nho Hiện nay, giới có tới hàng trăm loại rượu vang khác nhau, loại đặc trưng phương thức sản xuất riêng tuỳ vào đặc điểm rượu tính chất cơng nghệ Quy trình chế biến rượu vang theo sơ đồ chung hình 11 Quả hái rửa ép lấy nước nghiền nhỏ cho vào thùng để chuẩn bị dịch lên men Cũng có trường hợp người ta khơng ép nghiền mà cho vào ngâm với đường theo tỷ lệ khối lượng 1:1 để trích ly thành dạng siro bảo quản để lên men dần sau Chuẩn bị dịch lên men: loại thường có độ acid cao độ đường thấp so với nước nho Trước cho lên men cần điều chỉnh pH khoảng 3,2 – 3,8 bổ sung thêm đường Trường hợp dịch siro (dịch ngâm đường) pha gấp lần để dịch lên men có khoảng 16-18% đường Có thể q trình lên men cịn bổ sung thêm đường Lên men: Trường hợp lên men tự nhiên, người ta khối dịch tự lên men với nịi nấm men có sẵn vỏ từ đồng ruộng mang bổ sung dịch lên men mẻ trước Trong lên men công nghiệp, trước cấy chuyền nấm men vào dịch để lên men, 34 người ta tiến hành nhân giống chủng khiết phịng thí nghiệm nhân giống trung gian phân xưởng Nấm men sau nhân giống cấy vào dịch lên men với tỷ lệ 6-10% thể tích để thực lên men Nhiệt độ lên men vào khoảng 22-28oC (tuỳ thuộc vào loại rượu vang), thời gian lên men dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiệt độ lên men thường kéo dài 7-20 ngày Dịch lên men đạt 8-10% cồn Lên men phụ 15-18oC 15-20 ngày Sau lên men phụ, độ cồn 14o phải thêm cồn nồng độ cao chuyển sang tàng trữ nhiệt độ thấp 10oC Tàng trữ 10 ngày, sau tách cặn hồn thành sản phẩm tàng trữ tiếp tục Hình 11: Sơ đồ cơng nghệ sản xuất rượu vang Trong thực tế có hai cách chế biến rượu vang phổ biến cách chế biến rượu vang trắng cách chế biến rượu vang đỏ Rượu vang đỏ có thực lên men nước 35 nho lẫn với xác Trong vỏ có chứa nhiều chất màu, tanin, chất thơm Những chất phân huỷ trình lên men làm tăng lượng chất hoà tan tạo hương thơm, màu sắc đẹp cho rượu Lên men xác thường tiến hành nhiệt độ cao nhằm trích ly triệt để chất màu, chất thơm tanin Khi kết thúc lên men cần tách xác khỏi rượu Trong sản xuất lớn, trước hết người ta cho rượu chảy qua lưới để giữ xác lại Rượu thu lúc có chất lượng cao gọi rượu vang giọt, vang chảy Khi rượu ngừng chảy, xác lưới ép máy ép để thu rượu vang ép Rượu vang ép chiếm tỷ lệ khoảng 15% tổng số rượu chế đem trộn với rượu vang chảy Rượu vang đỏ có hàm lượng tanin nhiều rượu vang trắng nên có vị chát Do đó, sau lên men rượu cần tiến hành lên men malolactic nhằm chuyển hoá acid malic thành acid lactic tạo cho rượu có vị chua dịu cân vị chát tanin Có thể sử dụng vi khuẩn lactic lượng nhỏ nấm men Schizosaccharomyces để có khả lên men malolactic triệt để Rượu vang trắng lên men từ tách bã nên khơng có màu Hương vị rượu vang trắng chủ yếu nước Rượu vang trắng thường lên men nhiệt độ thấp rượu vang đỏ (khoảng 15 – 20oC) để giữ hương vị cho rượu Thời gian lên men 6-7 ngày lâu tuỳ theo nhiệt độ yêu cầu cơng nghệ Kết thúc q trình lên men nhận thấy rượu khơng cịn sủi bọt lên nữa, cặn xác men lắng xuống đáy thùng Khi tiến hành gạn cặn, rượu trẻ chuyển sang thùng mới, tiếp tục lắng đưa tàng trữ 4.2 Lên men lactic: 4.2.1 Khái niệm lên men lactic: Lên men lactic q trình chuyển hóa sinh học kỵ khí chứa hợp chất đường thành acid lactic số sản phẩm khác Con người từ lâu sử dụng vi sinh vật lên men lactic để bảo quản chế biến loại thức ăn, đặc biệt thức ăn có nguồn gốc từ sữa Năm 1857, L Pasteur chứng minh sữa chua kết hoạt động nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi vi sinh vật lên men lactic Những vi khuẩn lên men lactic đa dạng,có thể thuộc nhóm Streptococcus, Leuconostoc, Pedicoccus, Lactobacillus, Bifidobacterium… Tuy nhiên, tất chúng có đặc điểm chung là: 36 - Đó vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, catalase âm, oxidase âm, nitratoreductase âm - Khả sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sống vi khuẩn yếu nên chúng vi sinh vật đa khuyết dưỡng nhiều acid amin, bazơ nitơ, vitamin… khơng có khả tổng hợp nhân hem porphyrine, bình thường chúng khơng có cytochrome - Chúng vi sinh vật kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn hiếu khí, loại thể vừa có khả lên men hiếu khí kỵ khí 4.2.2 Cơ chế q trình lên men lactic: Có kiểu lên men lactic vi sinh vật là: lên men lactic đồng hình lên men latic dị hình 4.2.2.1 Lên men lactic đồng hình: Lên men lactic đồng hình trình lên men sản phẩm acid lactic tạo chiếm đa số (trên 90%) Trong trình lên men lactic đồng hình, glucose chuyển hóa theo chu trình Embden-Mayerhoff tạo thành acid pyruvic Vì vi khuẩn lên men lactic đồng hình khơng có enzyme carboxylase nên acid pyruvic khơng phân hủy mà tiếp tục khử thành acid lactic Phương trình tổng qt tóm tắt sau: glucose + 2ADP + 2Pi → lactate + 2ATP 4.2.2.2 Lên men lactic dị hình: Lên men lactic dị hình q trình lên men ngồi sản phẩm acid lactic (40%) cịn tạo lượng đáng kể sản phẩm phụ acid acetic (10%), ethanol (10%), acid succinic (20%), CO2… đơi khơng có khí mà thay vào tích lũy lượng acid formic Về bản, vi khuẩn lên men lactic dị hình khơng có enzyme sơ đồ Embden-Mayerhoff aldolase triozophosphatizomerase bước đầu phân giải đường glucose nên chúng theo đường Pentose phosphate để tạo thành phân tử: 3-phospho glyceraldehyde phospho acetyl Hợp chất trisophosphate qua số phản ứng lên men đồng hình để chuyển thành acid lactic, cịn phospho acetyl chuyển thành ethanol 37 chuyển thành acid acetic Do đó, lên men lactic dị hình ngồi acid lactic cịn có thêm sản phẩm phụ khác Lên men lactic dị hình trình lên men kỵ khí phức tạp gây nhiều giống vi khuẩn như: Leuconostoc, Lactobacillus, Bifidobacterium, Escherichia, Clostridium… Phương trình tổng quát trình lên men lactic dị hình tóm tắt sau: glucose + H2O + ADP + Pi → lactate + ethanol + CO2 + H2 + acetat + acid succinic + diacetyl + acetaldehyde Hình 12: Sơ đồ trình lên men lactic đồng hình lên men lactic dị hình 38 4.2.3 Ứng dụng lên men lactic: 4.2.3.1 Sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, củ, ủ thức ăn gia súc: Việc sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, củ hình thức bảo quản thực phẩm cơng nghệ lên men vi sinh Phương pháp giúp tạo lượng sinh khối vi khuẩn có ích để át lại vi sinh vật gây thối, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm, chuyển rau củ dạng “chín sinh học” nhằm tăng hiệu suất tiêu hóa Q trình chuyển hóa sinh học muối rau củ gồm giai đoạn: - Giai đoạn 1: Muối NaCl với nồng độ muối dưa 2,5-3% tạo môi trường ưu trương làm chất từ tế bào rau củ khuếch tán phần mơi trường, mơi trường để vi khuẩn lactic loại vi sinh vật khác phát triển - Giai đoạn 2: Vi khuẩn lactic phát triển mạnh làm pH môi trường giảm xuống 3-3,5 làm ức chế vi khuẩn khác, đặc biệt vi khuẩn gây thối, đồng thời phát triển ưu vi khuẩn lactic tạo lượng acid lactic lớn giúp rau củ trở nên chua, ngon Trong giai đoạn này, bị rửa rau không hay rau củ bị dập nát gây lẫn tạp khuẩn môi trường, nồng độ muối cao (lớn 5-6%) làm ức chế phát triển vi khuẩn có vi khuẩn lactic, nồng độ muối thấp (nhỏ 3%) tạo điều kiện cho tạp khuẩn lấn át Hơn nữa, trình lên men lactic trình lên men kỵ khí nên khơng đậy nén kỹ khơng tạo điều kiện cho lên men lactic thực hiện, thay vào lên men hiếu khí vi sinh vật khác Những bất lợi gây tượng dưa khú - Giai đoạn 3: Khi rau chua, lượng acid lactic tăng cao làm độ pH môi trường giảm xuống, pH giảm đến vi khuẩn lactic bị ức chế, tạo điều kiện cho nấm men dại, nấm mốc vi sinh vật khác phát triển, phân giải acid lactic thành CO2, H2O làm môi trường giảm chua tạo váng bề mặt Sản phẩm rau củ muối chua khơng có vi khuẩn gây bệnh, có kháng sinh nisine, diplococcine nên có ích cho tiêu hóa điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột Tương tự trình muối rau củ, loại cỏ dùng chăn nuôi ủ chua để giữ chất lượng dinh dưỡng, phân giải số polysaccharide protein thành đoạn ngắn hơn, đồng thời bổ sung nhiều loại vitamin vi khuẩn tổng hợp nên 39 4.2.3.2 Lên men sữa chua: Sữa chua kết trình hoạt động vi sinh vật làm thay đổi thành phần có sữa mà đặc trưng trình lên men tạo thành acid lactic từ đường lactose Trong số sản phẩm đặc biệt cịn có tạo thành ethanol Vi sinh vật sử dụng sản xuất sữa chua vi khuẩn lactic với hai loài đặc trưng: Lactobacillus bulgaricus (là vi khuẩn lên men điển hình, phát triển tốt nhiệt độ 45-50oC mơi trường có độ acid cao) Streptococcus thermophilus (phát triển tốt nhiệt độ 50oC sinh sản tốt nhiệt độ 37-40oC) Hai loài vi khuẩn thuộc loại vi khuẩn hiếu khí chịu mơi trường có độ acid thấp (pH = 4-4,5) Trong sản xuất sữa chua, việc cấy hỗn hợp hai loài vi khuẩn cho kết sinh acid lactic tốt sử dụng riêng lồi L bulgaricus có khả thuỷ phân casein thành số acid amin tạo điều kiện cho S thermophilus phát triển Quá trình sản xuất sữa chua ni cấy hỗn hợp hai lồi chia thành giai đoạn: - Giai đoạn 1: pH sữa thích hợp cho lồi Streptococcus hoạt động chiếm ưu đảm bảo cho trình lên men lactic bắt đầu Hoạt độ enzyme phân huỷ casein Lactobacillus kích thích phát triển Streptococcus, độ acid tăng lên - Giai đoạn 2: pH sữa thay đổi làm cho Streptococcus khó phát triển Lúc Lactobacillus chỗ vón cục sữa bắt đầu Sữa chua sản xuất từ sữa tươi tự nhiên sữa bột hoà tan với sữa tươi Sau trùng nhiệt độ 95oC, sữa làm lạnh đến nhiệt độ 42-46oC cấy hai loại vi khuẩn để thực trình lên men nhiệt độ 40-50oC thời gian 2-3h Để sản phẩm có độ chua nhẹ thơm, người ta sử dụng tế bào vi khuẩn Streptococcus giai đoạn trẻ mơi trường lên men có độ acid thấp Ngược lại, muốn sữa chua có độ acid cao cần sử dụng tế bào Streptococcus già sử dụng Lactobacillus 40 Hình 13: Sơ đồ quy trình sản xuất sữa chua 4.2.3.3 Công nghệ sản xuất phomat: Phomat sản phẩm lên men hay không lên men, loại sản phẩm chịu tác động trình lên men lactic chủ yếu từ thành phần casein sữa tạo thành dạng gel nước Phomat giữ lại hoàn toàn lượng chất béo ban đầu Ngoài sản phẩm cịn 41 chứa lactose dạng acid lactic tỷ lệ khác chất khoáng Sản xuất phomat gồm ba giai đoạn sau: Hình 14: Sơ đồ quy trình sản xuất phomat - Tạo gel casein hay gọi q trình đơng tụ sữa: Q trình xảy tác dụng đồng thời men dịch vị dày bê acid lactic sinh từ trình lên men lactose vi khuẩn Đơi hai dạng đông tụ chiếm ưu - Quá trình tách nước phần gel thực theo nhiều phương pháp khác tuỳ thuộc vào chất q trình đơng tụ - Q trình làm chín phomat nhờ hệ enzyme vi sinh vật Trong thực tế vi khuẩn lactic nấm mốc đượcc sử dụng công nghiệp sản xuất phomat nhiều Các loại vi khuẩn lactic thường sử d ụng sản xuất phomat như: Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus Lactobacillus helveticus Các chế phẩm nấm mốc thưòng sử dụng sản xuất phomat là: Penicillium candidum Penicillium glaucum 42 PHẦN III: MỘT SỐ CÂU HỎI VẬN DỤNG Câu 1:Trong trình sản xuất loại đồ uống chứa rượu bia, rượu vang, rượu Sake, rượu Whisky, rượu làm từ mía, rượu gạo… có điểm giống khác nhau? Đáp án: Trong trình sản xuất loại đồ uống chứa rượu bia, rượu vang, rượu Sake, rượu Whisky, rượu làm từ mía, rượu gạo… - Những điểm giống nhau: + Đều trình lên men nhờ hoạt động vi sinh vật (cho sản phẩm rượu) + Nguyên liệu sử dụng cho trình lên men đường glucose + Sản phẩm trình C2H5OH, tùy vào quy trình sản xuất, vi sinh vật thời gian mà trở thành loại rượu - Những điểm khác nhau: + Lấy đường glucose từ nguồn khác (trái chín, tinh bột, đường mía…), bia lấy tinh bột từ đại mạch + Các vi sinh vật sử dụng trình Câu 2:So sánh trình lên men ethylic lên men lactic Đáp án: - Giống nhau: + Đều trình lên men vi sinh vật thực + Chất hữu tham gia không phân giải hoàn toàn + Đều trải qua sản phẩm trung gian acid pyruvic - Khác nhau: 43 + Lên men lactic: thực vi khuẩn Acid pyruvic chất nhận điện tử cuối bị khử thành acid lactic + Lên men ethylic: thực nấm men Acid pyruvic bị loại CO2 để tạo thành acetaldehyde, chất đóng vai trị chất nhận điện tử cuối sau khử thành rượu ethylic Câu 3:Kỹ thuật muối dưa làm sữa chua ứng dụng q trình nào? Nhóm vi khuẩn thực trình này? Tại dưa muối lại bảo quản lâu? Đáp án: - Kỹ thuật muối dưa làm sữa chua ứng dụng trình lên men - Do nhóm vi khuẩn lactic thực - Dưa muối bảo quản lâu, acid lactic tiết với nồng độ muối cao kìm hãm sinh trưởng vi sinh vật khác nên bảo quản lâu Câu 4:Rượu vang không trùng cách dễ bị vi khuẩn lactic dị hình làm chua, khơng để lâu Hãy giải thích sao? Đáp án: Trong q trình lên men, rượu vang dễ bị nhiễm vi khuẩn lactic dị hình (Leuconostoc oenos) Nếu rượu vang khơng trùng cách, vi khuẩn rượu vang biến đổi phần dư glocose thành acid lactic, CO2, etanol, acid acetic… rượu vang có bọt bị chua Câu 5:Để sản xuất loại protein làm thức ăn chăn nuôi, người ta nuôi nấm men thùng với điều kiện: độ pH phù hợp, nhiệt độ thích hợp, đầy đủ chất dinh dưỡng thổi khí liên tục Sau ngày lấy ra, ly tâm, thu sinh khối, làm khơ đóng gói Đây có phải q trình lên men khơng? Vì sao? 44 Đáp án: - Do lên men trình hơ hấp kỵ khí, chất nhận điện tử cuối chất hữu Khi khơng có oxi, nấm men tiến hành lên men, tạo rượu ethylic - Trong trường hợp trên, có oxi (thổi khí) chúng sinh trưởng cho sinh khối mà khơng lên men Do q trình khơng phải lên men Câu 6:Đặt chủng Saccharomyces vào ống nghiệm vào 5ml dung dịch đường saccharose mol/lít Nếu để ống nghiệm pha loãng đường bịt kín vào tủ ấm 28-30oC 5-6 có tượng gì? Viết tóm tắt giai đoạn q trình Cịn để ống nghiệm máy lắc có cung cấp oxy vơ trùng sao? So sánh lượng tích lũy tế bào từ trình Đáp án: Nếu để ống nghiệm pha lỗng đường bịt kín vào tủ ấm có lên men rượu Vì Saccharomyces nấm men rượu, phân giải disaccharide thành glucose theo đường từ glucose theo EMP thành pyruvat, thành etanol Nếu để ống nghiệm máy lắc có cung cấp oxy vơ trùng có hơ hấp hiếu khí theo sơ đồ sau: Glucose → acid pyruvic → acetyl CoA → Kreb → CO2 Chuỗi vận chuyển điện tử → H2O Năng lượng hữu ích dạng ATP: - Lên men: ít, khoảng ATP/glucose - Hơ hấp: nhiều, khoảng 36-38 ATP/glucose Câu 7:Tại bánh phồng tơm phồng lên nhanh cho vào chảo mỡ nóng? Đáp án: Nguyên liệu làm bánh phồng tơm gồm tinh bột sắn, lịng trắng trứng gà, acid citric, đường kính, muối ăn, tơm, nấm men Saccharomyces cerevisiae Khi trộn hỗn hợp bột với nấm men, 45 ... trình lên men ứng dụng: Vi sinh vật thực nhiều trình lên men khác lên men ethylic, lên men lactic, lên men butyric… Tuy nhiên, khuôn khổ chuyên đề này, xin trình bày ứng dụng hai trình lên men. .. biến vi sinh vật lên men ethylic lên men lactic 4.1 Lên men ethylic: 4.1.1 Khái niệm: Rượu ethylic số sản phẩm lên men phổ biến gặp vi sinh vật Vi sinh vật sản sinh rượu ethylic chủ yếu nấm men, ... Trong phạm vi chuyên đề này, xin sâu vào trình lên men vi sinh vật ứng dụng trình lên men PHẦN II: NỘI DUNG I Khái niệm lên men: 1.1 Lên men gì? Sự lên men hiểu theo nghĩa rộng trình trao đổi chất,